Küçük Saç Örneklerinde 11 İlaca Dirençli TB İlaçların Ölçülmesi için Doğrulanmış LC-MS/MS Paneli

Hasta bağlılığı çok zordur ve ilaç metabolizması kişiden kişiye değişebilir, bu nedenle ilaç düzeylerinin objektif ölçümü tüberküloz tedavisi sırasında direncin ortaya çıkmasını önlemede önemli olabilir. Eğer bağlılık daha doğru ve kolayca ölçülebilir, o zaman sağlık sağlayıcıları ilaç direnci gelişimini sınırlayacak bir tedavi planı geliştirebilir. Biz tek bir tahsin küçük saç örnekleri içinde birden fazla TB ilaçlar için ilk çoklu analit kütle spektrometresi paneli geliştirdik.

Çoklu ilaç panelimiz hasta başına sadece bir adet iki miligramlık numune gerektirir ve numune hacminin kaybedilmesi için katı faz çıkarma veya filtreleme adımı kullanmaz. Tedavi kursunun başlarında ölçülen uyuşturucuya maruz kalmanın objektif ölçütleri, klinisyenleri tedavi rejimindeki bireysel ilaçlarla ilgili sorunlara karşı potansiyel olarak uyarabilir. Doğru bir ilaç konsantrasyonu düzeyi ölçümü için saç örnekleri analiz gününde toz haline getirilmelidir.

Saç örnekleri elde etmek için, yazılı bilgilendirilmiş onay aldıktan sonra, ince bir etiket, iki katılımcı etiketleri, bir makas, alüminyum folyo, bir alkol mendil ve plastik bir torba açılmamış bir parça dahil olmak üzere malzemeleri hazır olsun. Makanın bıçaklarını alkol mendiliyle temizleyin. Başın arkasına gidin ve istenirse bir saç tokası kullanarak saç üst kısmını kaldırın.

Başın arkasından 30 saç teli toplayın ve elinizle sazı izole edin. Makas aşağı kafa derisi götürün ve saç saz kesti. Dikkatle alüminyum folyo üzerinde saç saz yerleştirin.

Alüminyum folyo güvenli bir şekilde bantlama, saç sazlık distal ucu üzerine ince etiket koyun. Distal uç kafa derisinden en uzak olan taraftır. Saç sazlık üstüne alüminyum folyo parçası üzerinde katlayın ve alüminyum folyo üstüne bir katılımcı etiket koymak.

Plastik torba içine alüminyum folyo parçası üzerinde katlanmış yerleştirin ve plastik torba üstüne başka bir katılımcı etiketi koymak. Saç örneklerinden ilaç çıkarma için, her saç örneğinin iki miligramını ayrı ayrı etiketlenmiş boncuk tüplerine ve iki miligram boş saç örneğini de 16 ek boncuk tüpüne tadına varın. Tartarttıktan sonra, tüm boncuk tüplerini bir boncuk değirmeni homogenizer yerleştirin ve her çevrim arasında 15 saniyelik bir dinlenme süresi ile iki 30 saniyelik döngüler için saniyede 6,95 metre hızda örnekleri homojenize.

İkinci homojenizasyondan sonra, her numuneye uygun iç standart karışımın 500 mikrolitresini ekleyin ve matris boş tüpüne 500 mikrolitre metanol ekleyin. Tabloya göre referans standart karışımı uygun hacmi ile kalibrasyon eğrisi tüpler Spike ve iki saat boyunca nazik sallayarak 37 derecelik su banyosu tüm tüpler yerleştirin. Kuluçka sonunda, yeni etiketli mikrosantrifüj tüpler içine her boncuk tüpü nden supernatant aktarın ve boncuk tüpleri metanol 500 mikrolitre ekleyin.

Girdap boncuk tüpleri ve ilgili mikrosantrifüj tüplerme metanol yıkama aktarın. Numuneleri santrifüj edin ve saç peletlerini bozmadan süpernatantları dikkatlice yeni tüplere aktarın. Tüplerdeki sıvıyı 32 santigrat derecede kurumaya kadar buharlaştırın ve numuneleri %1 formik asitle 200 mikrolitre yüksek basınçlı sıvı kromatografi sınıfı su ile yeniden oluşturur.

Girdap tan sonra, sıvı numuneleri 250 mikrolitre lik uçlarla kehribar şişelerine aktarın. Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi için, ilk olarak 2,5 mikrometre lik partikül boyutuna ve 100 angstrom gözenek boyutuna sahip, polar endcapped eter bağlı fenol boncuklar ile 2 ila 100 milimetrelik bir kolon yükleyin. Sütunun üretici tarafından önerilen koruma kartuşuna da takOlduğunu doğrulayın.

MDR-TB LCMS yöntem geçişlerinde yer alan bileşik bilgileri kopyalayın ve yapıştırın. csv dosya kitle spec penceresinde kutusuna. Elektronik tabloda, kalibrasyon eğrisi, kalite kontrolleri, hasta numuneleri, kalibrasyon eğrisi, kalite kontrolleri, hasta örnekleri, kalibrasyon eğrisi ve kalite kontrollerinin toplu sırasını oluşturun.

Kalibrasyon eğrisi, kalite kontrolleri ve hasta numuneleri öncesinde ve sonrasında ve çalıştırmanın başlangıcında ve sonunda solvent boş enjeksiyonlar ekleyin. Daha sonra analit taşımaazaltmak için kalibrasyon eğrisi ve yüksek kaliteli kontrol şişeenjeksiyonları en az sekiz solvent boş enjeksiyonlar yerleştirin. Toplu iş tamamlandığında, nicelik lendirme yazılımını açın.

Otomatik olarak seçilen bekletme süresinin doğru olduğundan emin olmak için geçişler arasında ilerleyin ve Gaussian düzlemenin 1,5 olarak ayarlanıp düzeltilmediğinden emin olun. Ardından, kalibrasyon eğrisini ve regresyonu görüntüler ve bekleme türünü x'in üzerinde bire ayarlar. Tamam'ı tıklatın ve toplu iş başarılı bir şekilde koştu emin olmak için kalibrasyon eğrisi ve kalite kontrol örnekleri doğrulayın.

Her niceleyici referans analizi için, kalibrasyon noktalarının en az üçte ikisinin %80-120 içinde bir doğruluk payına sahip olması gerekir. Yukarıdaki koşulların tümü yerine getirilirse, toplu iş geçti ve örnekler ölçülebilir. Araç çubuğunda Edit'i tıklatın ve Tüm Tabloyu Kopyala'yı tıklatın.

Daha sonra tabloyu bir elektronik tabloya yapıştırın ve her numunenin bildirilen konsantrasyonunu belirlemek için iki numune enjeksiyonunun hesaplanan konsantrasyonunun ortalamasını kullanın. Burada tüm test edilen 11 ilaca dirençli TB ilaçların doğrulanmış düzeyleri ile bir kromatogram bir örnek gösterilir. Bu rakamlarda, kalibratörlerden birinde belirli bir ilaç için çıkarılan iyon kromatogramları görülebilir.

Niceleyici ve niteleyici geçişleri, niceleyicinin alanı ile niteleyici alanı arasındaki oran numuneler arasında sabit kaldığı ndan ilacın varlığını nitel olarak doğrulamak için kullanılır. Her numune enjeksiyonunun normalleştirilmesini sağlamak için dahili standart da izlenir. Bu analizde, Güney Afrika'nın Western Cape kentinden doğrudan gözlenen tedavi koşulları altında ilaca dirençli tüberküloz ilaçları alan 96 hastanın toplam çalışma popülasyonu arasında 15 saç örneğinin uygun bir örneği, her bir analit için en düşük ve en yüksek düzeyde ilaca dirençli tüberküloz ilaçlarının temsili düzeylerini belirlemek için değerlendirilmiştir.

Katı bir faz çıkarma veya filtreleme adımı yokluğunda, supernatant buharlaşma tüpleri içine aktarırken dikkat edin. Tüplere aktarılan her şey kolona enjekte edilebilir. Boncuk raptor rotoru sıkıca vidalı veya kilitli değilse uçabilir gibi, çalışmadan önce rotor çift kontrol ettiğinizden emin olun.

HIV alanında antiretrovirallerin aksine, Tüberküloz ilaç farmakokinetiği, bağlılık ve klinik sonuçlar arasındaki ilişki büyük ölçüde incelenmemiş tir. Bazı tüberküloz ilaçlarının saçta iyi birikmediğini varsaydık. Bu ilaçların metabolitlerinin hedeflanması hasta yayı hakkında daha iyi bir anlayış sağlayabilir.