Name: Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Keşfedin buğday tanesi metabolomik analizi için hedefsiz sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi yöntemini. Üçüncü mobil faz kullanımı daha geniş metabolit tespiti sağlar ve tarımsal verim ile kalite yönetimine katkıda bulunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Batı Avustralya Premier Tarım ve Gıda Bursu programı (İş Bölümü, Turizm, Bilim ve Yenilik, Batı Avustralya Hükümeti) ve Premier Fellow, Profesör Simon Cook (Merkezi kabul etmek istiyorum Dijital Tarım, Curtin Üniversitesi ve Murdoch Üniversitesi). Saha denemeleri ve tahıl numunesi toplama, Batı Avustralya'nın Bölgeler için Telif Hakları programı hükümeti tarafından desteklendi. Grantley Stainer ve Robert French'i saha denemelerine katkılarından dolayı kabul ediyoruz. NCRIS tarafından finanse edilen Bioplatforms Avustralya ekipman finansmanı için kabul edilmektedir.

<ol><li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+metabolomics%3A+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li>
<li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype%2C+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+%28Triticum+durum+Desf.%29+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li>
<li>Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li>
<li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li>
<li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li>
<li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li>
<li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li>
<li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li>
<li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72(2018).</li>
<li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+4.0%3A+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li>
<li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li>
<li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li>
<li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, buğday tanesi nin analizi için LC-MS tabanlı hedeflenmemiş metabolomik bir yöntem salıyoruz. Yöntem, ters faz degradesine üçüncü bir mobil faz getirerek dört kazanım modunu (ters faz ve lipid-amenable ters faz ile pozitif ve negatif iyonizasyon) iki modda birleştirir. Birleşik yaklaşım, iyon polaritesi başına yaklaşık 500 biyolojik olarak ilgili özellik vermiştir ve bunların kabaca yarısı buğday çeşitleri arasındaki yoğunluk açısından önemli ölçüde farklılık göstermiş. Farklı buğday çeşitlerinin tanelerinde metab...

Tarımda genler, çevre ve yönetim uygulamaları arasındaki etkileşimlerin anlaşılması, ürün verimi ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetimine olanak sağlayabilir. Bitki metabolitleri genom, çevre (iklim, yağış vb.) gibi faktörlerden ve tarım ortamında, bitkilerin yönetilme şeklinden (örneğin, gübre, mantar ilacı vb.) etkilenir. Genomun aksine, metabolom tüm bu faktörlerden etkilenir ve bu nedenle metabolomik veriler bu etkileşimlerin belirli bir zamanda biyokimyasal parmak izini sağlar. Metabolomik temelli bir çalışmanın iki amacından biri vardır: birincisi, organizmanın biyokimyasını daha iyi anlamak ve fizyolojiye göre tedirginlik (abiyotik veya biyotik stres) yanıt mekanizmasını açıklamaya yardımcı olmak; ve ikincisi, biyobelirteçleri çalışma altındaki tedirginlikle ilişkilendirmek. Her iki durumda da, bu bilgiye sahip olmanın sonucu, geliştirilmiş verim büyüklüğü ve kalitesi hedefine ulaşmak için daha hassas bir yönetim stratejisidir.
Bitki metabolom çeşitli fizyokimyasal özelliklere sahip küçük moleküllerin binlerce1 içerdiği tahmin edilir. Şu anda, hiçbir metabolomik platformlar (ağırlıklı olarak kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi) tek bir analizde tüm metabolom yakalayabilir. Metabolomun tek bir analitik çalışma içinde mümkün olduğunca geniş bir kapsama alanı sağlayan bu tür tekniklerin (numune hazırlama, metabolit ekstraksiyonu ve analizi) geliştirilmesi, metabolomik araştırmacılar için önemli bir amaçtır. Buğday tanesinin önceki hedeflenmemiş metabolomik analizleri, birden fazla kromatografik ayrım ve edinim kutuplarından elde edilen verileri birleştirmiş ve/veya daha fazla metabolom kapsama alanı için enstrümantasyon almıştır. Ancak, bu örneklerin her modalite için ayrı ayrı hazırlanması ve elde edilmesi gerekmektedir. Örneğin, Beleggia ve ark.2 polar analitlerin GC-MS analizi için türev leştirilmiş bir örnek hazırladı. Das ve ark.3 analizlerinde kapsama alanını iyileştirmek için hem GC hem de LC-MS yöntemlerini kullanmaktadır; ancak, bu yaklaşım genellikle yukarıda açıklandığı gibi ayrı örnek hazırlıkları yanı sıra iki bağımsız analitik platformlar gerektirir. GC-MS2,3,3,4 ve LC-MS3kullanarakbuğday tanelerinin önceki analizleri,GC-MS için 50 ila 412 (55 tanımlı) özellik, kombine GC-MS ve LC-MS için 409 ve LC-MS lipidomik analizi için birkaç bin adet ilerler.5 Tek bir analiz de en az iki mod birleştirerek, genişletilmiş metabolom kapsama sağlanabilir, biyolojik yorumlama zenginliğini artırırken aynı zamanda hem zaman hem de maliyet tasarrufu sunan.
Tersine faz kromatografisi ile lipid türlerinin geniş bir yelpazede verimli ayrılmasına izin vermek için, modern lipidomics metodolojileri genellikle elüsülasyon solvent yüksek oranda izopropanol kullanın6, aksi takdirde kromatografi tarafından çözülmemiş olabilir lipid sınıfları için olanaklar sağlayan. Verimli bir lipid ayrıştırma için, başlangıç mobil faz da çok organik kompozisyondaha yüksektir 7 tipik ters faz kromatografik yöntemler, hangi moleküllerin diğer sınıfları dikkate. Degradenin başlangıcındaki yüksek organik bileşim, bu yöntemleri diğer moleküllerin sınıflarına daha az uygun hale getirir. En önemlisi, ters faz sıvı kromatografisi, çoğunlukla sulu bir bileşimle başlayan ve kromatografinin elüsyon mukavemeti arttıkça organik içerikte artan ikili bir çözücü degradesi kullanır. Bu amaçla, metabolitlerin hem lipid hem de lipid olmayan sınıflarının ayrılmasını tek bir analizde elde etmek için iki yaklaşımı birleştirmeye çalıştık.
Burada, üçüncü bir mobil faz kullanan ve tek bir örnek hazırlama ve bir analitik kolon kullanarak kombine geleneksel ters faz ve lipidomics-uygun kromatografi yöntemi sağlayan bir kromatografik yöntem salıyoruz. Daha önce ağırlıklı olarak klinik metabolomik çalışmalarda uygulanan kalite kontrol önlemleri ve veri filtreleme adımlarının çoğunu benimsedik. Bu yaklaşımlar, yüksek teknik tekrarlanabilirlik ve biyolojik önemi olan sağlam özellikleri belirlemede yararlıdır ve bu kriterleri karşılamayanları hariç tutar. Örneğin, havuzlu QC örnek8,QC düzeltme9,veri filtreleme9,10 ve eksik özellikleri nputasyon tekrar analizi açıklar11.

<table><tbody><tr><td>13C6-sorbitol</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>605514</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoantrasen</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>A38800-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA955-4</td><td>Optima LC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>Amonyum format</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>516961-100 mL</td><td>>99.995%</td></tr><tr><td>Analist TF</td><td>Sciex</td><td></td><td>Sürüm 1.7</td></tr><tr><td>AnalyzerPro yazılımı</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>Adım 7.2 için kullanılan veri işleme yazılımı. Sürüm 5.7</td></tr><tr><td>AnalyzerPro XD sortware</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>Adım 7.5 için kullanılan veri işleme yazılımı. Sürüm 1.4</td></tr><tr><td>Denge</td><td>Sartorius. Hassas Teraziler Pty. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d6-transsinnamik asit</td><td>Isotec</td><td>513962-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td><td>A2471-500 mL</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Dondurarak kurutucu (Freezone 2.5 Plus)</td><td>Labconco</td><td>7670031</td><td></td></tr><tr><td>Cam Schott şişeleri (100 mL, 500 mL, 1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam şişeler (2 mL) ve vidalı kapaklar (ön yarık)</td><td>Velocity Scientific Solutions</td><td>VSS-913 (şişeler), VSS-SC91191 (kapaklar)</td><td></td></tr><tr><td>Sciex TripleToF için kurulum kiti</td><td>Sciex</td><td>p/n 4456736</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA464-4</td><td>Optima LC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>Laboratuvar blenderi</td><td>Waring ticari</td><td></td><td>Model HGBTWTS3</td></tr><tr><td>Lösin-enkefalin</td><td>Suları</td><td>p/n 700008842</td><td>Tuning çözümü</td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/ MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td><td></td><td>Yüksek verimli metabolomikler için web tabanlı analitik boru hattı. Ücretsiz, web tabanlı bir araç. Sürüm 4.0.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA456-4</td><td>Optima LC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>Mikonazol</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>M3512-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj (Eppendorf 5415R)</td> <td>Eppendorf (Crown Scientific Pty. Ltd. tarafından dağıtılmıştır.)</td><td></td><td>5426 No. 0021716</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (2 mL)</td><td>SSIbio</td><td>1310-S0</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peak View yazılımı</td><td>Sciex</td><td></td><td>Sürüm 1.2 (64 bit)</td></tr><tr><td>Pipet uçları (200 uL, 100 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler (200 uL, 1000 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik santrifüj tüpleri (15 mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NUN339650</td><td></td></tr><tr><td>Progenesis QI</td><td>Doğrusal Olmayan Dinamik</td><td></td><td>Samll molekül keşif analiz yazılımı. Sürüm 2.3 (64 bit)</td></tr><tr><td>Sciex 5600 üçlü ToF kütle spektrometresi</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seramik boncuklu vidalı kapaklı lizis tüpleri (2 mL)</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum format</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>456020-25 g</td><td></td></tr><tr><td>Doku lizör/homojenizatör</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td>Serial 0001620</td></tr><tr><td>Hacimsel şişeler (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>IKA Works Inc. (Crown Scientific Pty. Ltd. tarafından dağıtılmaktadır.)</td><td></td><td>001722</td></tr><tr><td>Su</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBW6-4</td><td>Optima LC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>Suyun Doğruluğu Kuaterner pompalarla donatılmış LC sistemi</td><td>Sular</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suyun Kapasitesi UPLC 100mm HSST3 C18 sütun</td><td>Sular</td><td>p / n 186005614</td><td></td></tr></tbody></table>

hedefsiz sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi tabanlı metabolomik buğday tanesi analizi

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Tarım uygulamalarında genler, çevre ve yönetim arasındaki etkileşimlerin anlaşılması, ürün verimi ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetimine olanak sağlayabilir. Metabolomik veriler, bu etkileşimlerin belirli bir anda okunmasını sağlar ve bir organizmanın biyokimyasal durumu hakkında bilgilendiricidir. Ayrıca, bireysel metabolitler veya metabolitlerin panelleri verim ve kalite tahmini ve yönetimi için hassas biyobelirteçler olarak kullanılabilir. Bitki metabolom fizyolojik özellikleri ve biyomarker keşif içine bir biyokimyasal anlayış için bir fırsat sağlamak çeşitli fizyokimyasal özelliklere sahip küçük moleküllerin binlerce içerdiği tahmin edilir. Bunu kullanmak için, metabolomik araştırmacılar için önemli bir amaç tek bir analiz içinde mümkün olduğunca çok fizikokimyasal çeşitliliğin yakalamaktır. Burada tarlada yetişen buğday tanesinin analizi için sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tabanlı hedefsiz metabolomik bir yöntem salıyoruz. Yöntem üçüncü bir mobil faz tanıtmak için sıvı kromatografi quaternary solvent yöneticisi kullanır ve bir lipid-münakaşa gradyanı ile geleneksel ters faz gradyanı birleştirir. Tane hazırlama, metabolit ekstraksiyonu, enstrümantal analiz ve veri işleme iş akışları ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İyi kütle doğruluğu ve sinyal tekrarlanabilirliği gözlendi ve yöntemiyonizasyon modu başına biyolojik olarak yaklaşık 500 özellik verdi. Ayrıca buğday çeşitleri arasında anlamlı olarak farklı metabolit ve lipid özelliği sinyalleri belirlendi.

Bitki metabolom genomu ve çevre bir arada etkilenir, ve ayrıca bir tarımsal ortamda, ürün yönetimi rejimi. Buğday çeşitleri arasındaki genetik farklılıkların metabolit düzeyinde gözlemlenebildiği, burada 500'den fazla ölçülen bileşiğin sadece tahıldaki çeşitler arasında anlamlı olarak farklı konsantrasyonlar gösterdiğini gösteriyoruz. İyi kütle doğruluğu (&lt;10 ppm hatası) ve iç standartların sinyal tekrarlanabilirliği (&lt; RSD) hem negatif hem de pozitif iyonizasyon modları için gözle...

Buğday tanemetabolitleri ve lipitlerinin hedeflenmemiş analizi için bir yöntem sunulmuştur. Protokol, pozitif ve negatif elektrosprey iyonizasyon modlarında edinim ile bir asetonnril metabolit çıkarma yöntemi ve ters faz sıvı kromatografi-kütle spektrometresi metodolojisi içerir.

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Metabolit genom ortamı ve yönetim uygulamaları gibi faktörlerden etkilenir. Bu faktörler arasındaki etkileşimleri anlamak, bir ürünün veriminin ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetilmesine olanak sağlayabilir. Geleneksel iki yerine üçüncü bir mobil faz birleştirerek, bu teknik ayrım ve metabolitlerin daha geniş bir yelpazede algılama sağlar.Metabolomik biyolojinin herhangi bir alanına uygulanabilir. İlk olarak, bir organizmanın biyokimyadaha derin bir anlayış elde etmek için, ve fizyolojisi ile ilgili olarak abiyotik veya biyotik strese yanıt açıklamaya yardımcı olur. İkinci olarak, biyobelirteçleri çalışma aşamasındaki tedirginlikle ilişkilendirmek.İzopropil alkol viskoz bir çözücü olduğu için, düşük parlama hızında kullanılmalı ve kompozisyonu %98'e artırmadan önce kullanılan yeterli denge süresi Bu adımlar kromatik grafik sisteminin aşırı basınçlanmasını, hata dönmesini veya analitik kolona zarar vermesini önleyecektir. Tanelerin hazırlanmasına başlamak için, tahıl öğütmek için bir laboratuvar blender kullanın. Blender'ı 20 saniye yüksek hızda çalıştırın ve tekrarlayın.Blender kavanozu tabandan çıkarın. Numunenin yüzeyine herhangi bir kaba öğütülmüş tane getirmek için blender kavanozunun yan tarafına dokunun. Kaba öğütülmüş tahıl atılabilir veya depolanabilir.İnce öğütülmüş tahılı blender'dan iki mililitrelik plastik mikro santrifüj tüpe aktarın. Çıkarma işlemiyle aynı gün, el yazmasında açıklandığı gibi ekstraksiyon çözücüsi hazırlayın. Sonra, iki mililitrelik mikro santrifüj tüp içine ince öğütülmüş tahıl 200 miligram ağırlığında.Tüpteki tahıla 500 mikrolitre ekstraksiyon çözücüekleyin. Buna ek olarak, boş bir tüpe 500 mikrolitre ekstraksiyon çözücü satarak boş bir boş hazırlayın. 6, 500 RPM olarak ayarlanmış bir homogenizer kullanarak, 20 saniye boyunca çözücü ve tahıl karıştırın.Sonra, başka bir 20 saniye için tekrarlayın. Sonra, tüpü dört santigrat derecede ve 16, 100 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant'ı iki mililitrelik plastik bir tüpe aktarın ve peleti koruyun.Pelet üzerindeki ekstraksiyon işlemini iki kez tekrarlayın. Yaklaşık 1,5 mililitre toplam ekstre hacmi verim ve girdap tarafından karıştırın, üç supernatants birleştirin. Kalite kontrolü için kullanılacak tüm tane ekstrelerinin havuzlu bir örneğini yapmak için, her tane ekstresinin 55 mikrolitresini iki mililitrelik bir tüp ve girdap aktarın.Daha sonra, bu havuzlu numunenin 50 mikrolitrelik aliquotlarını cam şişelere aktarın. Her tane numune ekstresinin 50 mikrolitrelik aliquot'unun cam şişelere aktarılması. Yazılı el yazmasında açıklandığı gibi, sıvı kromatografi kütle spektrometresi için gerekli olacak çözümleri hazırlayın.LCMS analizi nin olduğu gün, mililitre liucine enkephalin başına 200 nanogram içeren 100 mililitre %5 asetonitil hazırlayın. Tahıl ekstresinin 50 mikrolitrelik aliquot'unu içeren cam şişeye bu çözeltinin 950 mikrolitresini ekleyin. Girdap tarafından şişe içinde içeriğini karıştırın.İlk olarak, el yazmasıve üreticinin kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi aletleri kalibre ayarlayın. Daha sonra, mobil faz ve yıkama çözücüleri de dahil olmak üzere LCMS sınıfı çözücüler kullanarak LC akışkan sistemini temizleyip temizle. LC sistemini LC yöntemiyle dengeleyin ve kolon basıncının dengelenmesini sağlar.Enstrüman sıra tablosunu ayarlayın. Cihaz kalibrasyonunun kontrol edilebiyi kontrol etmek için numune dizisinin başında sodyum formatı enjekte edin. Önce çözücü ve preparative boşlukları analiz edin, ardından sistem koşullandırması için havuzlu kalite kontrol örnekleri ve ardından randomize örnek listesi.Teknik çoğaltmalar gibi, düzenli aralıklarla kalite kontrol örnekleri çalıştırın. Dizinin sonunda iki kalite kontrol örneği çalıştırın. Dizi çalışırken, hem dahili standart kütle doğruluğu hem de sinyal tekrarlanabilirliği de dahil olmak üzere veri kalitesini kontrol edin.Sinyal tekrarlanabilirliğini kontrol etmek için, overlaid spectra görsel muayene yeterli olmalıdır. Tahıl özlerinin hazırlanmasında kullanılan çözeltiye dört iç standart dahil edildi. LCMS sırasında hem pozitif hem de negatif iyonizasyon modları için iyi kütle doğruluğu ve iç standartların tek tekrarlanabilirliği gözlendi.Boşlukların analizine göre negatif modda 421, pozitif modda 835 sinyal eser olarak değerlendirildi. Bu sinyaller, tane örneklerindeki ortalama tek şiddetin %5'ine eşit veya daha büyük yoğunluklarda boşluklar halinde mevcuttu. Yapılar kaldırıldıktan ve verilerin daha fazla filtreledikten sonra negatif mod 483 özellik döndü ve pozitif mod 523 özelliği döndürmüştür.Yaklaşık 250 özellik biyolojik olarak ilgiliydi ve buğday çeşitleri arasında yoğunluk açısından önemli ölçüde farklılık gösterebildi. Bu protokolde, preparatif boşlukların, iç standartların ve havuzlu örneklerin dahil edilmesi gibi kalite kontrol önlemleri unutulmaması gereken öneme açıktır.

untargeted-liquid-chromatography-mass-spectrometry-based-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir.  Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Burada, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS-MS) kullanılarak hidroponik koşullar altında buğdayda imidaklopridin emiliminin, translokasyonunun ve dağılımının belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır. Sonuçlar, imidacloprid'in buğday tarafından emilebileceğini ve imidacloprid'in hem buğday köklerinde hem de yapraklarında tespit edildiğini gösterdi.

Buğdayda Imidacloprid'in Emiliminin, Translokasyonunun ve Dağılımının Belirlenmesi

Arpanın metabolomik analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yöntem, metabolitlerin fraksiyonlanmasını ve türetilmesini ve bunların gaz kromatografisi/kütle spektrometresi (GC/MS) ile analizini gerektirir. Metabolomik analiz, ara ekim ve kuraklık stresinin tahıl üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılabilir.

Arpanın Gaz Kromatografisi/Kütle Spektrometresi ile Metabolomik Analizi

Bu protokol, yakın zamanda yayınlanan Komisyon Yönetmeliği (AB) 2023/915'e uygun olarak gıdalarda ergot alkaloidlerinin varlığını belirlemek için doğrulanmış bir sıvı kromatografisi-iyon hareketliliği-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi yöntemi sunar.

Sıvı Kromatografisi Tuzaklı İyon Hareketlilik Spektrometresi-Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi ile Gıda Matrislerinde Düzenlenmiş Ergot Alkaloidlerinin Tespiti

Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Keşfedin buğday tanesi metabolomik analizi için hedefsiz sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi yöntemini. Üçüncü mobil faz kullanımı daha geniş metabolit tespiti sağlar ve tarımsal verim ile kalite yönetimine katkıda bulunur.

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Daha fazla video keşfet