Lazer Kesim Şablonlar Kullanılarak Basit Litografisiz Tek Hücreli Mikrodesenleme
3 Nisan 2020
Bu protokol, sınırlı biyomühendislik geçmişi olanlar için basit ve erişilebilir bir litografi içermeyen mikrodesenleme yöntemini tanıtır. Bu yöntem, hücre morfolojilerini modüle etmek için ilgi çekici bir şekilde hücre dışı matris proteinleri mikrodesen için özelleştirilmiş lazer kesim şablonlar kullanır. Mikro desenleme prosedürü indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak gösterilmiştir.
Fotolitografi ve yumuşak litografi ile ilişkili birçok engeli aşan şablon bazlı litografisiz tek hücreli mikrodesen yöntemini açıklayacağız. Şablonlar yeniden kullanılabilir ve süreç ucuz ve özelleştirilebilir. Bu yöntem, mühendis olmayan araştırmacıların çeşitli fizyolojik ve patolojik bağlamlarda hücre şekli ve alana bağlı mekanotransdüksiyonu incelemeleri için yeni bir yol açmıştır.
Ayrıca, bu protokol bir çanak yüksek iş itimi ilaç tarama ve hastalık modelleme için kullanılabilir hücrelerin binlerce mikrodesenleme sağlar. Görsel gösteri iki önemli adımın implantasyonunu kolaylaştıracaktır: kapak kaymasının hidrojelden ayrılması, kalıbı yerleştirmeden önce hidrojelin yeterince kurutulması. El yazmasında açıklandığı gibi yeni bir 50 mililitrelik propilen santrifüj tüp poliakrilamid hidrojel çözeltisi hazırlayın.
Daha sonra, %5 fotoinatör çözeltisini hazırlamak için, malzemeleri %100 etanolün 700 mikrolitresinde çözün. Malzemeler suda çözünür değildir bu yüzden girdap tarafından tamamen çözülür emin olun. Bir mililitrelik son hacim için 300 mikrolitre PBS ekleyin.
Buz üzerinde çalışma, buz soğuk DMEM F12 medya veya 1X PBS ile seyreltik bodrum membran matris protein stok çözeltisi optimize seyreltme oranı. Daha sonra kullanmak için buz üzerinde tutun. Bodrum membran matrisi ile çalışırken, her zaman buz üzerinde çalışmak ve soğutulmuş pipet ipuçları ve tüpler buz soğuk çözeltiler kullandığınızdan emin olun.
Biyolojik bir güvenlik kaputuna uv tezgah lambası yerleştirin. Daha sonra, daha önce hazırlanmış steril parafin filmleri yerleştirin. Parafin filmleri tamamen kuru değilse, artık sıvıyı çıkarmak için bir vakum aspirasyon sistemi kullanın.
Otoklavlı forceps kullanarak, parafin film altı her Petri çanak altı otoklavlı kapakları yerleştirin. UV çapraz bağlanabilir poliakrilamid nihai çözeltisini hazırlamak için, fotoinitiatatör çözeltisini poliakrilamid hidrojel öncül çözeltisi ile seyreltin. 0,22 mikrometre gözenek boyutuna sahip 50 mililitrelik filtre ünitesi ni kullanarak çözeltiyi sterilize edin.
Sonra Petri kaplarında altı cam kapaklarıher üzerine UV çapraz bağlanabilir poliakrilamid nihai çözüm 200 mikrolitre dağıtmak. Otoklavlı forsepskullanarak, her coverslip'i iki kapak arasında çözeltinin bir tabakasını kaplayan ikinci bir kapak kaymasıyla dikkatlice kaplayın. Kapakları içeren Petri kaplarını UV tezgah lambasının altına kapağı kapalı olarak yerleştirin.
Beyaz olmayan yüzeyde beyaz kağıt kapsama UV yoğunluğu kaybını en aza indirmek için önemlidir. UV ışınlarından korunmak için lambayı alüminyum folyo ile kaplayın. Poliakrilamid hidrojelleri beş dakika fotopolimerize edin.
Her bir kapak çiftini dikkatlice ayırmak için bir jilet kullanın. Altı hidrojel coverslip kompozit içeren rezervuarı PBS ile doldurun. Beş dakika durulama sonra, Petri kabındaki parafin filmine hidrojel coverslip kompozitleri geri verin.
Eksi 80 santigrat derecede depodan bir tüp Sulfo-SANPAH alın. Tüpe 1, 200 mikrolitre önceden soğutulmuş PBS ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Petri kabındaki parafin filminüzerine seyreltilmiş Sulfo-SANPAH'ın 200 mikrolitresini dağıtın.
Sulfo-SANPAH'a temas eden hidrojel ile Sulfo-SANPAH üzerine hidrojel coverslip kompozit yerleştirin. Daha sonra, UV lambası altında hidrojel coverslip kompozit yerleştirin ve Sulfo-SANPAH etkinleştirmek için beş dakika maruz. Sulfo-SANPAH başarılı aktivasyon ve birleşme gösteren turuncudan kahverengiye dönerse, 10 dakika içinde sonraki adımlara ilerleyin.
Tek kullanımlık polipropilen hazneyi taze PBS ile yeniler. Aktif hidrojel coverslip kompozitleri rezervuara aktarın ve bağlanmamış Sulfo-SANPAH'ı çıkarmak için kısa bir süre durulayın. Petri tabaklarında parafin filminin üzerine hidrojel coverslip kompozitleri yerleştirin ve steril tiftiksiz mendillerle dikkatlice damlayın.
Her hidrojel coverslip kompozit üstüne bir şablon yerleştirin. Şablon ve kompozit arasında sıkı bir mühür sağlamak için, otoklavsız mendil ile dabbing tarafından aşırı nem kaldırın. Her hidrojel coverslip kompozit üstüne 200 mikrolitre yerleştirerek seyreltilmiş bazal membran matris protein çözeltisi dikkatle dağıtmak.
Yapıları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kompozitleri altı kuyulu bir tabağa aktarın. Hidrojel ve şablon arasındaki sıkı bir mühür, matris protein çözeltisinin şablonun üzerinde tutulup tutulmadığı gözlemlenerek kolayca doğrulanabilir.
Sıkı bir sızdırmazlık yapılmaması protein çözeltisinin deliklerden hızlı bir şekilde sızmasına yol açar. Kompozitleri PBS'ye tamamen batırın. Otoklavlı cımbız kullanarak, hidrojelleri yırtmadan şablonları dikkatlice ayırın.
PBS'yi kuyulardan çıkarın ve kuyuları DMEM ile doldurun. Tabağı bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuvözdeki plakayı çıkardıktan sonra DMEM'i inceleyin.
DMEM bulutlu değilse, hidrojel coverslip kompozitler hücre kaplaması için kullanılmaya hazırdır. Şablonlar kareler ve dikdörtgenler dizileri içeren imal edildi. Mikro desenli hidrojel substratları şablonlardan oluşturuldu ve matris proteinin adalarından elde edildi.
Hücre adaları da elde edildi. Örneğin, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit adaları. Matris protein konsantrasyonu uygun desenleri üreten önemli bir rol oynadı.
Optimal konsantrasyon proteinlerin homojen bir dağılımına yol açtı. Suboptimal matris protein çözeltisi konsantrasyonları suboptimal desenleme yol açtı. Şablonun ön tarafını kullanmak çok önemlidir.
Şablonun arka yüzü kullanılırsa, matris protein adalarının boyutu lazer kesim in yönüne bağlı olarak artar. Şablonun arka tarafını kullanmak dikdörtgen desenlerin genişliğini önemli ölçüde etkilemezken, yükseklik önemli ölçüde artmış ve amaçlanan en boy oranında bir azalmaya yol açmıştır. Silikon elastomer yüzeylere şablon bazlı desenleme uygulandı.
Silikon elastomer substratlar üzerindeki desenli kardiyomiyositler düşük büyütmede kardiyak troponin T immünositokimyası ve yüksek büyütmede sarkonik protein alfa-aktinin ile görselleştirildi. Şablon bazlı desenleme de farklı sertlikleri ile hidrojeller yan yana desen iki kardiyomiyosit uygulandı. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrenin keşfi ve buna karşılık gelen farklılaşma protokolleri, onkogenez ve patogenezi incelemek için ideal bir in vitro insan modeli haline getirmiştir.
Ancak, IPS sistemi kullanarak önemli bir sınırlama belirli biyokimyasal bileşimi ve hücrelerle etkileşim sertliği olan mikroçevreye yapının yokluğudur. Desenleme kardiyomiyositlerin yapısını ve işlevini karakterize etmek için çekiş kuvveti mikroskobu ve immünositokimya testleri ile kombine edilebilir. Ips kaynaklı hücre tiplerinin analizi, bizim durumumuzda kardiyomiyosit, daha fizyolojik morfolojide kültür çanatositlerinde zorlu kardiyomiyositleri inceleme fırsatları açar.
Bu teknik, yüksek içerikli tarama plakaları gibi diğer birçok sistem için de uygulanabilir. Şekil ve substrat uygulamaya kolayca ayarlanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, biyomühendislik deneyimi sınırlı olan araştırmacılar için erişilebilir olan, şablon tabanlı ve litografi gerektirmeyen bir mikmodesleme yöntemini tanıtmaktadır. Yöntem, hücre morfolojilerini, özellikle de indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde modüle etmeyi sağlamak için hücre dışı matris proteinlerini mikmodeslemek amacıyla yeniden kullanılabilir lazer kesim şablonlar kullanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Biyomühendislik
- Kök hücre araştırmaları
Arka Plan
- Geleneksel fotolitografi ve yumuşak litografi yöntemleri karmaşık ve maliyetli olabilir.
- Bu yeni yöntem, düşük maliyetli ve özelleştirilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır.
- Mühendislik dışındaki araştırmacıların hücre şeklini ve mekanotransdüksiyonu incelemesine olanak tanır.
- Mikro desenleme, yüksek kapasiteli uygulamalar için binlerce hücreye uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Daha geniş bir araştırmacı kitlesinin erişebileceği basit bir mikrodesenleme yöntemi sunmak.
- Çeşitli bağlamlarda hücre morfolojisi ve mekanotransdüksiyon çalışmalarını kolaylaştırmak.
- Yüksek kapasiteli ilaç tarama ve hastalık modellemesine olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Poliakrilamid hidrojel çözeltisinin hazırlanması.
- Mikro desenleme için lazer kesim şablonların kullanımı.
- Lamine camın hidrojelden ayrılması.
- Şablon yerleşimi öncesinde hidrojelin kurutulması.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, hücre dışı matris proteinlerini başarıyla desenler.
- Hücre morfolojilerini etkili bir şekilde modüle etme yeteneğini kanıtlamaktadır.
- Bu yaklaşım ile yüksek kapasiteli uygulamalar gerçekleştirilebilir.
- Görsel gösterimler, protokolün anlaşılmasını kolaylaştırır.
Sonuçlar
- Bu litografi gerektirmeyen yöntem, mikro desenleme sürecini kolaylaştırır.
- Hücre biyolojisi ve mekanotransduksiyon araştırmaları için yeni yollar açar.
- Protokol, biyomedikal araştırmalardaki geniş bir uygulama alanı için uygundur.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Bu litografi gerektirmeyen şablon tabanlı mikrodesenleme yöntemi, tek hücre analizindeki erişilebilirlik engellerini ortadan kaldırarak, uzmanlaşmış mikrofabrikasyon bilgisine sahip olmayan daha geniş Ar-Ge ekiplerinin mekanotransdüksiyon ve hücre kader tayini üzerine çalışmalar yapmasına olanak tanır. Binlerce hücrenin yüksek verimli desenlenmesini destekleyerek, hedef doğrulama ve fenotipik tarama iş akışlarındaki öngörü güvenilirliğini artırır. Bu yaklaşım, teknik karmaşıklığı ve maliyeti azaltarak, erken keşif ve preklinik model geliştirme süreçlerinde ölçeklenebilir adaptasyonu kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilişkili sistemlerde mekanotransdüksiyon yollarını incelemek için hücre şeklini ve boyutunu modüle ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: iPSC kaynaklı kardiyomiyositler ve diğer hücre tiplerini kullanarak fonksiyonel hedef doğrulaması için sağlam ve düşük maliyetli bir platform sağlar.
- Öngörü Güveni: Mekanistik varsayımların riskini azaltan kantitatif morfolojik ve fonksiyonel okumalar oluşturarak portföy seçimine destek verir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kontrollü hücre dışı matris sunumu ile standardize edilmiş mikmodesenli alt katmanlar oluşturarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki bileşik değerlendirmeleri için hazırlar.
- Operasyonel Değer: Yeniden kullanılabilir lazer kesim şablonlar ve tutarlı hidrojel tabanlı protein desenlemesi yoluyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Deney başına 2.000 hücreye kadar çıkan dizileri desenleyerek yüksek kapasiteli tarama hazırlığını destekler, doz-yanıt ve fenotipik profillemeyi kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Sistem: iPSC kaynaklı kardiyomiyositler için geçerli olup, kalp hastalığı bağlamlarındaki fizyolojik mekanotransdüksiyonu daha iyi modelleyen yetişkin benzeri dikdörtgen morfolojilerin çalışılmasını sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: Farklı substrat sertliklerinde hücre yapısı ve fonksiyonunun değerlendirilmesine olanak tanıyarak keşif ve preklinik çalışmalar arasında köprü kurar; böylece biyobelirteç uyumunu ve riskle uyumlu ilerlemeyi destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hücre geometrisinin sinyal yolları üzerindeki etkisini izole ederek fenotip-genotip ilişkilerindeki belirsizliği azaltır ve in vivo translasyon için öngörü değerini artırır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre olarak, mekanistik ve fenotipik analizler için standardize edilmiş hücre hazırlığı sağlar.
- Keşif Biyolojisi: iPSC türevli modellerde mekanotransdüksiyonu incelemek için hücre şekli ve alanının hassas kontrolünü sağlayarak, hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini destekler.
- Tarama: Binlerce hücrenin tekrarlanabilir mikridesenlemesi yoluyla analiz hazırlığı ve kantitatif çıktılar sunarak, hastalık modelleme uygulamalarında güvenilir bileşik taramasına olanak tanır.
- Analitik: Ekiplerin genetik veya farmakolojik pertürbasyonlar genelinde koşulları karşılaştırmalarına yardımcı olan hücre hizalanması, protein adacığı oluşumu ve morfolojik metrikler gibi ölçülebilir çıktılar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Fibrotik veya iskemik kardiyak modellerle ilgili sertlike bağımlı yanıtları değerlendirmek için ayarlanabilir substratlar (örneğin, silikon elastomer) üzerinde desenlemeye izin vererek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Şablon tabanlı yaklaşımı projeler genelinde yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak konumlandırarak, gereksiz kurulumları azaltır ve mekanobiyoloji ile fenotipik tarama platformlarında ekipler arası benimsenmeyi sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kontrollü tek hücreli mikrodizilim yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standart hücre kültürü iş akışlarıyla uyumlu, yeniden kullanılabilir şablonlar ve hidrojel tabanlı dizilimler aracılığıyla standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Şekle bağlı fenotipik yanıtların erken tespitini sağlayarak go/no-go (devam/durdur) kararlarını iyileştirir ve kardiyovasküler ile mekanotransdüksiyon odaklı programlarda geç evre biyolojik risklerini azaltır.
- Portföy Etkisi: Hedef seçimi ve öncü bileşik optimizasyonuna temel teşkil eden, morfoloji bağlantılı yüksek içerikli veriler üreterek riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Temel hücre kültürü ve moleküler biyoloji uzmanlığı gerektirir; özel mikrofabrikasyon eğitimi gerekmez.
- UV ışık kaynağına erişime, lazerle kesilmiş şablon üretimine (dışarıdan tedarik edilebilir) ve standart hidrojel reaktiflerine (ör. akrilamid, Sulfo-SANPAH) bağlıdır.
- Tutarlı protein desenleme ve en-boy oranı kontrolü sağlamak için şablon yöneliminin ve hidrojel hazırlığının ekipler arası standartlaştırılması gereklidir.
- Adaptasyon hususları arasında substrat uyumluluğu (ör. cam, elastomerler) ve belirli hücre tipleri için hücre dışı matriks proteini optimizasyonu yer alır.
- Pratik kısıtlamalar arasında, hidrojel yırtılmasını önlemek için şablonun dikkatli kullanımı ve etkili protein immobilizasyonu sağlamak için Sulfo-SANPAH aktivasyonu sırasında hassas zamanlama gerekliliği bulunur.
