Name: Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Keşfedin modifiye mRNA ile fare kalbinde gen teslimi yöntemini. Miyokard enfarktüsü sonrası geçici gen ifadesi sağlayan bu standart protokol, kardiyak araştırmalarda yenilikçi gen terapisi uygulamaları için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Ann Anu Kurian'ı bu el yazmasına yardımlarından dolayı kabul ediyorlar. Bu çalışma Zangi laboratuvarına verilen kardiyoloji başlangıç hibesi ve ayrıca NIH hibe R01 HL142768-01 tarafından finanse edilmiştir.

Burada özetlenen tüm hayvan prosedürleri Mount Sinai Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi'nde Icahn Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır.
1. modRNA sentezi
NOT: ModRNA sentezinin ayrıntıları Kondrat ve ark.13'tebulunabilir.
<ol><li>Plazmid şablonlarını(Malzeme Tablosu)sipariş edin ve mRNA şablonu olarak kullanmak üzere temiz bir PCR ürünü oluşturun.</li>
	<li>Aşağıdakiözelleştirilmiş ribonükleoside karışımı ile transkripsiyon in vitro ile modRNA'ları hazırlayın (Malzeme Tablosu): T7 transkripsiyon kiti, 6 mM anti-ters kapak analogu (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanozin trifosfat, 75 mM adenozin trifosfat, 75 mM sitidin trifosfat, 100 mM psödoürin-5-trifosfat ve T7 DNase enzimi.</li>
	<li>Bir transkripsiyon temizleme kiti(Malzeme Tablosu)ile adım 1.2 yapılan modRNA arındırın ve antarktika fosfataz ile tedavi. Daha sonra, transkripsiyon temizleme kiti ile modRNA repurify ve bir spektrofotometre kullanarak ölçmek.</li>
	<li>ModRNA'yı 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA'da etanol ve amonyum asetat ile çökeltin ve resuspend.</li>
	<li>Santrifüj filtreler ile in vivo teslimat için modRNA konsantre ve otomatik bir elektroforez platformu(Tablo Malzemeler)kullanarak kalite ölçmek.</li>
</ol>2. In vivo doğum için modRNA enjeksiyonu hazırlanması
<ol><li>100 μg luciferase (Luc)/Cre modRNA enjeksiyonu için gereken hacmi modRNA konsantrasyonuna göre hesaplayın.</li>
	<li>ModRNA'nın hesaplanan hacmini çekirdeksiz suda hazırlanan eşit parçadaki sakaroz çözeltisi (0,3 g/mL) ve 0,1 M sitrat çözeltisi (pH = 7) (her biri önerilen 20 μL) ile karıştırın.</li>
	<li>Enjeksiyonun son hacmini tuzlu çözelti ekleyerek 60 μL'ye getirin.</li>
</ol>3. Miyokard enfarktüsü cerrahisi
<ol><li>Anestezi ve hayvanın hazırlanması NOT: Bu çalışmada 8−12 haftalık erkek ve dişi CFW fareler kullanBilen.<ol>
<li>Bir indüksiyon odası kullanarak% 2 izofluran ile fare anestezi ve anestezi tutmak için burun ve ağız üzerinde bir yüz maskesi ile sırt üstü hayvan yerleştirin. 7−8 mm hava yolu tüpü ve filtre ile donatılmış bir solunum cihazı kullanarak mekanik ventilasyon ile anesteziyi koruyun.</li>
		<li>Fareyi ameliyat platformunda hareketsiz hale getirmek için, kol ve bacaklarını cerrahi bantla sabitleyin. boyun bölgesini ve göğüs kafesinin sol tarafını tıraş edin ve %70 etanol ve povison iyot kullanarak dezenfekte edin. Dezenfekte adımını iki kez tekrarlayın. Anestezi nin derinliğini değerlendirmek için kuyruk ve arka ayakları çimdikleme, refleksleri kontrol edin.</li>
		<li>Normothermia 'da (37.5−38 °C) çekirdek vücut sıcaklığını sürekli olarak izleyin ve koruyun.</li>
		<li>İntratrakeal entübasyon gerçekleştirerek açık hava yolunu koruyun. Bunu yapmak için fareyi, ağzı deneyciye bakacak şekilde ventral bir konuma yerleştirin ve dili yavaşça çekin. Boyun açısını ayarlayın ve entübasyon yolunu düzleştirmek ve entübasyon kanülitine itin.</li>
		<li>Hayvanın içinden nefes alamaması durumunda trakeostomi yapılabilir. Bir mikroskop kullanarak trakea özetleyen deri, kas ve doku izole orta hat boyunca bir servikal kesi gerçekleştirin. Trakea açıkça görülebildiğinde, küçük bir delik açarak ve mikrocerrahi forceps kullanarak trakeanın kranial kısmını tutarak glottisin altındaki iki kartuş halkası arasındaki dokuya endotrakeal tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Her iki akciğerin de oksijen aldığını doğrulamak için farenin torasik hareketini gözlemleyin. Solunum hızı (RR) dakikada yaklaşık 120 nefes, 17−18 cm H2O inspiratuar basınç ile olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sol anterior inen (LAD) arter ligasyonu<ol>
<li>LAD ligasyonunu gerçekleştirmek için fareyi dikkatlice çevirin, böylece sağ tarafında durun. Cildi kaldırın ve 3 ve 4 kaburga arasında sol taraflı torakotomi yapmak ve dikkatle doku ve kas incelemek. Kanamayı önlemek için bir cautery kullanın.</li>
		<li>Thorax dikkatle açın ve bir kez açık, herhangi bir keskin nesne ile akciğer dokunmadan, kalp bulmak. Torasik boşluğu açık tutmak ve kalbi net bir şekilde görmek için retraktörleri kesiye yerleştirin. Şimdi kesi kenarına akciğerleri hareket ettirin ve kalbin ön yüzeyine erişmek için kalbi kaplayan perikardiyal kese parçası çıkarın.</li>
		<li>Dikkatle lad tanımlamak, pulmoner arter ve sol auricle arasında bulunan derin ışık kırmızı damar olarak görülebilir. 7-0 ipek dikiş tek bir dikiş ile LAD proksimal ligate. 4 ve 5 kaburga arasında bir göğüs tüpü (28 G, venal kateter) yerleştirin.</li>
		<li>Torasik kesiyi katmanlar halinde kapatın. Kaburga adapte ve cilt kapatmak için 5-0 ipek çalışan dikişler kullanmak için 6-0 ipek çalışan dikişler kullanın. Gelecekteki ekokardiyografik ölçüm için uygun bir pencere bıraktığından emin olun.</li>
		<li>2 mL şırınga kullanarak toraksı ılık izotonik solüsyonla (1 L suda 9 g sodyum klorür) dikkatlice boşaltın. Fareyi sırtına yerleştirin. Trakeostomi yapıyorsanız, endotrakeal tüpü dışarı alın ve 7-0 ipek dikişler kullanarak tek bir dikiş ile trakeal kartuş halkaları adapte. Fare nin üzerine yüz maskesi yerleştirin ve 5-0 ipek çalışan dikişler kullanarak cildi kapatın.</li>
		<li>Kurtarma aşaması için entübasyon kanüllerini ventilatörden kesin ve spontan solunuma izin verin. Hayvanı, bilinçliliğe erişene kadar ısı lambasının altına yerleştirin. Tamamen uyanık olana kadar hayvanı ameliyattan sonra başıboş bırakmayın.</li>
		<li>0.1 mg/kg vücut ağırlığında buprenophine ile ağrı tedavisi yönetin, 12 saat aralıklarla önümüzdeki 3 gün boyunca deri altı enjekte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ModRNA kardiyak doğum
<ol><li>Mi'den sonra insülin şırıngası (31 G) kullanarak 2.3 adımda hazırlanan modRNA'nın toplam 60 μL'sini insülin şırıngası (31 G) ile türün.<ol>
<li>Enfarkt alanı çevreleyen kalp kasının üç farklı yerinde modRNA 20 μL enjekte (ligasyon her iki tarafında iki ve apeks bir). Göğüs kapatmadan önce, LAD hemen sonra enjeksiyonları gerçekleştirin. NOT: ModRNA enjeksiyon bölgelerinin temsili görüntüleri Şekil 1'degörülebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Kalp sonrası MI protein ifade doğrulaması
<ol><li>Biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanarak Luciferase modRNA ekspresyonu NOT: Sakaroz sitrat tamponunun 60 μL'sinde hazırlanan toplam 100 μg Luc mRNA MI'den sonra CFW farelerin kalbine doğrudan enjekte edilir.<ol>
<li>24 saat mi sonrası ve modRNA enjeksiyon, bir indüksiyon odası kullanarak% 2 isofluran ile fareler anestezi ve intraperitoneally luciferin enjekte (150 mg / g vücut ağırlığı) in vivo Luc sinyalini doğrulamak için.</li>
		<li>Luc sinyali doygunluğa ulaşana kadar her 2 dakikada bir biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanan fareleri görüntüleyin.</li>
		<li>Toplanan görüntüleme verilerini görüntüleme analiz yazılımı ile ölçün. Sadece Luc ifadesi için temel okuma olarak tuzlu su enjekte fareler kullanın ve tuzlu enjekte fareler toplanan arka plan sinyali çıkarmak. NOT: Luc sinyali p/s/cm2/sr x 106olarak ifade edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cre transfeksiyon doğrulaması için immünoboyama<ol>
<li>Cre ile transfeksiyonu doğrulamak için, 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyon uyarak 24 saat postenjeksiyon sonrası hayvanları kurban edin ve ardından servikal çıkığı takip edin. Bir kesi yapmadan önce, % 70 alkol bezi kullanarak göğüs ve karın dezenfekte.</li>
		<li>Göğüs kafesinden ~1 cm daha aşağıda enine bir kesi yaparak göğüs boşluğunu açın ve makası kafaya doğru hareket ettirin ve göğüs kafesini kesin.</li>
		<li>Göğsü açın ve fazla kanı çıkarmak için sağ ventrikül odasına 1 mL steril PBS enjekte edin. Kalbi hemen boşaltın ve kalan kanı temizlemek için steril PBS'ye yerleştirin.</li>
		<li>Kalbi 24 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile düzeltin ve ardından 4 °C'de %30 sakaroz çözeltisinde gece kuluçkaya yatırın. Ertesi gün kalpleri optimum kesme sıcaklığına yerleştirin ve bir kriyostat kullanarak 10 μm kalınlığında kesin.</li>
		<li>Kardiyak troponin I (cTNI) karşı primer antikor ile kesitleri lekeleyin ve floresan sekonder antikor ile etiketleyin. Çekirdeği tanımlamak için, 5 dk. Floresan mikroskop kullanarak slaytları görüntüle 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile leke.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. İstatistiksel analiz
<ol><li>Tuzlu ve Luc enjekte edilmiş farelerdeki Luc ifadesine dayalı bir çubuk grafiği çizin ve değerleri ortalama ± SEM olarak bildirin. İki grubu eşleşmemiş bir t-testi (****p < 0,0001) kullanarak karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol><li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li>
<li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+Immune+Response+to+AAV%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341(2013).</li>
<li>Diebold, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+agonists+for+Toll-like+receptor+7+are+defined+by+the+presence+of+uridine+ribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides.</a> European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).</li>
<li>Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Based+Protein+Replacement+Therapy+for+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li>
<li>Hadas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Modified+mRNA+In+Vitro+Synthesis+Protocol+for+Heart+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy.</a> Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Cardiac+Delivery+of+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).</li>
<li>Zangi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Carlsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+VEGF-A+mRNA+Improves+Cardiac+Function+after+Intracardiac+Injection+1+Week+Post-myocardial+Infarction+in+Swine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine.</a> Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).</li>
<li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li>
<li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li>
<li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li>
<li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Gen tedavisi önemli ölçüde kalp hastalığının tedavisi ilerlemek için büyük bir potansiyel göstermiştir. Ancak, HF tedavisi için ilk klinik çalışmalarda kullanılan geleneksel araçlar sınırlı başarı göstermiştir ve ciddi yan etkileri ile ilişkilidir. Modifiye RNA sürekli kalpte bir gen transfer aracı olarak popülerlik kazanıyor bir nonviral gen teslim sunuyor. ModRNA çeviri için genlerin hiçbir nükleer lokalizasyon gerektirir, ve böylece protein verimli ve hızlı bir ifade sunuyor. Ayrıca, mRNA genom konak entegre olmadığı ...

Gen tedavisi, insan hastalıklarının tedavisi, tedavisi veya önlenmesi için nükleik asitlerin teslimini içeren güçlü bir araçtır. Kalp hastalığı için tanı ve tedavi yaklaşımlarında kaydedilen ilerlemeye rağmen, miyokard enfarktüsü (MI) ve kalp yetmezliği (HF) genlerin tesliminde sınırlı başarı olmuştur. Gen terapisi süreci ne kadar basit görünse de, belirli bir teslimat aracını kullanmadan önce optimize edilmesi gereken birçok faktörü göz önünde bulundurarak oldukça karmaşık bir yaklaşımdır. Doğru teslim vektörü insan vücudunda immünojenik olmayan, verimli ve kararlı olmalıdır. Bu alandaki çalışmalar iki tür dağıtım sistemi oluşturmuştur: viral veya viral olmayan. Adenovirüs, retrovirüs, lentivirüs veya adeno ilişkili virüs tarafından gen transferi de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan viral sistemler, olağanüstü transdüksiyon kapasitesi göstermiştir. Ancak, kliniklerde kullanımları nedeniyle güçlü bağışıklık yanıtı indüklenensınırlıdır 1, tümörigenez riski2, veya nötralize antikorların varlığı3, tüm bunlar insan gen tedavisinde viral vektörlerin geniş ve etkili uygulanması için önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Öte yandan, onların etkileyici ifade desen rağmen, çıplak plazmid DNA teslim düşük transfksiyon verimliliği görüntüler, mRNA transferi RNase tarafından bozulmaya yüksek immünjenite ve duyarlılık sunarken4.
mRNA alanında kapsamlı bir araştırma ile, modRNA gelenekselvektörler5 üzerinde sayısız avantajları nedeniyle kalp ve çeşitli diğer organlara genlerin teslimi için cazip bir araç haline gelmiştir. Doğal olarak meydana gelen psödoürin ile idrar tam değiştirilmesi daha sağlam ve geçici protein ekspresyonu sonuçları, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ve genomik entegrasyon riski minimal indüksiyon ile6. Son zamanlarda kurulan protokoller, sentetik mRNA7'ninstabilitesini ve transability'sini artırarak protein çevirisini daha da artıran optimize edilmiş bir anti-ters kapak analogu (ARCA) kullanmaktadır.
Önceki raporlar çeşitli muhabir veya fonksiyonel genlerin ifade göstermiştir mi sonra kemirgen miyokardinde modRNA tarafından teslim. ModRNA uygulamaları ile, kardiyomiyositler ve nonkardiyomiyositler de dahil olmak üzere miyokardiyumun önemli alanları, anjiyogenez9,10,kardiyak hücre sağkalım11ve kardiyomiyosit proliferasyonu12neden olmak için başarıyla post-kardiyak yaralanma8 transfected edilmiştir. Mutasyona uğramış insan follistatin benzeri 1 için kodlanmış modRNA tek bir uygulama fare yetişkin CMs çoğalmasını indükler ve önemli ölçüde kardiyak fonksiyonu artırır, skar boyutunu azaltır, ve kılcal damar yoğunluğunu artırır 4 hafta post-MI12. Daha yeni bir çalışmada bir domuz modeli nde VEGFA modRNA uygulaması ile MI sonra geliştirilmiş kardiyak fonksiyon bildirdi10.
Bu nedenle, kardiyak alanda modRNA artan popülaritesi ile, geliştirmek ve kalp sonrası MI modRNA teslimi için bir protokol optimize etmek esastır. Burada herhangi bir bağışıklık yanıtı uyarıcı olmadan sağlam, istikrarlı protein ifadesi sağlayan bir biyouyumlu sitrat-salin formülasyonu saf ve optimize modRNA hazırlanması ve teslim açıklayan bir protokoldür. Bu protokol ve videoda gösterilen yöntem, sol anterior inen arterin (LAD) kalıcı ligasyonu ile fare MI'nin standart cerrahi işlemini ve ardından üç adet modRNA intrakardiyak enjeksiyonunu göstermektedir. Bu makalenin amacı, modRNA uygulamasını kardiyak gen tedavisi için yaygın olarak erişilebilir hale getirmek için minnet miyokardiyumuna modRNA teslimatının son derece doğru ve tekrarlanabilir bir yöntemini açıkça tanımlamaktır.

<table><tbody><tr><td>Adenozin trifosfat</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Megascript kitine dahildir</td></tr><tr><td>Antarktika Fosfataz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ters kapaklı analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-7003</td><td></td></tr><tr><td>Biyolüminesans görüntüleme sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>IVIS100 şarj bağlantılı cihaz görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Künt ekartörler</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Kardiyak tropnin I</td><td>Abcam</td><td>47003</td><td></td></tr><tr><td>Sitidin trifosfat</td><td>İnvitrojen</td><td>AMB13345</td><td>Megascript kitine dahildir</td></tr><tr><td>Çift Anestezi</td><td>Sistemi Harvard Aparatı</td><td>75-2001</td><td></td></tr><tr><td>Forseps- Adson</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Forseps- Dumont #</td>7 <td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Guanozin trifosfat</td><td>İnvitrojen</td><td>AMB13345</td><td>Megascript kitine dahildir</td></tr><tr><td>İn vitro transkripsiyon kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>5X MEGAscript T7 Kiti</td></tr><tr><td>Entübasyon kanülü</td><td>Harvard Aparatı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaclear kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare vantilatörü</td><td>Harvard Aparatı</td><td>73-4279</td><td></td></tr><tr><td>N1-metilpsödouridin-5-trifosfat</td><td>TriLink Biyoteknoloji</td><td>N-1081</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektrometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olsen hegar dikiş makaslı iğne tutucu</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid şablonları</td><td>GeneArt, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keskin Uçlu Diseksiyon Makası</td><td>FST</td><td>14200-12</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sütürler</td><td>Ethicon</td><td>Y433H</td><td>5.00</td></tr><tr><td>Sütürler</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6.00</td></tr><tr><td>Sütürler</td><td>Ethicon</td><td>7733G</td><td>7.00</td></tr><tr><td>T7 DNaz enzimi</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Megascript kitine dahildir</td></tr><tr><td>Bant istasyonu</td><td>Aligent</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Transkripsiyon temizleme kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908</td><td>Megaclear</td></tr><tr><td>Ultra-4 santrifüj filtreler 10k</td><td>Amicon</td><td>UFC801096</td><td></td></tr></tbody></table>

miyokard enfarktüsü fare modelinde modifiye mrna teslimi

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Miyokard enfarktüsü (MI) Batı dünyasında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir. Son on yılda, gen tedavisi kalp hastalığı için umut verici bir tedavi seçeneği haline gelmiştir, verimliliği ve olağanüstü terapötik etkileri nedeniyle. MI sonrası hasarlı dokuyu onarmak için yapılan çeşitli çalışmalarda DNA tabanlı veya viral gen terapisi uygulandı, ancak teslim edilen genlerin, ödemin, aritminin ve kardiyak hipertrofisin zayıf ve kontrolsüz ekspresyonu nedeniyle önemli engellerle karşı karşıya kaldılar. Sentetik modifiye mRNA (modRNA), genomik entegrasyon riski olmaksızın kalp dokusuna yüksek, geçici, güvenli, immünojenik olmayan ve kontrollü mRNA iletimi sunan yeni bir gen terapisi yaklaşımı sunar. Kalpteki çan şekilli farmakokinetiği ile birleşen bu dikkat çekici özellikleri nedeniyle, modRNA kalp hastalığının tedavisinde cazip bir yaklaşım haline gelmiştir. Ancak, in vivo etkinliğini artırmak için, tutarlı ve güvenilir bir teslimat yöntemi takip edilmesi gerekir. Bu nedenle, in vivo uygulamaları için modRNA kullanımımodRNA kullanımda modRNA teslim verimliliğini ve verim tutarlılığını en üst düzeye çıkarmak için, bir fare MI modelinde modRNA intrakardiyak enjeksiyonun hazırlanması ve tesliminde optimize edilmiş bir yöntem sunulmuştur. Bu protokol, modRNA teslimatını temel ve çevirisel araştırmalar için daha erişilebilir hale getirecektir.

Sekiz ila on haftalık fareler isoflurane ile anestezi ve entübe edildi. Hayvan anestezi altında kaldıktan sonra sol torasik bölge tıraş edildi ve etanol ile sterilize edildi ve kalp LAD ligasyonu için maruz kaldı. Sol koroner arter sıkıca arter altında dikiş düğümleme tarafından tıkanmış oldu (diyagram gösterimi Şekil 1A). Başarılı bir enfarktüsten sonra (sol ventrikül serbest duvarının paling ile gösterilir), sakaroz sitrat tamponunda çözünmüş 100 μg Luc veya Cre modRNA doğrudan enjeksiyonu...

Bu protokol, farelerde miyokard enfarktüsü sonrası modRNA kullanarak ilgi genini geçici olarak düzenlemenin basit ve tutarlı bir yolunu sunar.

Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Modifiye RNA kalbe gen transferi için yeni bir yöntemdir, ve diğer organlar. Bu protokol, istenilen genlerin kalbe geçici olarak, miyokard enfarktüsü sonrası ile doğru bir şekilde sunulmasını sağlayacaktır. Bu yöntem sadece miyokard enfarktüsü ile sınırlı değildir, ancak iskemi reperfüzyonu ve enine aort daralması modellerine de uygulanabilir.Modifiye RNA çeşitli insan klinik çalışmalarda kullanılmaktadır. Ancak bu yöntemle kalbe aktarılan gen için standart bir protokol yoktur. Görsel gösteri, araştırmacıların değiştirilmiş RNA'yı kalpteki uygun bölgelere doğru şekilde enjekte etmelerini sağlayacaktır.İşi gösteren şey, doktora sonrası araştırmacı Ajit Magadum ve laboratuvarımızdan hayvan danışmanı Elena Chepurko olacak. Daha önce modRNA'da hazırlanan konsantrasyonuna bağlı olarak, 100 mikrogram enjeksiyon için gerekli modRNA hacmini hesaplayın. Eşit hacimlerde sakaroz ve sitrat çözeltisi yapar.Sonra modRNA hesaplanan hacmi ekleyin, ve 60 mikrolitre enjeksiyon hacmi getirmek için yeterli tuzlu çözeltisi. Hayvanı anestezi ettikten sonra, ağzı deneyciye bakacak şekilde ventral tarafını yukarı yaslayın. Sonra intratrakeal entübasyon gerçekleştirerek açık bir hava yolu korumak için, yav

delivery-of-modified-mrna-in-a-myocardial-infarction-mouse-model

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Çok sayıda genetik manipülasyonlar ve / veya genler, proteinler, hücre ve / veya biyomalzemeler intramiyokardiyal enjeksiyonu, akut iskemi / reperfüzyon hasarı ve farelerde kronik remodeling çalışmaları zaman boyutu üzerine bindirilmiş. Bu video iskemi / reperfüzyon için mikrocerrahi prosedürleri, kalıcı koroner arter ligasyonu ve intramiyokardiyal enjeksiyon çalışmaları göstermektedir.

Enfarktüsü bir murin Model Koroner Arter ligasyon ve intramiyokardiyal Enjeksiyon

Farelerde Deneysel miyokardiyal enfarktüs indüklemek için kullanılan cerrahi prosedür kalp ve akciğer sol ön yüzeyine görselleştirmek için üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasındaki sol torakotomi ile başlar. Sol koroner arter ligasyonu olduğu, göğüs kapalı ve fare kendiliğinden kurtarmak için izin verilir.

Fare Koroner Arter Ligasyonu için Modifiye Tekniği

Biz tekrar elde edilebilirliğini arttırmak için, sol ön inen arter (LAD) üzerine ligasyon konumlandırma daha fazla netlik sağlar fare modellerinde miyokard infarktüsü (MI) simüle etmek için deneysel iskemi / reperfüzyon (I / R) hasarı ikna etmek için bir cerrahi yöntemi tanıtmak Farelerde MI deneyler.

Sol ön inen arter ligasyonu ile Miyokard İskemi-reperfüzyon Hasarı bir fare modeli

Ekokardiyografi perkü- intramiyokardiyal enjeksiyon sıçangil kalp gen transfer ajanları veya hücre verilmesi için etkili, güvenilir ve hedeflenebilir yaklaşımı olmaktadır. Bu protokolde belirtilen adımları izleyerek, operatör hızla bu çok yönlü, minimal invaziv teknikle yetkin olabilir.

Farelerde ultrason eşliğinde transtorasik intramiyokardiyal Enjeksiyon

Minimal invaziv manipülasyonlara sahip farelerde miyokard enfarktüsü için yüksek oranda tekrarlanabilir bir model tanımlanmıştır. Model kolayca gerçekleştirilebilir, bu da yüksek tekrarlanabilirlik ve hayatta kalma oranı ile sonuçlanır. Bu nedenle, açıklanan model, 3R ilkesinin (Değiştirme, İyileştirme ve İndirgeme) talep ettiği gibi gerekli hayvan sayısını azaltacaktır.

Farelerde Miyokard İnfarktüsü Oluşturan Minimal İnvaziv Cerrahi Prosedür

Burada farelerde sol anterior inen koroner arterin kalıcı ligasyonunun nasıl elde edilebildiğini gösteren bir cerrahi prosedürü açıklıyoruz. Bu model miyokard enfarktüsü ve eşlik eden biyolojik süreçlerin patofizyolojisini araştırmak için yüksek öneme hemşilir.

Sol Anterior İnen Koroner Arterin Kalıcı Ligasyonu ile Murine Miyokard Enfarktüsü Modeli

Yeterli anestezi altında, fare kalbi interkostal boşluktan dışsallaştırıldı ve miyokard enfarktüsü, çoğu laboratuvarda kolayca bulunabilen malzemeler kullanılarak sol ön inen arteri (LAD) bağlayarak başarılı bir şekilde indüklendi.

Farelerde Miyokard Enfarktüsünün İndüksiyonu için Değiştirilmiş Basit Bir Yöntem

Burada, mikromanipülasyon yoluyla sol ön inen koroner arterin hassas ligasyonu ile farelerde miyokard enfarktüsü veya miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarını indükleyebilen basit ve tekrarlanabilir bir yöntem tanımlanmıştır.

Farelerde Miyokard Enfarktüsü ve Miyokard İskemi-Reperfüzyon Hasarının İndüksiyonu

Burada sunulan, farelerde sol koroner arterin kalıcı olarak bağlanması için cerrahi bir prosedürdür. Bu model, miyokard enfarktüsü sonrası patofizyolojiyi ve ilişkili inflamatuar yanıtı araştırmak için kullanılabilir.

Sol Koroner Arter Ligasyonu: Miyokard Enfarktüsünün Cerrahi Murin Modeli

Bu protokol, miyokard enfarktüsü sonrası kardiyak yeniden şekillenmede CRACD'nin rolünü incelemek amacıyla CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak bir C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) fare modelinin oluşturulmasını ve fenotipik karakterizasyonunu açıklamaktadır.

Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yeniden Şekillenme Çalışmaları İçin CRISPR/Cas9 ile Düzenlenmiş Cracd-Eksik Fare Modelinin Üretimi ve Fenotipik Karakterizasyonu

Keşfedin modifiye mRNA ile fare kalbinde gen teslimi yöntemini. Miyokard enfarktüsü sonrası geçici gen ifadesi sağlayan bu standart protokol, kardiyak araştırmalarda yenilikçi gen terapisi uygulamaları için kullanılabilir.

Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Daha fazla video keşfet