İmmünofluoresans Mikroskobu kullanılarak Parafin Gömülü Kedi Arteriyel Trombisinde Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Belirlenmesi

Isıya bağlı antijen alma ve çift immün etiketleme protokolü kullanarak formaldehit sabit ve parafin gömülü kedi kardiyojenik arteriyel trombisinde nötrofil ekstrasellüler tuzaklarını (NET) tanımlamak için bir yöntem tanımladık.

Parafinizasyon bu protokol parafinin gömülü aort kesitlerinin antijen alımı takip kedi trombozu nötrofilik trisellüler tuzakların rolünü incelemek için yararlı bir araç olabilir. Sabit ve parafin gömülü dokuda immünororesans tarafından nötrofilik trisellüler tuzakların saptanması, daha güvenli DNA ve ekstrasellüler proteinlerin eşzamanlı olarak algılanmasına olanak sağladığından HNE gibi konvansiyonel histolojik stentlerden üstündür. Bu protokol diğer trombüs türlerinde ve diğer veteriner türlerinde kullanılabilir.

Kedi arteriyel trombüs içinde nötrofil ekstrasellüler tuzakların belirlenmesi kedilerde trombozda rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Burada sunulan protokoller kurallardır. Araştırmacıları, tatmin edici bir sinyal vermek için antijen alma sürecinin süresini ve koşullarını ayarlamaya önem veririz.

Cam slaytlar üzerindeki bölümlerin deparafinizasyonunu ve yeniden hidrasyonunu gerçekleştirmek için otomatik bir sistem kullanmak için cam slaytları raflara yerleştirin. Üç dakika boyunca yüzde 100 tuzlu tamamen batırın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.

Adımlar arasında durulama yapmayın. Oda sıcaklığında üçer dakika boyunca üç kez etanol konsantrasyonlarını azaltarak tamamen batırın. İki dakika boyunca tamamen deiyonize suya batırın ve bir kez daha tekrarlayın.

TBST ile tedavi den sonra, 100 santigrat dereceye ısıtılan deiyonize su ile rezervuar doldurun. Vapur odasının 20 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin. Bir ısı plakası üzerinde, pH 9,0 ila 95 ila 97 santigrat derece Tris ve EDTA içeren ticari olarak kullanılabilir antijen alma çözeltisi ısıtın.

Kaynamadığından emin olun. Suberge tamamen ısıtmalı antijen alma çözeltisi slaytlar ve 20 dakika boyunca buharlı ile harici ısıtma uygulaması devam edin. Daha sonra, slaytları TBST ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Şimdi, bölümleri arabellek 1'i engellemeye yerleştirin. 30 ve 50 rpm arasında hafif sallanan altında oda sıcaklığında iki saat kuluçka. Yıkama olmadan, hemen doğrudan slayt üzerine seyreltilmiş tavşan poliklonal anti-insan sitülinated histon H3 antikor 100 mikrolitre uygulayın.

Antikor karışımının eşit şekilde dağıtılmasını sağlamak için her bölüme bir kapak fişi yerleştirin. 12 ila 16 saat boyunca 4 santigrat derecede hafif sallanan kuluçka. Bundan sonra, her seferinde beş dakika TBST ile slaytları üç kez yıkayın.

Antikor uygulamak için, bir pipet kullanın ve eşit Alexa Fluor 488 konjuge keçi anti-tavşan antikor 100 mikrolitre dağıtmak. Slaytları folyo ile kaplayın ve hafif sallanan altında oda sıcaklığında bir saat boyunca slaytları kuluçkaya yatırın. El yazmasına göre TBST ile yıkandıktan sonra, tampon engelleme bölümleri kuluçka 2 nazik sallanan altında dört derece santigrat gecede.

Işıktan koruyun. Her seferinde beş dakika tbst ile üç kez yıkayın. Daha önce oda sıcaklığında hafif sallanan altında iki saat boyunca yapılan tampon 3 engelleme bölümleri engelleyin.

Biotin laded ployclonal tavşan anti-insan nötrofil elastaz antikor ile dört derece Santigrat 12 ila 16 saat daha önce açıklandığı gibi bölümleri inkübün. TBST ile yıkandıktan sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate ile slaytlar inkübün. Bundan sonra, Beş dakika tbst ile bir kez yıkayın.

100 mikrolitre Autofluorescense Quenching çözeltisi karışımını üreticinin talimatıyla doğrudan bölümlere bir dakika uygulayın. Slaytları her seferinde 10 dakika boyunca altı kez TBST ile yıkayın. Karanlıkta beş dakika boyunca 300 nanomolar DAPI 100 mikrolitre ile her slayt kapağı.

Sonra TBST ile her seferinde üç dakika beş kez yıkayın. Bölümü çevreleyen cam kaydırakaya doğrudan bir damla antifade montaj ortamı uygulayın. Herhangi bir kabarcık oluşturmadan yavaşça bölümün üzerine bir kapak kayma yerleştirin.

Örneklerin bir gecede karanlıkta dört santigrat derecede tedavi etmesine izin verin. Trombüs bulmak için, 10x amacı ile faz kontrast mikroskopisi kullanarak aort bifurkasyon ve her femeral arter uzunluğu boyunca caudally için kafatasıtöbi tarasık. İlk olarak 357 ve 44 nanometrede uyarma ile DAPI kanalını kullanarak hücresiz DNA kesitlerini inceleyin.

Teksas kırmızı ve yeşil floresan protein kanallarında sırasıyla ekstrasellüler nötrofil elastaz ve sitülilofil histon H3 tanımlayın. Piksel yoğunluğunda doygunluğu önlemek için görüntülerin edinimi boyunca her kanalın tutarlı pozlama süresini ve kazançlarını koruyun. Nötrofil ekstrasellüler tuzakları nötrofil elastaz, sitilinated histon H3 ve hücreiçermeyen DNA'nın eş lokalizasyonuna dayalı olarak tanımlanır.

Hematoksilin ve eozin lekesi ve brightfield mikroskobu kullanılarak kedi artertrombini kırmızı kan hücreleri, lökositler, fibrin ve trombositlerden oluşur. NETs yakındaki eritrositler ve lökositler çevreleyen çeşitli uzunluklarda derin mor iplikağları olarak ortaya çıktı. Bu protokolü kullanarak, immünofloresan mikroskopisi hücre içermeyen DNA, ekstrasellüler sitülsinated histon H3 ve nötrofil elastaz oluşan NETs büyük agregalar ortaya.

İmmün mikroskopide faz kontrastı altında trombüs vasküler alan içinde iyi çizilmiş bir yapı olarak karakterize edildi. Ancak kontrol örneklerinin hiçbirinde trombüs saptanmadı. Bu şekil, 488 nanometre dalga boyunda görüntülendiğinde eritrositler gibi pıhtı elementlerinin derin otofloresence sini göstermektedir.

Immünlabelling sonrası kısa otofloresence söndürme önemli ölçüde eritrosit lerin bol olduğu bölgelerde bile protein ko-lokalizasyon ve NET algılama duyarlılığını artırdı. Fiksasyon süresi bazı antijenlerin immünreaktivitesini etkiler. Biz en fazla 24 saat par dehidratasyon ve parafin gömme için fiksasyon öneririz.

Alternatif olarak, metanol içermeyen paraformaldehit formaldehit oksidasyonu formik asit ve ketonlar tarafından artifakı sınırlamak için kullanılabilir. Aynı türden kaynaklanan birincil antikorları kullanırken paraziti önlemek için, ikincil antikorlar üzerinde kalan bağlayıcı bölgeleri doyuracak ek engelleme adımı da dahil ettik. Araştırmacılar, izotip antikorlarından oluşan negatif kontrolleri, primer antikorların dışlanmasını ve immün etiketleme adımını ve trombozsuz kedilerden biyolojik kontrolleri içermelidir.

Trombin doku sınırlarının otofloresence nötrofil ekstrasellüler tuzakların mikroskobik kimlik çekiç olabilir. Araştırmacı uzak kırmızı floroforlar kullanarak floresan en aza indirebilirsiniz. Bu teknik, diğer veteriner türlerinde nötrofil ekstrasellüler tuzakları çalışma için değerli bir araç olabilir.

Bu tromboz patofizyolojisi daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.