Farenin Ventral Tegmental Alanı İçinde Optogenetik Kullanarak İki Farklı Gerçek Zamanlı Yer Tercihi Paradigması
February 12th, 2020
Burada farelerde optogenetik kullanarak yer tercihi paradigmaları için adım adım takip edilmesi kolay iki protokol salıyoruz. Bu iki farklı kurulumkullanılarak, tercih ve kaçınma davranışları, yüksek mekansal ve zamansal seçicilik ile aynı cihaz içinde ve basit bir şekilde sağlam bir şekilde değerlendirilebilir.
Burada belirli bir beyin bölgesinin genetik stimülasyon ödüllendirici veya aversive özelliklerini değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Belirli hücrelerin uyarılması ödüllendirici veya aversive ise teknik hızla cevap verebilir. Ventral tegmental alanı uyarmak için kurulum tarif ama protokollerimiz kolayca farklı bölgeler açısından belirli parametreleri değiştirmek için adapte edilebilir okudu.
Başlamak için, lazer kaynağını kontrol etmek için tek kartlı mikrodenetleyiciler kullanın. Bilgisayara uygun bağlantı kablosunu kullanarak komut dosyasını mikrodenetleyici panosuna yükleyin. Komut dosyası, izleme yazılımından bir TTL kutusu aracılığıyla gelen dış modülasyon ve stimülasyon parametrelerini kontrol etmek için lazere bir çıkış içerir.
TTL kutusunu tahtaya bağlamak için bir ağ kablosu kullanın. Lazerin harici modülasyon la kontrol edilebilmesi için ayarlandığından emin olun ve lazeri FC/PC kablosu kullanarak tahtaya bağlayın. Uygun pimleri tahtanın zemin parçalarına bağlayın.
Lazer kaynağını optik fibere bağlamak için, önce lazer kaynağını döner bir derkiye bağlayın. Bir yama kablosunu döner derkiye bağlayın. Döner dergiyi cihazın üzerinde, ancak kayıt alanının dışında sabitle.
Fiber optik yama kablosunun uzunluğunun, farenin arenada zorluk olmadan hareket etmesine izin vermek için uygun olduğundan emin olun. Arena kurulumayarlamak için, fiziksel cihazın belirli bir bölümünü ölçmek için bir cetvel kullanın. Yazılımda, ölçülen parçaya karşılık gelen bir çizgi çizin.
Kalibrasyon sekmesine Ayarla Ölçeği'nin altında, zaten bilinen değeri girin. Arenayı tasarla, farelerin hareketinin kaydedeceği alanı çiz. Bölgeleri oluşturun, sonunda lazer eşli, lazer leeşmemiş ve nötr olarak atanacak bölgeleri çizin.
Örneğin, arenanın dışındaki bölgeler gibi çakışan bir parametre olmadığını doğrulamak için kurulumu doğrulamak için Kurulumu Doğrula düğmesine basın. Donanım denetiminin etkin olduğundan emin olun ve denemenin saatini başvuru kutusu ayarlarındaki yineleme til seçeneğine göre 30 dakika olarak ayarlayın. Faregirişinin izleme yazılımı aracılığıyla mikrodenetleyici panosuna koşul ayarları altında TTL sinyalini tetikleyeceği lazer eşli olarak bir bölme atayın.
Nötr bölme tercihi yaklaşımının kurulumunu değiştirmek için, arena ve zaman kurulumundan sonra, a ve b bölmelerinin ayarlarıyla ilgili koşul kutusu için merkez noktası A ve bölge B'den herhangi birinde yken eklenerek hem A hem de B bölgelerini lazer le eşlenmiş olarak atayın. Algılama ayarlarını ayarlamak için fareye benzemek için bir kukla kullanın. Kuklayı aygıtın bir bölmesine yerleştirin ve dinamik çıkarma ile otomatik kurulum kullanın.
Kuklayı çıkarın ve karşı bölmeye yerleştirin. Kuklanın tam olarak tespit edildikinden emin ol. Kuklayı lazerle eşleştirilmiş bölmeye yerleştirin.
Uyarım işe yarayıp yaramadığını kontrol etmek için, önceden yapılandırılmış deneme denetimi ayarlarını kullanarak edinmeye başlayın ve uyarımın olması gerektiği gibi tetiklenip tetiklenmeyişe bak. Daha sonra mankeni eşleşmemiş veya nötr bölmeye yerleştirin ve uyarımDurdurulup durdurulmamadığına bakın. Lazer gücünü 10 miliwatt'a ayarlamak için lazerin üzerindeki bilemiyi kullanın.
Fiber optik implantı seramik bir kılıf kullanarak fiber optik yama kablosuna bağlayın ve fareyi üç bölmeli aparatın nötr bölmesine yerleştirin. Fare yazılım tarafından algılanana kadar bekleyin. Hayvanın ana bölmelere girmesini kısıtlayan dikey sürgülü kapıları çıkarın.
Hayvanın herhangi bir rahatsızlık duymadan özgürce keşfetmesine izin verin. Tüm gerçek zamanlı yer tercihi denemesi sekiz oturum boyunca gerçekleşir. Ventral tegmental bölgede AAV channelrhodopsin EYFP virüsü enjekte edilen DAT-Cre farelerdopaminerjik nöronları hedef almak için test edildi.
Fareler, %20'lik eşleşmez bölmenin ve %10'luk nötr kompartmanın aksine, zamanlarının ortalama %70'ini ventral tegmental bölgede AAV channelrhodopsin EYFP enjekte edilen Vglut2-Cre farelerile gözlenmiştir. Fareler, stimülasyonla eşleşen bölmeden kaçındı ve eşleşmemiş bölmede daha fazla zaman geçirdi. Koşullu tepkiler gün beş ve sekiz sırasında, fareler daha önce eşleştirilmiş bölmesi net bir kaçınma göstermedi.
Belirli nöronların ödüllendirici veya aldatıcı rolünü daha fazla göstermek için, açıklanan yöntem operon paradigmaları veya fotogenetik substimülasyon gibi diğer yöntemlerle iltifat edilebilir. Virüsleri kullanırken ve lazer kaynaklarını kullanırken dikkat edin.
Genel Bakış
Bu makale, farelerde optogenetik kullanarak yer tercihi paradigmaları için iki protokolü sunar ve bu protokollar, tercih ve kaçınma davranışlarının yüksek mekansal ve zamansal seçicilikle değerlendirilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Davranışsal Analiz
- Optogenetik
Arka Plan
- Beyin stimülasyonunun ödülleyici ve hoşnutsuzluk yaratan özelliklerini anlamak, sinirbilimde çok önemlidir.
- Optogenetik, nöronal aktivitenin hassas kontrolünü sağlar.
- Yer tercihi paradigmaları, stimülasyonlara yönelik davranışsal tepkileri değerlendirmek için sıkça kullanılır.
- Bu çalışma, ventral tegmental alan ve ödül işlemedeki rolüne odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Optogenetik stimülasyonun fare davranışları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için protokoller geliştirmek.
- Spesifik nöronal stimülasyonun tercih ve kaçınma üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Farklı beyin bölgeler için uyarlanabilen esnek bir kurulum sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Lazer stimülasyonunu kontrol etmek için tek kart mikroişlemcilerinin kullanımı.
- Fare hareketlerinin doğru takibi için deneysel arenanın kalibasyonu.
- Stimülasyonun fare davranışlarıyla senkronize edilmesi için TTL sinyallerinin uygulanması.
- Farklı fare genotipleri ile yapılan birden fazla oturumda davranışsal tepkilerin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- DAT-Cre fareleri, lazerle eşleştirilmiş bölmede tercih gösterdi ve zamanlarının %70'ini burada geçirdi.
- Vglut2-Cre fareleri, lazerle eşleştirilmiş bölgeden kaçındı.
- Davranışsal tepkiler, testin farklı günlerinde değişti.
- Yöntem, daha fazla doğrulama için diğer tekniklerle tamamlanabilir.
Sonuçlar
- Protokoller, spesifik nöronal stimülasyonun davranış üzerindeki etkilerini incelemek için güvenilir bir yöntem sunar.
- Sonuçlar, genetik arka plana dayalı farklı davranışsal fenotipler olduğunu gösterir.
- Ek metodolojiler kullanılarak bu bulgular üzerinde daha fazla araştırma yapılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Assessing the rewarding or aversive properties of neuronal stimulation is critical for target validation in neuroscience-driven drug discovery. Real-time place preference paradigms enable rapid, causal interrogation of specific neural circuits, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. This approach provides quantitative behavioral readouts that inform go/no-go decisions in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables causal testing of whether stimulation of a defined neuronal population produces reward or aversion phenotypes.
- Operational Value: Provides real-time, quantitative behavioral readouts with high temporal resolution to support hypothesis interrogation.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking neuronal activation to measurable behavioral outputs relevant to neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized, reproducible behavioral assay for screening neuromodulatory targets using optogenetic stimulation.
- Quantitative Output: Generates time-in-compartment metrics that serve as dependent variables for evaluating stimulation effects across genotypes or conditions.
- Scalability: Protocol can be adapted to different brain regions and stimulation parameters, enabling cross-target screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Ventral tegmental area stimulation models mesolimbic pathway function, relevant to reward-related disorders and addiction therapeutics.
- Translational Continuity: Real-time behavioral readouts bridge acute neuromodulation studies with longer-term conditioned place preference assessments.
- Mechanistic De-risking: Helps distinguish direct neuronal effects from compensatory network responses, reducing ambiguity in target mechanism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where circuit-level target validation precedes lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining if optogenetic activation of specific neurons drives reward or aversion behaviors.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating neuromodulatory targets across different genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables (time spent in laser-paired, unpaired, neutral compartments) for statistical comparison of stimulation effects.
- Translational Research: Connects acute neuronal stimulation effects to behavioral phenotypes with relevance to preclinical models of reward processing.
- Enterprise Reuse: Framework can be standardized across labs and adapted to various brain regions, promoting platform-level reuse in neuroscience discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers mechanistic insight into neuronal causality, reducing false positives in target selection.
- Operational Value: Enables high-throughput behavioral assessment with automated tracking and real-time stimulation control.
- Strategic Value: Improves confidence in target modulation strategies, supporting better resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral validation of circuit-specific effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, viral vector delivery, and stereotaxic surgery for precise neuronal targeting.
- Depends on integrated hardware including microcontrollers, lasers, rotary joints, fiber optics, and behavioral tracking software.
- Necessitates cross-team standardization between neuroscience, engineering, and data analysis groups for consistent setup and calibration.
- Must account for variability in opsin expression, fiber placement, and laser power delivery across subjects.
- Limited to acute behavioral effects; does not assess chronic adaptation or compensatory mechanisms without complementary longitudinal studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Setting up the Control of the Laser Source
1:44
Setting Up the Experiment for the RT-PP (Real-Time Place Preference) Approach and NCP (Neutral Compartment Preference) Approach
3:13
Performing an Experiment Using Laser Stimulation
4:24
Results: Real-Time Place Preference Experiment
5:18
Conclusion
