Name: Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IXa Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Keşfedin fare derisinde kök hücre nişlerinin uyarılması ve doku rejenerasyonu için protoporfirin IX'a bağlı reaktif oksijen türlerinin fotojenerasyonu yöntemini. Bu protokol saç büyümesi ve yara iyileşmesini destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İspanya'dan Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1'den JE'ye) ve Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458'den JE'ye) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. EC, Atracción de Talento Investigador hibesi 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid ve UAM) tarafından desteklenmiştir.

Tüm fare yetiştiriciliği ve deney prosedürleri, hayvan deneyleri ile ilgili yerel, ulusal, uluslararası mevzuat ve yönergelere uygun olarak yürütülmelidir.
1. Saç büyümesinin indüksiyonu, yanık indüksiyonu ve kuyruk derisi epitelindeki uzun süreli BrdU LRC'lerin tanımlanması
NOT: Aşağıda açıklanan deneysel tasarımlar için 10 günlük veya 7 haftalık C57BL/6 fareler, tercihen yavrular kullanın. Tüm deneysel prosedürlerde, hayvanlar% 3 izofluran inhalasyonu ile uyuşturulacak veya belirtildiği gibi servikal çıkık ile ötenazi yapılacaktır.
<ol><li>İkinci telojen (dinlenme) fazında farelerin arka derisinde saç büyümesinin indüksiyonu (doğumdan yaklaşık 50. gün)<ol><li>% 3 izofluran inhalasyonu ile fareleri uyuşturun. Pedal refleksi (sert ayak parmağı sıkışması) eksikliği ile tam derin anesteziyi onaylayın. Saç kesme makinesi ve tüy dökücü krem kullanarak her bir farede sırt derisinin yan yana iki bağımsız bölgesini tıraş edin (Malzeme Tablosu). Kontrol için sol tarafı, tedavi için sağ tarafı kullanın. NOT: Tıraştan sonra, alt arka derinin pembemsi olduğunu ve gri/siyah olmadığını, bu fare suşunda melanogenezin ve anajen (büyüme) fazına girişin bir göstergesi olduğunu kontrol edin.</li>
		<li>Tüm krem kalıntılarını gidermek için PBS ile iyice yıkayın ve bölüm 2.1'de açıklandığı gibi ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici yerinde üretiminin indüksiyonuna devam edin.</li>
		<li>Her hayvanda kontrol ve tedavi edilen arka deri bölgelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini günlük olarak alarak saç folikülü büyümesini kaydedin (örneğin, 5−20x dürbün merceğe bağlı bir HD kamera kullanarak).</li>
	</ol></li>
	<li>İkinci telojen (dinlenme) fazda farelerin arka derisinde 2. derece yanık lezyonlarının indüksiyonu (doğumdan yaklaşık 50. gün)<ol><li>Fareleri uyuşturun. Saç kesme makinesi ve tüy dökücü krem kullanarak her bir farede tüm arka deri bölgesini tıraş edin ve tüm krem kalıntılarını gidermek için PBS ile iyice yıkayın. NOT: Yakma prosedüründen hemen önce 7 mg / ml'yi geçmeyen steril salin içinde% 0.5 (2 mg / ml) lidokain enjeksiyonlarını yerinde uygulayın.</li>
		<li>Pirinç bir çubuğu (enine kesiti 1 cm) kaynar suya batırarak 95 °C'de önceden ısıtın ve ardından her farenin sırt arka deri yüzeyinin orta bölgesine 5 saniye boyunca uygulayın.</li>
		<li>Yanık oluşumundan hemen sonra, dehidrasyonu önlemek için hayvanlara 1 mL fizyolojik çözelti (% 0.9 NaCl) ile intraperitoneal olarak elektrikli bir battaniyeye enjekte edin. Hayvanların 24 saat boyunca iyileşmesine izin verin ve bölüm 2.3'te açıklandığı gibi ölümcül olmayan ROS seviyelerinin yerinde geçici üretiminin indüksiyonuna devam edin.</li>
		<li>Her hayvanda kontrol ve tedavi edilen arka deri bölgelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini günlük olarak alarak yanık yarası ilerlemesini kaydedin (örneğin, 5−20x dürbün merceğe bağlı bir HD kamera kullanarak).</li>
	</ol></li>
	<li>Kuyruk derisi epitelinde uzun süreli BrdU LRC'lerin üretilmesi ve tanımlanması<ol><li>PBS'de çözünmüş 50 mg / kg vücut ağırlığı BrdU ile art arda 4 gün boyunca günde bir kez 10/14 günlük littermatları intraperitoneal (anestezi olmadan) enjekte edin. Etiketleme aşamasından sonra, herhangi bir tedaviden önce farelerin 50-60 gün büyümesine izin verin. NOT: Her enjeksiyon için yeni bir iğne kullanın.</li>
		<li>Doku bütünlüklerinin hazırlanmasından önce farklı zamanlarda kuyruk derisinde geçici in situ öldürücü olmayan ROS üretiminin indüksiyonu için bölüm 2.3'te açıklandığı gibi ilerleyin.</li>
		<li>Kuyruk epidermisinin tamamını hazırlamak için, fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın ve kuyrukları cerrahi makasla klipsleyin.<ol><li>Kuyruk boyunca düz bir uzunlamasına kesi yapmak için bir neşter kullanın ve tüm cildi omurgadan tek bir parça olarak soyun. Soyulmuş cildi 37 ° C'de 4 saat boyunca 5 mL tüplerde PBS'de 5 mM EDTA'da inkübe edin ve forseps kullanarak sağlam epidermis tabakalarını dermisten dikkatlice ayırın.</li>
			<li>Dokuyu oda sıcaklığında (RT) en az 72 saat boyunca PBS'de% 4 formaldehit içinde sabitleyin ve uygun antikorları kullanarak BrdU tespitine devam edin.</li>
			<li>Daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, doku bütünlüklerinin hazırlanmasından önce farklı zamanlarda ışık kontrolleri ve fotodinamik tedaviler dahil olmak üzere her deneysel durumda LRC'leri tanımlamak ve ölçmek için floresan/konfokal mikroskopi kullanın19,20. NOT: Sabit epidermal tabakalar, %0.02 sodyum azid içeren PBS'de 4 °C'de üç aya kadar saklanabilir. Standart histolojik kesit prosedürlerini takiben gerekli proteinlerin immünolokalizasyonu için sabit epidermal tabakalar kullanılabilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Fare derisinde ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici üretiminin indüksiyonu
NOT: Fare derisinde ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici üretimini indüklemek için, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX'in bir öncüsü kullanılarak fotodinamik bir tedavi, bu durumda metil-aminolevulinat (mALA) ve kırmızı ışık kullanılacaktır.
<ol><li>Arka deride tüylenmenin indüksiyonu için geçici ROS üretimini açmak için, hayvanları bölüm 1.1'de belirtildiği gibi hazırlayın.<ol><li>~25 mg mALA'yı topikal krem şeklinde (Malzeme Tablosu) sağ bölgeye uygulayın, sol tarafı iç kontrol olarak tutarak bireyler arası farklılıklardan kaçının. Karanlıkta 2,5 saat inkübe edin, fazla kremayı PBS ile iyice yıkayın. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin. NOT: Arka deride PpIX üretimi, mavi ışık (407 nm) uyarımı altında kırmızı floresansı ile yerinde test edilmelidir.</li>
		<li>Hayvanları uyuşturun.</li>
		<li>Tüm sırt derisini toplam 2.5−4 J /cm2 dozu için yeterli bir kırmızı ışık kaynağı (Malzeme Tablosu) ile ışınlayın. Fareleri tamamen iyileşene kadar elektrikli battaniye üzerinde tutun ve adım 1.1.3'te açıklandığı gibi devam edin. NOT: Işınım, ışık kaynağı ile doku arasındaki mesafe manipüle edilerek ayarlanmalı ve bir güç enerji ölçer (Malzeme Tablosu) kullanılarak ölçülmelidir. Her hayvanın bağımsız traş bölgelerinden herhangi birinde tam tüy büyümesi gözlemlendiğinde deney bitmiş sayılır. Tüm prosedür sadece tek bir fotoğraf tedavisini içerir.</li>
	</ol></li>
	<li>2. derece yanık lezyonlarının iyileşmesi için geçici ROS üretimini açmak için, hayvanları bölüm 1.2'de belirtildiği gibi hazırlayın.<ol><li>Yanmış yüzey boyunca topikal krem şeklinde ~ 25 mg mALA uygulayın ve yaklaşık 4 mm bitişik dokuyu kaplayın. Karanlıkta 2,5 saat inkübe edin, fazla kremayı PBS ile iyice yıkayın. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin.</li>
		<li>Hayvanları uyuşturun.</li>
		<li>Tüm sırt derisini toplam 2.5−4 J /cm2 dozu için yeterli bir kırmızı ışık kaynağı ile ışınlayın. Fareleri tamamen iyileşene kadar elektrikli battaniye üzerinde tutun ve adım 1.2.4'te açıklandığı gibi devam edin. NOT: Tam yanık iyileşmesi gözlendiğinde her hayvan için deneysel prosedür bitmiş sayılır. Tüm prosedür sadece tek bir fotoğraf tedavisini içerir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kuyruk derisinde geçici ROS üretimini açmak için, fareleri bölüm 1.3'te belirtildiği gibi hazırlayın, dorsal doku alanı boyunca topikal krem şeklinde ~ 25 mg mALA uygulayın ve sırt derisi için bölüm 2.1'de açıklandığı gibi devam edin. Hayvan ötenazisinden 24 saat, 48 saat veya 72 saat önce fotoğraf tedavileri ve ilgili ışık kontrolleri gerçekleştirin ve kuyruk derisinin tüm bağlantılarının daha fazla çıkarılması. NOT: Tüm deneysel tasarımlarda, antioksidan ROS tutucular kullanarak işlemin ROS bağımlılığını test edin (ör., PBS'de 20 mg / mL'lik bir çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonu ile günlük 100 mg / kg vücut ağırlığı N-asetil-sistein aşılanması, pH 7.2, mALA tedavilerinden 5 gün önce başlayarak veya alternatif olarak,% 50 etanol içinde iki doz 100 mg / mL askorbik asit, 30 dakika aralıklı, mALA tedavileri ve kırmızı ışık ışınlaması arasındaki zaman aralığında cilde topikal olarak uygulanır).</li>
</ol>3. Deride ROS tespiti
<ol><li>Hidroetidin kullanılarak fotodinamik işlemden sonra kuyruk derisinde ROS üretiminin ex vivo değerlendirilmesi NOT: Hidroetidin, floresan boya 2-hidroksietidyum (hET) üretmek için spesifik olarak ROS ile reaksiyona giren, floresan olmayan bir moleküldür.<ol><li>Bölüm 1.3.3'te tarif edildiği gibi elde edilen bütün kuyruk derilerini, PBS çözeltisinde (kontrol numuneleri) 5 mM EDTA içinde 37 °C'de 3 saat inkübe edin veya ek olarak 2 mM mALA (fotodinamik işlem numuneleri) ekleyin.</li>
		<li>Her durumda, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 25 mg / mL'lik bir stoktan 3.2 μM'lik bir nihai konsantrasyona hidroetidin ekleyin ve RT'de karanlıkta 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Kuyruk derisi örneklerini parmak uçlarınızı kullanarak cam bir yüzey üzerinde gerin ve 10 J/cm2 akıcılıkta 636 nm kırmızı ışıkla ışınlayın.</li>
		<li>Epidermisi dermisten ayırmak ve epidermal tabakaları bölüm 1.3.3'te açıklandığı gibi sabitlemek için hemen devam edin.</li>
		<li>Yeşil heyecan verici ışık kullanarak bir floresan/konfokal mikroskop altında hET kırmızı emisyonunu değerlendirin, yüksek kaliteli görüntüler yakalayın ve daha fazla analize devam edin. NOT: hET otoksidasyonu için negatif bir kontrol olarak fotodinamik tedavi yokluğunda doku örneklerinin hET boyamasını kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Saç büyümesinin indüklenmesi ve yanık iyileşmesinin ardından fotodinamik tedaviden sonra arka deride ROS üretiminin in vivo tespiti NOT: Bu adım, hücre içi esteraz enzimleri tarafından bölünmeden sonra, spesifik olarak 2',7'-diklorofloresein (DCF) floresan boyasını veren ROS ile reaksiyona giren, hücre kaynaklı floresan olmayan bir bileşik olan 2',7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DHF-DA) kullanılarak gerçekleştirilir.<ol><li>Saç büyümesinin indüksiyonu (bölüm 1.1) veya yanık iyileşmesi (bölüm 1.2) için hazırlanmış hayvanları kullanın. Topikal mALA krem uygulamalarından hemen önce (bkz. bölüm 2.1 ve 2.2), 100 μL 1 mg/mL'yi %50 etanol içinde DHF-DA tüm hedef kontrol/tedavi edilen cilt bölgelerine topikal olarak dağıtın, cildin materyali tamamen emmesine izin verin ve topikal mALA krem uygulamasına devam edin.</li>
		<li>Tedavi edilen hayvanları karanlıkta 4 saat inkübe edin, topikal mALA kremini PBS ile ciltten iyice yıkayın ve cilde ikinci bir doz 100 μL DHF-DA solüsyonu verin. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin.</li>
		<li>Tedavi edilen hayvanları karanlıkta 50 dakika kuluçkaya yatırın, bir LED lamba kullanarak 636 nm kırmızı ışığın 2,5 ila 4 J/cm2'si arasında değişen bir akıcılıkla tüm sırt derisini uyuşturun ve ışınlayın.</li>
		<li>Işınlamadan hemen sonra, bir in vivo görüntüleme sistemi (Malzeme Tablosu) kullanarak ciltte üretilen ROS seviyelerini değerlendirin. Filtre kutusunu 445−490 nm uyarma ve 515−575 nm emisyon için ayarlayın, yüksek kaliteli görüntüler yakalayın ve daha fazla analize devam edin. NOT: DHF-DA otoksidasyonu için negatif kontrol olarak fotodinamik tedavi yokluğunda doku örneklerinin DHF-DA boyamasını kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Blázquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+1O2+optical+excitation%3A+A+tool+for+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology.</a> Redox Biology. 13, 39-59 (2017).</li>
<li>Valko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).</li>
<li>Sena, L. A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Roles+of+Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species.</a> Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).</li>
<li>Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+Destroyers+or+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: Destroyers or messengers.</a> Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).</li>
<li>Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+from+health+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Medical+Weekly%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: from health to disease.</a> Swiss Medical Weekly. 142, 13659(2012).</li>
<li>Speakman, J. R., Selman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-radical+damage+theory%3A+Accumulating+evidence+against+a+simple+link+of+oxidative+stress+to+ageing+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan.</a> BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).</li>
<li>Fernandez, V., Videla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+aspects+of+cellular+antioxidant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Biochemical aspects of cellular antioxidant systems.</a> Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).</li>
<li>Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+enzymes+and+their+implications+in+pathophysiologic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes.</a> Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+Family+of+ROS-Generating+NADPH+Oxidases%3A+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+Regulation+of+Reactive+Oxygen+Species+Generation+by+Nox+Family+NADPH+Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).</li>
<li>Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+A+radical+role+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: A radical role in development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).</li>
<li>Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development%3A+Passive+or+active%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+stress+and+signaling+during+vertebrate+embryonic+development%3A+Regulation+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+prime+Drosophila+haematopoietic+progenitors+for+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation.</a> Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li>
<li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+Neural+Stem+Cells+Have+High+Endogenous+ROS+Levels+that+Regulate+Self-Renewal+and+Neurogenesis+in+a+PI3K%2FAkt-Dependant+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li>
<li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((production+and+NF-%CE%BAB+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li>
<li>Hamanaka, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species+Promote+Epidermal+Differentiation+and+Hair+Follicle+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development.</a> Science Signaling. 6 (261), 8(2013).</li>
<li>Carrasco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+ROS+Production+in+situ+Transiently+Activates+Cell+Proliferation+in+Mouse+Skin+and+in+the+hair+Follicle+Stem+Cell+Niche+Promoting+Hair+Growth+and+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).</li>
<li>Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+on+a+transient+endogenous+ROS+production+in+mammalian+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues.</a> Methods. , 109(2016).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+interactions+between+skin+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Emerging interactions between skin stem cells and their niches.</a> Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells+and+implications+for+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells and implications for wound repair.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).</li>
</ol>

Bu çalışmada açıklanan prosedürlerin tüm ticari uygulamaları, EC, MIC ve JE tarafından yazılan ve ticari kullanım için Derma Innovate SL'ye lisanslanan bir CSIC-UAM patenti (EP2932967A1) ile korunmaktadır. JE ve JJM, Derma Innovate SL'de danışmanlık pozisyonuna sahiptir.

Burada, fare derisinde fizyolojik etkilerle in vivo endojen ROS üretiminin geçici aktivasyonuna izin veren bir metodoloji sunuyoruz. Metodoloji, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX'in kontrollü ve lokal bir stimülasyonunu indüklemek için fotodinamik bir prosedüre dayanmaktadır (Şekil 1B). Bu deneysel yaklaşım, ROS biyolojisini in vivo deneysel sistemlerde incelemek için ilginç bir araçtır ve harici ROS kaynakları (genellikle hidrojen peroksit) kullanan metodolojiler üzerinde önemli bir ilerl...

Reaktif oksijen türleri (ROS), moleküler oksijenin su oluşturmak üzere kimyasal indirgenmesinin sonucudur ve singlet oksijen, süperoksit anyonu, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali 1,2,3'ü içerir. ROS, son derece kimyasal reaktif yapıları nedeniyle çok kısa bir ömre sahiptir. Aerobik organizmalarda, ROS, mitokondrideki aerobik solunumun (elektron taşıma zinciri) önemli bir sızdıran yan ürünü olarak hücrelerin içinde tesadüfen oluşur. Hücrede yüksek seviyelerde ROS'un geçici olarak birikmesi, proteinlerin, lipitlerin ve şekerlerin geri dönüşümsüz inaktivasyonunu ve DNA molekülündemutasyonların ortaya çıkmasına neden olabilecek oksidatif bir stres durumuna neden olur 2,3,4,5. Hücrelerde, dokularda ve tüm organizmalarda oksidatif hasarın kademeli birikimi zamanla istikrarlı bir şekilde artar ve hücre ölüm programlarının, çeşitli patolojilerin ve yaşlanma sürecininindüksiyonu ile ilişkilendirilmiştir 2,3,4,6.
Aerobik organizmalar, hücrelerde ve dokularda aşırı ROS birikiminin üstesinden gelmek için sürekli olarak verimli moleküler mekanizmalar geliştirmiştir. Bu mekanizmalar, süperoksit radikal dismutasyonunu moleküler oksijen ve hidrojen peroksite katalize eden süperoksit dismutaz (SOD) protein ailesinin üyelerini ve ayrıca hidrojen peroksitin daha sonra suya ve moleküler oksijene dönüşümünü katalize etmek için antioksidan havuzu (glutatyon, NADPH, peroksiredoksin, tioredoksin 7,8) kullanan farklı katalazları ve peroksidazları içerir.
Bununla birlikte, birkaç rapor, ROS'un proliferasyon, farklılaşma ve hareketlilikdahil olmak üzere kritik hücre fonksiyonlarını düzenleyen moleküler devrelerin temel bileşenleri olarak rolünü desteklemektedir 2,3,4. Bu kavram, lipoksijenazlar, siklooksijenazlar ve NADPH oksidazlar 9,10 dahil olmak üzere aerobik organizmalarda özel ROS üreten mekanizmaların ilk tanımlanması ve karakterizasyonu ile daha da desteklenmektedir. Bu anlamda, ROS omurgalı embriyo gelişimi sırasında aktif bir rol sergiler 11,12,13 ve bu moleküllerin spesifik in vivo fizyolojik fonksiyonların düzenlenmesinde kilit rolleri, Drosophila14'te hematopoietik progenitörlerin farklılaşma programı, zebra balıklarında iyileşme indüksiyonu veya Xenopus kurbağa yavrularında kuyruk rejenerasyonu 15 dahil olmak üzere farklı deneysel sistemlerde bildirilmiştir . Memelilerde ROS, bir nörosfer modelinde16 nöral kök hücrelerin kendi kendini yenileme / farklılaşma potansiyelinde ve kolorektal kanser başlangıcı sırasında bağırsak kök hücre fonksiyonunun deregülasyonunda17 rol oynamıştır. Deride, ROS sinyalizasyonu epidermal farklılaşma ve cilt kök hücre nişinin ve saç folikülü büyüme döngüsünündüzenlenmesi ile ilişkilendirilmiştir 18,19.
Bu perspektifte, hem normal hem de patolojik koşullarda biyolojik sistemlerde ROS'un fizyolojik rollerini belirlemek için önemli bir deneysel sınırlama, bu moleküllerin hücrelerde ve dokularda kontrollü üretimini indüklemek için yeterli deneysel araçların bulunmamasıdır. Şu anda, çoğu deneysel yaklaşım, çoğunlukla hidrojen peroksit formunda eksojen ROS uygulamasını içermektedir. Yakın zamanda, endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX'un öncüllerinin uygulanmasına dayanan fare derisinde geçici, öldürücü olmayan bir in vivo endojen ROS üretimini açmak için deneysel bir yaklaşım uyguladık (PpIX; ör., aminolaevulinik asit veya metil türevi metilaminolevulinat) ve hücre içi moleküler oksijenden yerinde ROS oluşumunu indüklemek için numunenin kırmızı ışıkla daha fazla ışınlanması (Şekil 1). Bu fotodinamik prosedür, yerleşik kök hücre nişlerini uyarmak için etkili bir şekilde kullanılabilir, böylece dokunun rejeneratif programlarını aktive eder 19,20 ve ciltrejeneratif tıbbında yeni terapötik modalitelerin yolunu açar. Burada, saç folikülünün19,21 çıkıntı bölgesindeki uzun süreli 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) etiket tutucu hücrelerin (LRC'ler) sayısındaki artış olarak ölçülen, kök hücre nişlerinin uyarılmasının temsili örneklerini gösteren protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz ve ardından geçici olarak indüklenen rejenerasyon programlarının aktivasyonu (saç büyümesinin hızlanması ve yanık iyileşme süreçleri), C57Bl6 fare suşunun derisinde öldürücü olmayan ROS üretimi.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Diklorofloresan diasetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>5'-bromo-2'-deoksiuridin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5002-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bromodeoksiüridin-Floresein</td><td>Roche</td><td>11202693001</td><td></td></tr><tr><td>Tüy dökücü krem (örn., Veet)</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetidyum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo görüntüleme sistemi, örneğin, topikal krem şeklinde IVIS Lumina 2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mALA, örneğin, METVIX Crema 160 mg/g</td><td>Galderma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power enerji ölçer (örneğin, ThorLabs Model PM100D)</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı ışık kaynağı, örneğin, 636 nm Aktilite LED lamba</td><td>Photocure ASA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare derisinde kök hücre nişlerinin uyarılması ve doku rejenerasyonu, değiştirilebilir protoporfirin ix'a bağlı reaktif oksijen türlerinin fotojenerasyonu ile yerinde

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Burada, fare derisinde endojen reaktif oksijen türlerinin (ROS) değiştirilebilir in vivo fotojenerasyonunu indüklemek için bir protokol açıklıyoruz. Bu geçici ROS in situ üretimi, kök hücre nişlerinde hücre proliferasyonunu etkili bir şekilde aktive eder ve yanık iyileşmesinin ve saç folikülü büyüme süreçlerinin hızlanmasıyla güçlü bir şekilde ortaya çıktığı gibi doku yenilenmesini uyarır. Protokol, dokuyu endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX'un öncülleri ile tedavi eden ve ayrıca sıkı bir şekilde kontrol edilen fizikokimyasal parametreler altında dokuyu kırmızı ışıkla ışınlayan düzenlenebilir bir fotodinamik tedaviye dayanmaktadır. Genel olarak, bu protokol ROS biyolojisini analiz etmek için ilginç bir deneysel araç oluşturmaktadır.

Fare sırt ve kuyruk derisinde mALA öncüsünün topikal uygulaması, bu bileşiğin mavi ışık (407 nm) uyarımı altında kırmızımsı-pembe floresansı ile gösterildiği gibi, tüm dokuda ve belirgin şekilde kıl folikülünde önemli bir PpIX birikimine neden olur (Şekil 2A, C). Tedavi edilen dokunun daha sonra kırmızı ışıkla (636 nm) 2.5−4 J /cm2'lik bir akıcılıkta ışınlanması, dokuda, özellikle saç folikülünün şişkin bölgesinde geçici ROS üretimini teşvik eder (<strong class="x...

Bu protokolün amacı, fare derisinde öldürücü olmayan seviyelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) geçici in vivo üretimini indüklemek ve dokudaki fizyolojik tepkileri daha da teşvik etmektir.

Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IX'a Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Metodolojimiz, bir dokuda in vivo olarak endojen reaktif oksijen türlerinin veya ROS üretiminin geçici bir aktivasyonunu indüklemek için güvenilir bir deneysel araç sağlayan ilk metodolojidir. Metodolojimiz, temel olarak bir kırmızı ışık kaynağı kullanarak ciltte fizyolojik uyarıcı ROS seviyelerinin tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlayan sağlam, kullanıcı dostu ve invaziv olmayan bir prosedür sağlar. ROS'un derideki fizyolojik indüksiyonu doku sapı ihtiyaçlarını karşıladığından, iyi iyileşme ve saç büyümesi dahil olmak üzere cilt yenileme tedavisi metodolojimizi daha da uyguladık.ROS biyolojisi ve sinyalizasyonu şu anda bir araştırma potasıdır. ROS fonksiyonunu in vivo olarak araştırmak için önemli bir sınırlama, kontrollü bir endojen ROS üretimini indüklemek için yeterli araçların olmamasıdır. BİZİM metodolojimiz kullanıcı dostu ve kolaydır, ancak tüm cihazların, lamba, IV, IS, vb.'nin yeterince kalibre edilmesi gerekir.Kritik kimyasal öncüller taze olmalı ve tüm adımlar veya protokol titizlikle takip edilmelidir. İkinci telojen fazda farelerin sırt derisinde tüy büyümesini indüklemek için, yaklaşık 50. gün doğum sonrası çöp arkadaşı C57 siyah altı farede pedal refleksine yanıt

stimulation-stem-cell-niches-tissue-regeneration-mouse-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makalenin amacı, epidermal keratinositlerden ve devitalize insan dermisinden genetik olarak değiştirilmiş insan organotipik derisinin nasıl oluşturulacağına dair kapsamlı ve ayrıntılı bir protokol sağlamaktır.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Biz bir non-invaziv vivo içinde aerodinamik ve maliyet-etkin, protokolü Imaging görselleştirmek ve reaktif oksijen türlerine (ROS) bir fare excisional yara modelinde oluşturulan ölçmek için L-012, bir chemiluminescent luminol-analog, kullanan açıklar.

Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara

Biz İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı lenfositi ve fibroblastlar ayırt etmek ve bir 3B cilt organoid oluşturmak gösterilmiştir bir protokol bu lenfositi ve fibroblastlar kullanarak öneriyoruz. Bu iletişim kuralı insanlaşmış fareler model oluşturma ek bir adım içerir. Burada sunulan teknik dermatolojik araştırma artıracaktır.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Burada, melanositler için optimize edilmiş bir doğrudan yeniden programlama sistemi ve sorunsuz doğrudan yeniden programlama sağlayan yüksek verimli, konsantre bir virüs paketleme sistemi açıklanmaktadır.

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

Geleneksel olarak, hücre kültürü, hücrelerin doğal ortamını in vivo olarak zayıf bir şekilde taklit eden düzlemsel substratlar üzerinde gerçekleştirilir. Burada, fizyolojik olarak ilgili kavisli geometrilere ve mikro desenli hücre dışı proteinlere sahip hücre kültürü substratları üretmek için bir yöntem tanımladık ve bu hücre dışı ipuçlarının hücresel olarak algılanmasına sistematik araştırmalara izin veriyoruz.

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

Burada, adipoz kaynaklı kök hücre (ADSC) kültürü için üç boyutlu (3D) hücre kültürü çerçevesi olarak hidrojelin kullanımını gösteren ve 3D kültür ortamında ADSC'lerin proliferasyonunu arttırmak için fotobiyomodülasyonu (PBM) tanıtan bir protokol sunuyoruz.

Hidrojel İçinde Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin Fotobiyomodülasyon Ogmentasyonu ile Üç Boyutlu Hücre Kültürü

Yinelemeli ağartma-uzatma-çoğullama (IBEX) ve ticari bir nükleotid etiketleme testinin (Click-iT EdU) kombinasyonu, sabit donmuş murin dokusu kesitlerinde oldukça dinamik süreçlerde bölünen hücre tiplerinin saptanmasını ve sınıflandırılmasını sağlar. Ayrıca, yeni bir açık kaynaklı görüntü işleme hattı, yüksek verimli görüntü elde etme ve analiz sağlar.

Doku Örneklerinde Cilt Hücresi Fenotiplerini ve Proliferasyon Durumlarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Görüntüleme ve Analiz İş Akışı

Bu protokol, cilt mimarisini ve işlevini çoğaltmak için düzlemsel, fizyolojik olarak ilgili bir hava-sıvı arayüz kültür sistemi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden saç folikülleri içeren cilt organoidleri üretmek için bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir.

Hava-Sıvı Arayüz Kültür Sistemi Kullanılarak İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Düzlemsel Saç Taşıyan Cilt Organoidlerinin Üretimi

Bu yöntem, yaşlı cilt fibroblastlarının sağlıklı fibroblastları nasıl etkilediğini inceler. Yaşlanma, UVB maruziyeti yoluyla indüklenir ve koşullu ortam normal fibroblastlara uygulanır. Cilt yaşlanmasında değişen hücre-hücre iletişimini hedefleyen biyoaktif bileşiklerin değerlendirilmesine yardımcı olur.

Yaşlı Hücrelerden Koşullu Ortamla In vitro Modelde Sağlıklı Hücreler Arası İletişimi Yeniden Sağlayacak Antioksidan Kombinasyonu

Keşfedin fare derisinde kök hücre nişlerinin uyarılması ve doku rejenerasyonu için protoporfirin IX'a bağlı reaktif oksijen türlerinin fotojenerasyonu yöntemini. Bu protokol saç büyümesi ve yara iyileşmesini destekler.

Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IXa Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde (Video) | JoVE Journal

Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IX'a Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde

Daha fazla video keşfet