Β-Arrestin2 Ligand Tarama için PRESTO-Tango Tetkik ini Kullanarak GPCR-Geniş Ölçekte İşe Alımın Paralel Sorgulaması

Presto-Tango platformu, insan genomundaki tüm koku almayan GPCR'lerin paralel ve eşzamanlı sorgulamasını yürütmek için geliştirilmiştir. Presto-Tango platformu paralel bir yaklaşımla tüm GPCR genom profilleme için tek açık kaynak kaynak, bir G protein bağımsız beta-arrestin işe alım testi kullanarak. İşlemcinin gösterdiği şey laboratuvarımda Araştırma Görevlisi Genevieve Laroche ve laboratuvarımda doktora adayı olan Manel Zighal olacak.

İşleme başlamadan önce 384 optik alt plakanın her kuyusuna mililitre poli-L-l-lizin çözeltisi başına 20 mikrolitre 20 mikrolitre ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında 30 dakika ile iki saat arasında kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, fazla poli-L-lizin kaldırmak ve her kuyuya antibiyotik antimikotik çözelti 40 mikrolitre eklemek için lavabo üzerinde plakaları flick. Daha sonra hücre tohumlama için gerekli olan plakaları 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve plakaların geri kalanını uzun süreli depolama için dört santigrat dereceye yerleştirin.

Birincil tarama için HTLA hücrelerini tohumlamak için, 150 milimetre hücre kültürlerini 10 mililitre PBS ile hafifçe durulayın ve kültürleri çanak başına %0,05 tripsin EDTA'nın altı mililitresi ile tedavi edin. Hücreler havuz ayırdığında hücre, eşit miktarda DMEM içeren 50 mililitrelik konik bir tüpte süspansiyonlar oluşturur. Ve santrifüj ile hücreleri toplamak.

DMEM konsantrasyonu mililitre başına beşinci hücrelere 2,2 kez 10 pelet yeniden askıya ve antibiyotik antimykotik çözelti kaldırmak için lavabo üzerinde plakaları flick. Kuru ve her kuyuiçine hücrelerin 45 mikrolitre tohum için plakaları dokunun. Sonra 37 derece santigrat ve% 45 karbondioksit bir gecede plakaları yerleştirin.

Transfeksiyon için 384 iyi DNA kaynak plaka hazırlamak için her plazmid ücretsiz DNA mililitre başına 50 nanogram dağıtmak gprc Tango ilgi 0.1X Tris-EDTA ilgi yapısı 96 iyi plaka her kuyu içine. 96 kuyu plakasının her kuyudan 10 mikrolitre DNA çözeltisini, gösterildiği gibi her durum için dört katına çıkarak 384 kuyulu DNA kaynak plakasının tek tek kuyularına elle aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra, DNA kaynak plakasının her kuyuya 0,313 molar kalsiyum klorür çözeltisinin 40 mikrolitresini aktarın ve her kuyunun içeriğini nazikçe karıştırın.

Nazik karıştırma ile 384 iyi DNA kaynak plakaher kuyuya 2x HEPES tampon 50 mikrolitre ekleyin. Bir dakika sonra 384 iyi DNA kaynak plakasından 10 mikrolitre DNA transfeksiyon karışımını tohumlu HTLA hücrelerinin her bir kuyusuna aktarın ve hücre kültürü ndeki hücreleri bir gecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün transfected hücre orta decant ve yavaş yavaş her iyi doğrudan hücrelere dokunmamaya dikkat ederek açlıktan orta 40 mikrolitre ekleyin.

Daha sonra hücre kültürü kuluçka plaka dönmeden önce, alternatif satıriçine üç kez konsantrasyon ilgi bileşik 20 mikrolitre bileşik olmadan alternatif satırlar için araç tampon 20 mikrolitre ekleyin. 16 ila 24 saat transfected hücre orta decant ve ışıktan korunan oda sıcaklığında beş ila 20 dakikalık kuluçka için her kuyuya taze hazırlanmış kızdırma reaktif 20 mikrolitre ekleyin. Daha sonra kuyu başına bir saniyelik bir entegrasyon süresi ile bir mikro plaka lüminesans sayacı üzerinde plakaları okuyun.

İkincil bir tarama için, altkültür 100 milimetrelik yemeklerde HTLA hücreleri beş kez 10 altı hücre toplam hücre yoğunluğu 11 milimetre tam orta çanak başına 24 saat boyunca 37 santigrat derece. Ertesi gün, 10 mikrogram GPCR ücretsiz DNA ile 500 mikrolitre Tris-EDTA kalsiyum klorür çözeltisi ile girdap ve ardından 500 mikrolitre HEPES tampon ilavesi ilave edildi. Güçlü sallayarak sonra, oda sıcaklığında bir dakika için çözüm kuluçka ve hemen hücrelerin üzerine akıllıca çözelti damla bir mililitre ekleyin.

Yavaşça eşit çökelti dağıtmak ve 24 saat boyunca 37 santigrat derece plaka yerleştirin kaya. Ertesi gün, floresan hücre görüntüleyicialtında transfeksiyon verimliliğini kontrol edin. %50'den büyük işlemler idealdir.

Hücreleri %0.05 tripsin EDTA'nın üç mililitresi ile ayırmadan önce transfeced hücreleri versene solüsyonu ile hafifçe durulayın. Santrifüj ile ayrışmış hücreleri toplamak ve dört kez 10 açlıktan orta konsantrasyon mililitre başına beşinci hücrelere pelet yeniden askıya. Daha sonra poli-L-lizin kodlu 384 iyi plaka her kuyuiçine hücrelerin 45 mikrolitre tohum ve en az dört saat boyunca hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin.

Yarım günlük doz eğrisi yanıt plakası hazırlamak için 270 mikrolitre HBSS hepes ve antibiyotik antimikotik ile tüm ama 96 iyi plaka son satırı na eklenmiş ve her yüksek ve düşük ilaç çözeltisi eklemek her yüksek ve düşük ilaç çözeltisi eklemek her yüksek ve düşük ilaç çözeltisi eklemek her yüksek ve düşük ilaç çözeltisi ekleyin sıra H.Transfer her kuyudan satır H her kuyudan karıştırma ile satır G karşılık gelen kuyuiçine çözüm ve seri karıştırma ile ilaç bileşikleri seyreltmeye devam ulaşılır. Şemayı referans olarak kullanarak, A ile G satırlarından 96 kuyu plakasının 20 mikrolitrelik düşük sütun seyreltmelerini ve yüksek sütun seyreltmelerinin 20 mikrolitresini, daha önce oturmuş 384 kuyu plakasının H'si ile B kuyularına karıştırın. Sonra en az 16 saat boyunca 37 santigrat derecede plaka kuluçka.

16 ila 24 saat transfected hücre orta decant ve iyi başına bir entegrasyon süresi ile bir mikro plaka lüminesans sayacı üzerinde plakaları okumadan önce beş ila 20 dakikalık kuluçka için her kuyuya kızdırma reaktif 20 mikrolitre ekleyin. Bu temsili deneyde, birincil taramada sorgulanan 168 GPCR'den sadece dopamin reseptörü D3 ve opsin 5 potansiyel aktif hedef olarak rakipti. Dopamin reseptörü D3 4.7'nin 2.7'lik önemli bir log2 kat değişimini, opsin 5'in ise 2.39'luk biraz daha düşük bir yanıt üretti.

Karşılaştırma, dopamin reseptörü D2, birincil ekran için pozitif kontrol 4.58 bir log2 kat değişim üretti. Sekonder taramadan alınan bu tepki eğrileri, kromatin granül ekstresinin, dopamin reseptörü D3'te aktif bir vuruş olarak geçerliliğini doğrulayan, yarı maksimal etkili konsantrasyon değerlerinde benzer sinyal pencereleri ürettiğini göstermiştir. Negatif kontrol benzer düz bir doz eğrisi opsin için üretildi 5 Ancak kromatin granül ekstresi için olası bir hedef olarak bu reseptör ümidin. Presto-Tango hücre dağılımında variabilities olarak özel bakım gerektirir, transfection verimliliği ve seri ilaç seyreltme bileşik hata neden olabilir, hangi verilerin doğruluğunu etkileyebilir.

Radyoligand-bağlayıcı yaklaşımlar, Bioluminesans Rezonans Enerji Transferi ve Döngüsel AMP kalsiyum ve içselleştirme fonksiyonel tahlilleri gibi ortogonal yöntemler ligand reseptör etkileşimlerini daha fazla doğrulamak ve karakterize etmek için kullanılabilir.