Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Bu protokol, farelerde miyokard enfarktüsü sonrası modRNA kullanarak ilgi genini geçici olarak düzenlemenin basit ve tutarlı bir yolunu sunar.

Modifiye RNA kalbe gen transferi için yeni bir yöntemdir, ve diğer organlar. Bu protokol, istenilen genlerin kalbe geçici olarak, miyokard enfarktüsü sonrası ile doğru bir şekilde sunulmasını sağlayacaktır. Bu yöntem sadece miyokard enfarktüsü ile sınırlı değildir, ancak iskemi reperfüzyonu ve enine aort daralması modellerine de uygulanabilir.

Modifiye RNA çeşitli insan klinik çalışmalarda kullanılmaktadır. Ancak bu yöntemle kalbe aktarılan gen için standart bir protokol yoktur. Görsel gösteri, araştırmacıların değiştirilmiş RNA'yı kalpteki uygun bölgelere doğru şekilde enjekte etmelerini sağlayacaktır.

İşi gösteren şey, doktora sonrası araştırmacı Ajit Magadum ve laboratuvarımızdan hayvan danışmanı Elena Chepurko olacak. Daha önce modRNA'da hazırlanan konsantrasyonuna bağlı olarak, 100 mikrogram enjeksiyon için gerekli modRNA hacmini hesaplayın. Eşit hacimlerde sakaroz ve sitrat çözeltisi yapar.

Sonra modRNA hesaplanan hacmi ekleyin, ve 60 mikrolitre enjeksiyon hacmi getirmek için yeterli tuzlu çözeltisi. Hayvanı anestezi ettikten sonra, ağzı deneyciye bakacak şekilde ventral tarafını yukarı yaslayın. Sonra intratrakeal entübasyon gerçekleştirerek açık bir hava yolu korumak için, yavaşça dil çekin.

Entübasyon yolunu düzeltmek için boynun açısını ayarlayın ve entübasyon kanülini itin. Her iki akciğerin de oksijen aldığını doğrulamak için farenin torasik hareketini gözlemleyin. Solunum hızı dakikada yaklaşık 120 nefes olmalıdır.

LAD ligasyonuna başlamak için fareyi dikkatlice sağ tarafına çevirin. cildi kaldırın ve üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasında sol taraflı torakotomi yapın. Herhangi bir keskin nesnelerle akciğerlere dokunmadan, thorax dikkatle açın.

Kalbin net bir görünüm sağlayan, göğüs boşluğu açık tutmak için kesi içine retractors yerleştirin. Daha sonra, kesi kenarına akciğerleri hareket ettirin ve kalbi kaplayan perikardiyal kese kısmını çıkarın. Dikkatle LAD tanımlamak, derin ışık kırmızı damar, pulmoner arter ve sol auricle arasında bulunan.

Proksimal LAD'i tek bir ipek dikişle bağdaştırın. Bir insülin şırınga kullanarak, kalbe modRNA çözeltisi toplam 60 mikrolitre teslim. Üç farklı yerde 20 mikrolitre kas içi enjekte edin.

Ligasyonun her iki tarafında bir site ve kalbin tepesinde bir site. Modifiye RNA'yı doğru bölgelere enjekte etmenin en iyi yolu, LAD'nin tıkanması sonrasında mikroskop altında dokunun renk değişimini gözlemlemektir. Ayrıca enjekte edildiğinde, dolaşımiçine kalp odaları ulaşmak için doku içine çok derin gitmeyin.

Torasik kesiyi katmanlar halinde kapatın. İlk kullanım kaburga adapte etmek için 6-0 ipek çalışan dikişoldu. Sonra cildi kapatmak için 5-0 ipek çalışan dikişler kullanın.

Kurtarma aşaması için, kanül çıkarın ve spontan nefes sağlar. Bilinci yerine gelene kadar hayvanı ısıtma yastığına yerleştirin. Hayvanı tamamen uyanık olana kadar başıboş bırakmayın.

Ameliyat sonrası ağrıyı yönetmek için, üç gün boyunca 12 saat aralıklarla buprenorfin ienjekte edin. Vücut ağırlığının kilogramı başına 0.1 miligram lık bir dozda. CFW farelerde LAD ligasyonu ve luciferase modRNA enjeksiyonundan 24 saat sonra, transfeksiyon biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak luciferase protein ekspresyonunun kontrol edilerek doğrulandı.

Luciferase sinyali, kontrol farelerini karşılaştıran görüntülerde, luciferase modRNA enjekte edilen farelerle net bir şekilde tespit edilebilir. Luciferase sinyalinin sayısallaştırılması, tedavi edilen farelerde kontrol edilen farelere göre anlamlı olarak daha yüksek protein ekspresyonu gösterir. Cre modRNA ekspresyonu transgenik ROSA26 mTmG farelerde çevirisi ve biyo dağılımı kontrol edilerek doğrulandı.

Ameliyat tan ve kre modRNA enjeksiyonundan 24 saat sonra, kardiyomiyosit belirteci, kardiyak troponin I ve nükleus belirteci DAPI ile immünboyama için sanat lar düzeltildi ve işlendi. Başarılı kre ekspresyonu yeşil renkli kardiyomiyositlerin görünümü nedeniyle belirgindi. Birleştirilmiş bir görüntü iki görünür enjeksiyon siteleri etrafında cre aktif hücreleri gösterir.

Mavi nükleer leke DAPI olduğunu. Modifiye RNA platformu çeşitli organlarda tek bir gen veya gen kombinasyonları sunabilir. Ve böylece terapötik amaçlar için kullanılabilir, genetik bozuklukların düzeltilmesi gibi, ya da vücutta yararlı mekanizmaları aktive.

Modifiye RNA'nın benzersiz farmakokinetiği, enjeksiyondan hemen sonra gen fonksiyonunu değerlendirmemizi sağlar. Bu, araştırmacının enfarktüsün ilk birkaç saatinde değiştirilen sinyal yollarını hedeflemesini sağlar.