Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IX'a Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde

Metodolojimiz, bir dokuda in vivo olarak endojen reaktif oksijen türlerinin veya ROS üretiminin geçici bir aktivasyonunu indüklemek için güvenilir bir deneysel araç sağlayan ilk metodolojidir. Metodolojimiz, temel olarak bir kırmızı ışık kaynağı kullanarak ciltte fizyolojik uyarıcı ROS seviyelerinin tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlayan sağlam, kullanıcı dostu ve invaziv olmayan bir prosedür sağlar. ROS'un derideki fizyolojik indüksiyonu doku sapı ihtiyaçlarını karşıladığından, iyi iyileşme ve saç büyümesi dahil olmak üzere cilt yenileme tedavisi metodolojimizi daha da uyguladık.

ROS biyolojisi ve sinyalizasyonu şu anda bir araştırma potasıdır. ROS fonksiyonunu in vivo olarak araştırmak için önemli bir sınırlama, kontrollü bir endojen ROS üretimini indüklemek için yeterli araçların olmamasıdır. BİZİM metodolojimiz kullanıcı dostu ve kolaydır, ancak tüm cihazların, lamba, IV, IS, vb.'nin yeterince kalibre edilmesi gerekir.

Kritik kimyasal öncüller taze olmalı ve tüm adımlar veya protokol titizlikle takip edilmelidir. İkinci telojen fazda farelerin sırt derisinde tüy büyümesini indüklemek için, yaklaşık 50. gün doğum sonrası çöp arkadaşı C57 siyah altı farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, her farenin sırtından iki bağımsız yan yana cilt bölgesini çıkarmak için bir jilet ve tüy dökücü krem kullanın. Birkaç dakika sonra, kremi PBS ile çıkarın ve her bir hayvanın kontrol ve tedavi edilen dorsal deri bölgelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerinin günlük olarak elde edilmesiyle saç folikülü büyümesini kaydedin.

İkinci telojen fazda farelerin dorsal derisinde ikinci derece yanık lezyonlarının oluşumunu indüklemek için, kılları farenin arkasından çıkarın. Bir santimetre kesitli pirinç çubuğu kaynar suda 95 santigrat dereceye ısıtın ve çubuğu fare derisinin orta bölgesine beş saniye boyunca uygulayın. Yanık oluşumundan hemen sonra, dehidrasyonu önlemek ve tedaviye devam etmeden önce farelerin 24 saat boyunca iyileşmesine izin vermek için hayvanlara intraperitoneal olarak bir mililitre fizyolojik çözelti enjekte edin.

BrdU işaretli tutucu hücrelerin veya LRC'lerin üretilmesi için, PBS'de vücut ağırlığının kilogramı başına 50 miligram BrdU ile art arda dört gün boyunca günde bir kez intraperitoneal olarak 10 veya 14 günlük çöp eşleri enjekte edin. Etiketleme aşamasından sonra, tedaviyi uygulamadan önce farelerin 50 ila 60 gün boyunca gelişmesine izin verin. Bir saç büyüme analizi için fare derisinde öldürücü olmayan reaktif oksijen türlerinin veya ROS seviyelerinin geçici üretimini indüklemek için, temel bir saç büyümesi görüntüsü elde ettikten sonra, sağ traşlı cilt bölgesine topikal olarak yaklaşık 25 miligram mALA kremi uygulayın ve hayvanı 2,5 saat karanlıkta bırakın.

Işığa duyarlılaştırıcı tedavi süresinin sonunda, fazla kremi PBS ile iyice çıkarın ve mavi ışık uyarımı altında kırmızı floresan ekspresyonu ile yerinde PP9 üretimini onaylayın, ardından tüm arka cildi toplam 2.5 ila 4 doz için yeterli bir kırmızı ışık kaynağı ile ışınlayın santimetre kare başına joule. Daha sonra, hayvanları kafeslerine geri döndürmeden önce farelerin tam olarak yaslanana kadar izleme ile elektrikli bir battaniye üzerinde iyileşmelerine izin verin. İkinci derece yanık iyileşmesi için geçici ROS üretimini açmak için, sağ yanık yüzeyi boyunca yaklaşık 25 miligram mALA kremi ve yaklaşık dört milimetre bitişik doku uygulayın ve hayvanları gösterildiği gibi 2,5 saat karanlıkta bırakın.

Kremi çıkardıktan sonra, tüm sırt derisini ışınlayın ve farelerin gösterildiği gibi izleme ile iyileşmesine izin verin. Kuyruk derisinde geçici ROS üretimini indüklemek için, BrdU ile tedavi edilen farelerin sırt dokusu alanı boyunca yaklaşık 25 miligram mALA kremi uygulayın ve gösterildiği gibi kuyruğun sırt derisini ışınlayın. Farelere ötenazi yaptıktan sonra, BrdU tespiti için kuyruk derisini hasat edin.

Her hayvanın kuyruğunu almak için bir neşter kullanın, ardından düz uzunlamasına kesiler yapın ve tüm cildi omurgadan tek bir parça olarak soyun. Soyulmuş deri parçalarını beş milimolar EDTA ve PBS ve beş mililitrelik tüplerde 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin, böylece sağlam epidermis tabakalarının forseps ile dermisten dikkatli bir şekilde ayrılmasını sağlayın. Ayrılan dokuları oda sıcaklığında en az 72 saat% 4 formaldehit ve PBS içinde sabitleyin.

Daha sonra, her deneysel koşul altında LRC'leri tanımlamak ve ölçmek için standart protokollere göre dokuları floresan konfokal mikroskopi ile görselleştirmeden önce sabit dokuları ilgilenilen floresan konjuge antikorlarla etiketleyin. ROS üretiminin ex vivo değerlendirmesi için, gösterildiği gibi fare kuyruğu deri parçalarını hasat ettikten sonra, kontrol ile tedavi edilmemiş dokuları ve tek başına beş milimolar EDTA ve PBS'yi ve iki milimolar mALA ile desteklenmiş EDTA'daki fotodinamik tedavi örneklerini inkübe edin. Daha sonra, her bir doku setine 3.2 mikromolar son konsantrasyona hidroetidin ekleyin ve tüm numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, kuyruk derisi örneklerini bir cam yüzey üzerinde germek için parmak uçlarınızı kullanın ve tedavi edilen dokuları santimetre kare başına 10 joule akışta 636 nanometre kırmızı ışıkla ışınlayın. Tedavinin sonunda, epidermisi dermisten hemen ayırın ve epidermal tabakaları oda sıcaklığında en az 72 saat boyunca% 4 formaldehit ve PBS'ye sabitleyin. Fiksasyonun sonunda, yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesini sağlamak için yeşil heyecan verici ışık kullanarak floresan mikroskobu ile kırmızı 2-hidroksietidyum emisyonunu değerlendirin.

Dorsal deride ROS üretiminin in vivo tespiti için, kırmızı ışık ışınlamasından hemen sonra, tüm hedef kontrol ve tedavi edilen cilt bölgelerine mililitre DH-FDA başına 100 mikrolitre bir miligram ve %50 etanol uygulayın. mALA öncüsünün fare sırtı ve kuyruk derisi üzerine topikal olarak uygulanması, bu bileşiğin mavi ışık uyarımı altında kırmızımsı pembe floresansı ile gösterildiği gibi, tüm dokuda ve belirgin şekilde saç folikülünde önemli bir protoporfirin IX birikimine neden olur. Tedavi edilen dokunun daha sonra kırmızı ışıkla ışınlanması, doku içinde, özellikle saç folikülünün şişkin bölgesinde geçici ROS üretimini teşvik eder.

Fare derisinde in vivo olarak ölümcül olmayan ROS üretiminin açılması, fotodinamik tedaviden iki gün sonra kıl folikülünün şişkin bölgesindeki LRC'lerin sayısında önemli bir artışa neden olur. Özellikle, LRC sayılarındaki artış geçicidir ve tedaviden altı gün sonra normal seviyelere geri döner. Geçici ROS üretimi, ikinci derece yanıktan sonra cilt iyileşmesini hızlandırır.

Hasarlı cildin kademeli olarak azalmasının ölçülmesi, yara iyileşmesini hızlandırma süreci dokusunun sağlamlığını ve istatistiksel önemini gösterir. Benzer şekilde, ölümcül olmayan ROS seviyeleri, saç folikülünün büyüme uyaranlarına yanıt vermeye dirençli olduğu bir faz olan ikinci koordineli telojen sırasında tıraştan sonra saç büyümesini güçlü bir şekilde destekler. Ek olarak, foto işlemlerden sonra ROS üretimi de antioksidan bileşiklerin uygulanmasıyla önemli ölçüde azalır.

Mavi ışık uyarımı altında kırmızı floresan ifadesi ile yerinde PP IX üretimi dikkatli bir şekilde onaylanmalıdır. ROS üretimini indüklemek için kırmızı ışık kaynağının ışınımı doğru bir şekilde kurulmalıdır. doku ve toplam ışık dozuna karşı.

ROS indüksiyonundan sonra, toplanan örnekleri analiz etmek ve dokunun dinamik fizyolojik tepkisini değerlendirmek için mevcut biyokimyasal ve hücre ve moleküler biyoloji teknikleri kullanılabilir. Metodolojimiz, in vivo bir dokuda geçici bir endojen ROS üretiminin fizyolojik etkisini araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Bu, ROS sinyalizasyonu alanındaki araştırmacılar için çok yararlı olabilecek yeni bir deneysel yaklaşımdır.