Name: Fare Adrenallerinde Çokkatlı İmmünoboyama için Mikrowaving ve Florosofor-Tyramide - Aynı Konak Türlerinden Konjuge Olmayan Birincil Antikorların Kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Öğrenin fare adrenal dokularında çokkatlı immünoboyama tekniklerini. Mikrodalga destekli antikor soyma ve florofor-tiramid kullanarak çapraz reaktiviteyi önleyin. Bu yöntem aynı konak türünden konjuge olmayan birincil antikorlarla güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH R00 HD00 HD032636 tarafından desteklenmiştir.

1. İlk Antikor ile Boyama
<ol><li>Aşağıdaki adımların her birine ayrılan 5 dk ile dewax ve rehydrate FFPE slaytlar: ksilen veya eşdeğer reaktifler 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x, ve distile su 2x. NOT: Slaytlar bu rehidrasyon adımından başlayarak son adıma kadar nemli kalmalıdır.</li>
	<li>İsteğe bağlı antijen alımı için slaytları 8 dk kaynar sodyum sitrat çözeltisinin (10 mM, pH = 6,0) 275 mL'sine yerleştirin. Çözeltinin kaynamasını sağlamak için, slaytları 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) pipet ucu kutusunun altına düz bir şekilde yerleştirin ve çözeltiyi 8 dk boyunca 700 W mikrodalga fırında %70 güçte pişirin. Daha sonra pipet ucu kutusunu mikrodalga fırından çıkarın, kapağı açın ve çözeltinin oda sıcaklığında (RT) en az 20 dakika soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Slaytları PBST içeren bir Coplin kavanozuna aktarın (fosfat tamponlu salin %0.1 polisorbat 20/80). 5 dk 3x PBST ile yıkayın. Hemen bir sonraki adıma geçmezseniz, pbst ile bu adımda slaytları rt'de bir Coplin kavanozunda birkaç saat veya 4 °C'de 1-2 gün boyunca saklayın.</li>
	<li>Engelleme çözeltisini hazırlamak için sekonder antikor türünün normal serumunu bloke reaktifi olarak kullanın. Diğer ticari engelleme reaktifleri de kullanılabilir. Bu çalışmada sunulan çalışmada kullanılan normal serum kullanıyorsanız, PBST 4.9 mL için normal eşek serumu 100 μL ekleyin. Engelleme çözeltisi 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.</li>
	<li>Engelleme için, slaytlardan PBST'yi silkeleyin ve hızlı bir şekilde yeterli engelleme çözümüyle kaplayın. 30 dakika boyunca nemli bir odada RT slaytlar kuluçka.</li>
	<li>Birincil antikor çözeltisini istenilen konsantrasyona seyreltmek için bloklama çözeltisini kullanarak birincil antikor çözeltisini (iki slayt için 500°L) hazırlayın. Çözelti kullanıma kadar buzda saklanmalıdır.<ol>
<li>3βHSD için, 498 μL engelleme çözeltisine 2 μL 3βHSD ekleyin.</li>
		<li>TH için, 499 μL bloklama çözeltisine 0,5 μL TH antikor ekleyin.</li>
		<li>β-catenin için, 499 μL bloklama çözeltisine 1 μL β-catenin antikor ekleyin.</li>
		<li>20αHSD için, 499 μL engelleme çözeltisine 1 μL 20αHSD antikor ekleyin.</li>
		<li>CYP2F2 için, 498 μL engelleme çözeltisine 2 μL CYP2F2 antikor ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Slaytlardan bloke solüsyonu sallayarak ve hızlı bir şekilde yeterli birincil antikor çözeltisi ile kaplayarak birincil antikor ile kuluçka. Slaytları bir gece boyunca 4 °C'de nemli bir odada kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında slaytlar kurumasını önlemek için küçük bir parça parafin film ile kaplanabilir.</li>
	<li>Ertesi sabah 5 dk 3x için PBST ile slaytlar yıkayın.</li>
	<li>Biyotinylated ikincil antikoru istenilen konsantrasyona seyreltmek için blokaj solüsyonu kullanarak ikincil antikor çözeltisini (iki slayt için 500°L) hazırlayın (örn. 1 μL eşek anti-fare antikorveya eşek anti-tavşan antikorunu 499 μL'lik blokaj içine çözüm). Çözelti kullanıma kadar buzda saklanmalıdır.</li>
	<li>Slaytlardan PBST kapalı sallayarak ve hızlı bir şekilde yeterli ikincil antikor çözeltisi ile kaplayarak ikinci antikor ile kuluçka. Slaytları nemli bir odada 1 saat boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. NOT: Endojen biotin bir sorun ise, biyotinylated sekonder antikor yerine peroksidaz konjuge sekonder antikor kullanın. Adım 1.10'da peroksidaz konjuge ikincil antikor kullanıyorsanız adım 1.14'e geçin.</li>
	<li>5 dk 3x için PBST ile slaytlar yıkayın.</li>
	<li>499 μL PBS'ye 0,5 μL SA-HRP ekleyerek horseradish peroksidaz konjuge streptavidin (SA-HRP) çözeltisini (iki slayt için 500 μL) hazırlayın. Son konsantrasyon 1 μg/mL'dir.</li>
	<li>SA-HRP çözeltisi ile kuluçka. Slaytlardan PBST'yi salla ve slaytları hızlı bir şekilde yeterli SA-HRP çözümüyle kaplayın. Slaytları nemli bir odada 0,5 saat boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>5 dk 3x için PBST ile slaytlar yıkayın.</li>
	<li>Florofor-tiramid çözeltisini, üreticinin talimatlarına göre seyreltme tamponu yla seyrelterek florofor-tiramid çözeltisini hazırlayın (örn. 5 μL florofor-tiramid 496 μL seyreltme tamponuna).</li>
	<li>PBST'yi slaytlardan sallayarak ve slaytları yeterli florofor-tiramid solüsyonu ile hızla kaplayarak florofor-tiramid ile sinyal gelişimini gerçekleştirin. RT'de 1 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada kuluçka. Kuluçka süresi istenilen floresan yoğunluğuelde etmek için ayarlanabilir. Slaytları PBST içeren coplin kavanozuna aktararak reaksiyonu durdurun. 3 dk 2x PBST ile slaytlar yıkayın.</li>
	<li>Sinyaller, bu aşamada sonucu doğrulamak için floresan mikroskop altında hızlı bir şekilde kontrol edilebilir. Kapak lar kullanılıyorsa, numuneleri nemli tutmak için her bir bölüme bir damla gliserol: PBS (1: 1) uygulayırın. 3 dk 2x PBST ile slaytlar yıkayın. Slaytlar bir sonraki adıma geçmeden önce 4 °C'de birkaç gün PBST'de saklanabilir.</li>
</ol>2. İlk Antikor Şerit
<ol><li>Slaytları 275 mL kaynar sodyum sitrat çözeltisine (10 mM, pH = 6,0) en az 8 dk. Slaytları 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x X x H) pipet ucu kutusunun altına düz yerleştirerek kaynamaya tutun ve çözeltiyi 700 W mikrodalga fırında %70 güçte 8 dk.'ya yerleştirin. Daha uzun bir sıyırma süresi tercih edilirse, slaytları her zaman tampon çözeltisine daldırılmış tutmak için kaynayan sodyum sitrat çözeltisi kullanarak tampondan üst üste alınması gerekebilir. Pipet ucu kutusunu mikrodalga fırından çıkarın, kapağı açın ve çözeltinin EN az 20 dakika boyunca RT'de soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Slaytları PBST içeren bir Coplin kavanozuna aktarın. 5 dk 3x PBST ile yıkayın. Bir sonraki adım hemen yapılmazsa, slaytları RT'de PBST ile coplin kavanozda birkaç saat veya 4 °C'de 1-2 gün saklayın.</li>
</ol>3. İkinci Antikor ile Leke
<ol><li>Engelleme adımından başlayın ve 1.5 adımdan 1.14'e kadar aynı yordamları izleyin. Sinyal geliştirme adımlarında (adım 1.15 ve adım 1.16), farklı bir floresan spektrumda florofor-tiramid kullanın. NOT: Slaytlar multipleks boyama izin vermek için bu yöntem kullanılarak birkaç kez sökülebilir. Son antikor muhabir olarak florofor-tiramid gerektirmez. Florofor konjuge sekonder antikor, son primer antikordan gelen sinyalleri göstermek için kullanılabilir.</li>
	<li>Nükleer sayaç boyama gerekiyorsa 2 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) veya 1 dk RT için Hoechst çözeltisi ile inkübat slaytlar. Daha sonra pbst ile 3 dk 2x için slaytlar yıkayın.</li>
</ol>4. Sinyalleri Tespit Etmek Için Floresan Mikroskobu Kullanarak Görüntüleme
<ol><li>İmmünofloresans için uygun montaj ortamı bir damla ile bir coverslip monte.</li>
	<li>Görüntüleme için, her floresan kanalının sinyallerini algılamak için bir floresan mikroskobu kullanın. Slayttaki dokuyu bulmak için nükleer boyama (DAPI) kanalı ve 4x lens ile başlayın.</li>
	<li>Görüntüleme için 10x lens'e geçin. Pozlama süresini (300 ms) ve ışık kaynağı yoğunluğunu (%80 yoğunluk) ayarlayın. Sinyal çok parlak veya çok koyuysa bu ayarları ayarlayın. Sahneyi hareket ettirmeden her kanalın fotoğraflarını çek. Her kanal için yeniden odaklama gerekebilir. Mikroskobun yazılımını veya ImageJ'i (imagej.nih.gov/ij/) kullanarak her kanaldaki görüntüleri birleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+simple%2C+reliable%2C+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining%3A+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li>
<li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li>
<li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043(2012).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li>
<li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li>
<li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li>
<li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMPLE%3A+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li>
<li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li>
<li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieved+endogenous+biotin%3A+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li>
<li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues%3A+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Multipleks immünboyama iki veya daha fazla antijenin hücresel kolokalizasyonunu incelemek için yararlıdır. Yaygın olarak kullanılan bu teknik, primer antikorlar farklı muhabirlerle konjuge edildiğinde (doğrudan boyama) ikna edici kolokalizasyon sonuçları verir. Ancak, doğrudan boyama genellikle birincil antikorları tespit etmek için konjuge ikincil antikorlar içeren dolaylı boyama ile karşılaştırıldığında zayıf sinyaller sağlar. Dolaylı boyamada, yüksek kaliteli multipleks immünboyama sonucu ikincil antikorların farklı p...

Multipleks immünboyama, konjuge primer antikorlar kullanılarak doğrudan boyama bilgilendirici sonuçlar sağlayabilir. Sekonder antikorlar kullanmadan, doğrudan boyama yöntemi antikor çapraz reaktivite yanlış kolokalizasyon sinyalleri düşük bir risk vardır. Ancak, konjuge muhabirler (florofor, enzimler) veya primer antikor üzerinde biotin gelecekteki kullanımını sınırlamak. Alternatif olarak, dolaylı immünboyama genellikle etiketli ikincil antikor ile konjuge olmayan bir primer antikor kullanarak güçlü sinyaller sağlar. İdeal olarak, multipleks immünboyama kullanılan konjuge olmayan primer antikorlar antikor çapraz reaktivite önlemek için farklı konak türlerden gelmelidir. Ancak, farklı konak türlerden birincil antikorların uygun kombinasyonu her zaman mevcut değildir.
İstenmeyen bir primer antikorile tepki gösteren sekonder antikor riskini ortadan kaldırmak için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Yaygın yöntemlerden biri, ikinci primer antikor1ile boyama dan önce ilk primer antikor kompleksinde kalan bağlayıcı epitopları engellemek için F(ab) monomerik antikor kullanımıdır. Batı leke tabakasının şerit ve reprobuna benzeyen antikor sıyırma, 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB)2 ve floresan tiramidbirikimi3 gibi saptanabilir muhabir moleküllerin birikimini sıyırma olmadan daha önce lekeli antikor kompleksini kaldırır. Bu yöntemle, farklı renklerdeki muhabir moleküller aynı slaytta çok katlı bir sonuç gösterebilir. Multipleks boyama da antikorların daha önce birikmiş katmanları nın tamamen kaldırılması ve diğer antikorlardan sonradan edinilen görüntülerin hizalanması ile elde edilebilir4,5. Her yöntemin kendi sınırlamaları olmasına ve karmaşık prosedürler veya özel bir görüntüleme sistemi gerektirmesine rağmen, bu yöntemlerin tümü güvenilir sonuçlar verir.
Bu protokol, yaygın olarak kullanılan arabelleklerin kullanımı yla birlikte bir antikor sıyırma yönteminin uygulanmasını gösterir. Bu protokol, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) fare adrenal kesitlerinde aynı konak türden iki etiketsiz birincil antikor içeren çok katlı immünoresan boyama yapmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Antifade Montaj Ortamı Vektör</td><td>Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile eşek anti-fare</td><td>JacksonImmuno</td><td>715-066-151</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Biyotinile eşek anti-tavşan</td><td>JacksonImmuno</td><td>711-066-152</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>2 & mu; damıtılmış suda g/mL</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>ECHO</td><td>Revolve 4</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz konjuge streptavidin</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-030-084</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Mikrodalga fırın, 700 W</td><td>General Electric</td><td>JEM3072DH1BB</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-CYP2F2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-374540</td><td>1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>Fare anti-TH</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-25269</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Normal eşek serumu</td><td>JacksonImmuno</td><td>017-000-121</td> PBST <td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-20 ve alfa içinde% 2 serum; HSD</td><td>Kerafast</td><td>EB4002</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Tavşan anti-3 ve beta; HSD</td><td>TransGenik</td><td>KO607</td><td>1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>Tavşan anti-TH</td><td>NOVUS</td><td>NB300-109</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Tavşan anti-&beta;-katenin</td><td>Abcam</td><td>ab32572</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Streptavidin Yaban turpu Peroksidaz (SA-HRP)</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-303-084</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>TSA Cy3 Tyramide</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT704B001EA</td><td>1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>TSA Floresein Tiramid</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT701001EA</td><td>1:100 seyreltme</td></tr></tbody></table>

fare adrenallerinde Çokkatlı İmmünoboyama için mikrowaving ve florosofor-tyramide - aynı konak türlerinden konjuge olmayan birincil antikorların kullanılması

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Immunostaining yaygın olarak belirli bir proteinin hücresel ifade deseni göstermek için biyomedikal araştırmalarda kullanılır. Multipleks immünboyama birden fazla primer antikor kullanarak etiketleme sağlar. Antikor çapraz reaktivitesini en aza indirmek için, dolaylı boyama kullanarak multipleks immünboyama farklı konak türlerinden etiketsiz birincil antikorlar gerektirir. Ancak, farklı tür antikorlarının uygun kombinasyonu her zaman mevcut değildir. Burada, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) fare adrenal kesitlerinde multipleks immünofluoresans için aynı konak türlerden (örneğin, bu durumda her iki antikor da tavşandan) etiketlenmemiş birincil antikorların kullanılması nın bir yöntemini tanımlıyoruz. Bu yöntem, daha önce lekelenmiş primer antikor kompleksinin aktivitesini siliklemek için antijen alma adımında kullanılan aynı prosedürü ve reaktifleri kullanır. Slaytlar genel bir immünboyama protokolü kullanılarak ilk primer antikor ile boyandı ve ardından biyotinylated sekonder antikor ile bağlayıcı bir adım atıldı. Daha sonra, bir avidin-biotin-peroksidaz sinyal geliştirme yöntemi substrat olarak florofor-tiramid ile kullanılmıştır. İlk primer antikor kompleksinin immünaktivitesi mikrodalgada kaynayan sodyum sitrat çözeltisi ile 8 dakika boyunca daldırma yoluyla çıkarıldı. Çözünmez florofor-tiramid birikimi, slayt diğer primer antikorlar ile lekeli izin örnek üzerinde kaldı. Bu yöntem çoğu yanlış pozitif sinyalleri ortadan kaldırsa da, antikor çapraz reaktivite bazı arka plan kalabilir. Örnekler endojen biotin ile zenginleştirilmiş ise, bir peroksidaz konjuge sekonder antikor kurtarılan endojen biotin yanlış pozitif önlemek için biyotinylated ikincil antikor yerine kullanılabilir.

Sonuçlar, antijen alma adımı 1.2 de dahil olmak üzere açıklanan tüm adımlarla tedavi edilen örneklerden elde edildi. Burada kullanılan tüm sekonder antikorlar biyotinylated edildi. Florofor-tiramid birinci ve ikinci primer antikorlardan gelen sinyalleri geliştirmek için kullanıldı. Görüntüler, FITC küpü (yeşil floresan için), TxRED küpü (Cy3 için) ve DAPI küpü (DAPI için) ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak çekildi.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Aynı konak türün primer antikorları kullanılarak multipleks immünboyama için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Burada, formalin-sabit parafin gömülü fare adrenal bölümlerinde multipleks immünboyama sırasında antikor çapraz reaktivitesini engellemek için mikrodalga aracılı antikor sıyırma ve florofor-tiramid kullanımını açıklıyoruz.

Fare Adrenallerinde Çokkatlı İmmünoboyama için Mikrowaving ve Florosofor-Tyramide - Aynı Konak Türlerinden Konjuge Olmayan Birincil Antikorların Kullanılması

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

Immunostaining yaygın ilgi bir proteinin yerini belirlemek için biyomedikal araştırmalarda kullanılır. Multipleks immünboyama farklı primer antikorlar kullanarak aynı örnek üzerinde birden fazla hedef tespit edebilirsiniz. Bu yöntemin yararı, aynı konak türlerden iki veya daha fazla etiketlenmemiş birincil antikor kullanarak immünboyama sağlayan antikor çapraz reaktivite ortadan kaldırmak için yaygın olarak kullanılabilir tamponlar kullanılmasıdır.Prosedürü gösteren Sophia Zheng, yüksek lisans öğrencisi ve Qiongxia Lyu, benim laboratuvar misafir bilim adamı olacaktır. Boyama önce, de-wax ve rehydrate formalin-sabit parafin gömülü slaytlar her çözeltide beş dakikalık daldırma ile belirtildiği gibi. İkinci distile su daldırma sonra, bir kapak ile bir pipet ucu kutusunun altına 275 mililitre kaynar sodyum sitrat çözeltisi slaytlar yerleştirin ve 8 dakika boyunca% 75 güç 700 watt mikrodalga içine kutu yerleştirin.Tedavinin sonunda, kapağı açın ve bir Coplin kavanozda taze PBST üç beş dakikalık yıkar ile slaytlar yıkamadan önce oda sıcaklığına çözelti soğumasını bekleyin. Spesifik olmayan bağlama sitelerini engellemek için, son yıkamadan sonra her slayttaki fazla PBST'yi sallayın ve slaytları uygun bir engelleme çözeltisinin yeterli hacmiyle kapatın. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika kaldıktan sonra, her slayttan fazla engelleme çözeltisini sallayın ve her numuneye ilgi çekici ilk birincil antikordan 250 mikrolitre ekleyin.Örneklerin kurumasını önlemek için, slaytlar bir parça parafin film le kaplanabilir. Nemlendirilmiş bir odada dört derece santigrat bir gecede kuluçka sonra, yıkama başına beş dakika taze PBST ile slaytlar üç kez yıkayın. Fazla PBST'yi silkeleyin, oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada bir saatlik kuluçka için her slaytı 250 mikrolitre uygun ikincil antikor çözeltisi ile hızlı bir şekilde kapatın.Kuluçka sonunda, gösterdiği gibi taze PBST slaytlar üç kez yıkayın ve her slayt taze hazırlanmış streptavidin horseradish peroksidaz 250 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, taze PBST slaytlar üç kez yıkayın. Sonra aşırı PBST kapalı sallamak ve taze hazırlanmış florofor-tiramid çözeltisi 250 mikrolitre ile her slayt kapağı.Bir dakika sonra, taze PBST slaytlar batırın taze PBST üç iki dakikalık yıkayıyor ardından taze PBST. Son yıkamadan sonra, bölümlere bire bir gliserol-pBS çözeltisi birkaç damla uygulayın ve floresan mikroskopi ile bir floresan sinyal varlığını kontrol edin. İlk antikor kompleksini soymak için, antikor etiketli slaytları 275 mililitre kaynar sodyum sitrat çözeltisine en az sekiz dakika yerleştirin.Tedavinin sonunda, kapağı açın ve kaydırma başına beş dakika PBST ile üç kez yıkamadan önce çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. İkinci hedef proteini lekelemek için, gösterildiği gibi nonspesifik ciltleme için bloke sonra, her örnek ile etiket 250 mikrolitre ilgi ikinci birincil antikor bir gecede. Ertesi sabah, oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için uygun bir ikincil antikor çözeltisi 250 mikrolitre ile her slayt kapsayan önce yıkama başına taze PBST beş dakika boyunca slaytlar üç kez yıkayın.Kuluçka sonunda, gösterdiği gibi taze PBST slaytlar üç kez yıkayın ve her slayt taze hazırlanmış streptavidin horseradish peroksidaz 250 mikrolitre ekleyin. Üç PBST yıkama sonra, ilgi ikinci hedef protein için sinyal geliştirmek için, farklı bir floresan spektrumda florofor konjuge tiramid ile slaytlar tedavi. Tiramid sinyal gelişimini durdurmak için slaytları PBST'ye batırın.Sonra uygun bir nükleer boya ile örnekleri leke. Floresan mikroskobu ile görüntüleme için, bir coverslip uygun bir montaj ortamı bir damla ile etiketli slayt her nükleer boya monte. Slayttaki dokuyu bulmak için 4X hedefini kullanın.Görüntüleme için 10X hedefine geçin ve ışık kaynağı %40 ila %80 yoğunlukta pozlama süresini 100 ila 400 milisaniyeye ayarlayın. Sonra sahne hareket etmeden her kanalda görüntüleri elde. Her kanaldan görüntüler çokluk floresan görüntü oluşturmak için birleştirilebilir.Birinci ve sekonder antikor boyama arasında sıyırma olmadan, tirozin hidroksilaz için ikinci boyama yanlış pozitif tirozin hidroksilaz boyama sonuçlanan ilgi ilk hedef protein sinyalleri alacak, örneğin adrenal korteks içinde bu örnekte. İlk immünboyama gelen horseradish peroksidaz antikor çapraz reaktivite kaldırmak için, bir dakika ve sekiz dakikalık mikrodalga aracılı sıyırma temiz çift boyama sonuçları ile sonuçlanan yapılabilir. Negatif kontrol örneklerinde anlamlı bir sinyal alınmaz.Kaynama sitrat tampon sekiz dakikalık sıyırma da yaygın adrenal bezi kullanılan birçok antikorlar için antikor çapraz reaktivite ortadan kaldırmak için yeterlidir. Bazı durumlarda, zayıf bir yanlış pozitif sinyal hala tespit edilebilir, ancak, ve mikrodalga tedavisi için 20 dakikalık bir artış hala tamamen antikor çapraz reaktivite kaldırmak olmayabilir. Floresan görüntüleme sırasında, kanal değiştirirken sahneyi hareket ettirmemek önemlidir.Ancak, her kanalın net görüntülerini elde etmek için odağı yeniden yeniden düzenlemek gerekebilir. Her kanal için, sinyallerin görüntülerde aşırı pozlanmış piksel veya alan olmadan uygun şekilde açığa alındığından emin olmak için pozlama süresini ayarladığından emin olun. Boyama işlemi sırasında, slaytlar de-waxing sulu tutmak önemlidir ve slaytlar multipleks boyama izin vermek için aynı sıyırma yöntemleri birkaç kez kullanılarak elimden alınabilir.

microwaving-fluorophore-tyramide-for-multiplex-immunostaining-on

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, aynı konakçı türden birincil antikorları kullanarak multipleks immün boyama gerçekleştirmek için bir testi göstermektedir. Bu yöntemde, bir adrenal doku bölümü iki aşamalı bir immün boyama işlemine tabi tutulur. Başlangıçta, kesit korteksteki belirteçler için spesifik antikorlarla boyanır, ardından bağlı antikor çıkarılır ve medulladaki belirteçler için spesifik antikorlarla yeniden boyanır.

Aynı Konak Türlerden Primer Antikorların Kullanıldığı Bir Multipleks İmmün Boyama Yöntemi

Bu video makale, aynı doku kesitinde yetişkin hipokampal nörogenezin tüm aşamalarını tespit etmek ve ölçmek için kapsamlı bir protokolü göstermektedir. Farklı konakçı türlerden uygun antikorlar mevcut olmadığında ortaya çıkan dolaylı çoklu immünofloresan sınırlamalarının üstesinden gelmek için bir yöntem geliştirdik.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

İmmünohistokimya, dokulardaki protein lokalizasyonunu ve ekspresyonunu değerlendirmek için güçlü bir laboratuvar tekniğidir. Kantitasyon için mevcut yarı otomatik yöntemler öznelliği ortaya çıkarır ve çoğu zaman tekrarlanamaz sonuçlar yaratır. Burada, multispektral görüntüleme kullanılarak çoğullanmış immünohistokimya ve protein ekspresyonunun objektif kantitasyonu ve ko-lokalizasyonu için yöntemler tanımlanmıştır.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Burada adrenal bezlerin fareler üzerinden ayırma, dokuları düzeltmek, onları bölüm ve ayirt boyama gerçekleştirmek için bir yöntem mevcut.

Yalıtım, fiksasyon ve fare böbreküstü bezlerinin ayirt görüntüleme

Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.

Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde

Multiplex floresan immünhistokimya, bozulmamış formalin-sabit, parafin katıştırılmış (FFPE) dokusu içinde birden fazla hücre türlerinin görselleştirilmesini sağlayan gelişmekte olan bir teknolojidir. Sunulan başarılı bir 7-renk Multiplex antikor ve reaktifler optimize etmek için talimatlar, slaytlar, tasarım ve ortak sorunları önlemek için ipuçları hazırlanması sağlamak için yönergeler vardır.

Manuel Multiplex floresan Immünhistokimya 'da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Bu makalede, manuel tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) multipleks immünofloresan (mIF) protokolü ile birlikte görüntü analizi ve uzamsal analiz anlatılmaktadır. Bu protokol, laboratuvarda bulunan slayt tarayıcısına bağlı olarak slayt başına iki ila altı antijenin boyanması için formalin sabit parafin gömülü (FFPE) bölümlerle birlikte kullanılabilir.

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

Multipleks siklik immünohistokimya, tekrarlanan antijen-antikor inkübasyonu, görüntü taraması ve görüntü hizalama ve entegrasyonu kullanılarak aynı anda birden fazla belirtecin in situ tespitine izin verir. Burada, akciğer kanseri ve eşleştirilmiş beyin metastazı örneklerinde bu teknoloji ile immün hücre substratlarının tanımlanması için çalışma protokolünü sunuyoruz.

Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya

Bu protokol, murin FFPE melanom dokularının DNA barkod tabanlı görüntülenmesi için bir multipleks immünofloresan antikor paneli tasarlamak için adım adım bir kılavuz sağlar. Ayrıca, murin melanom tümörü bağışıklık mikro ortamına ilişkin uzamsal proteomik içgörüler oluşturmak için açık kaynaklı araçlar kullanan bir görüntü analizi boru hattını da açıklıyoruz.

Genetik Olarak Yeniden Programlanmış Murin Melanomundan FFPE Örneklerini Analiz Etmek için DNA Barkod Tabanlı Multipleks İmmünofloresan Görüntüleme

Öğrenin fare adrenal dokularında çokkatlı immünoboyama tekniklerini. Mikrodalga destekli antikor soyma ve florofor-tiramid kullanarak çapraz reaktiviteyi önleyin. Bu yöntem aynı konak türünden konjuge olmayan birincil antikorlarla güvenilir sonuçlar sağlar.

Fare Adrenallerinde Çokkatlı İmmünoboyama için Mikrowaving ve Florosofor-Tyramide - Aynı Konak Türlerinden Konjuge Olmayan Birincil Antikorların Kullanılması (Video) | JoVE Journal

Fare Adrenallerinde Çokkatlı İmmünoboyama için Mikrowaving ve Florosofor-Tyramide - Aynı Konak Türlerinden Konjuge Olmayan Birincil Antikorların Kullanılması

Daha fazla video keşfet