Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi
26 Temmuz 2021
Bu protokol, dev unilamellar lipid vezikülleri ile birlikte kayan kinesin motilitesini kullanarak lipid nanotüp ağlarının üretilmesi için bir süreci açıklamaktadır.
Bu protokol, bireysel nanotüplerin ana vezikülünkine benzer faz ayırma davranışı sergilediği büyük ölçekli lipit nanotüp ağlarının basit bir şekilde oluşturulmasına izin verir. Bu yaklaşımın en önemli avantajı, lipit nanotüplerini son derece paralel bir şekilde ve insan müdahalesi olmadan kendi kendine monte etmek için moleküler motorlar tarafından yapılan çalışmaları benimsememizdir. Bir kayma hareketliliği testi oluşturmak için, ilk olarak, beş milimetre arayla bir cam slayt üzerine üç set çift taraflı bant şeridi yapıştırın.
Bir kapak kaymasını bandın üzerine hafifçe bastırın ve hazırlanan akış hücresine 30 mikrolitre bir mikromolar kinesin çözeltisi ekleyin. Beş dakika sonra, hücreye 30 mikrolitre 10 mikrogram / mililitre mikrotübül çözeltisi ekleyin ve çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırarak bir laboratuvar mendili bastırın. Beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, akış hücresine 30 mikrolitre 10 mikrogram / mililitre streptavidin çözeltisi eklemeden önce hücreyi yıkama başına 50 mikrolitre oda sıcaklığında hareketlilik çözeltisi ile bir ila üç kez yıkayın.
10 dakika sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için 30 mikrolitre 10X GUV çözeltisi ekleyin. Ardından, 100 milimolar AMP-PNP çözeltisinin iki mikrolitresini ekleyin ve odayı sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Akış odasını görüntüleme için ters çevrilmiş bir mikroskopa aktarın ve uygun filtre setini seçin.
İlgilenilen bir ağın görüntüsünü elde etmeden önce kapak kaymasının yüzeyine odaklanmak için 100X yağ hedefi kullanın. Ardından görüntüyü ImageJ'de açın ve bileşik görüntü oluşturmak üzere kırmızı ve yeşil kanalları kaplamak için Görüntü, Renk ve Kompozit'i tıklatın. Görüntülemeden sonra, ilgilendiğiniz görüntüyü açın ve mikroskop için ölçeği kalibre etmek üzere Analiz Et ve Ölçeği ayarla'yı tıklatın.
Pikselleri mikrometre dönüşüm faktörüne doldurun ve Tamam'ı tıklayın. Ana GUV'den başlayan nanotüpleri izlemek için çok noktalı çizgi aracını kullanın ve uzunluğu ölçmek için Control ve M tuşlarını basılı tutun. Görüntü işleme aracı, her yeni ölçümü sonuçlar penceresine kaydeder. Tüm tüpler ölçüldüğünde, Görüntü, Ayarla ve Eşik'i seçin ve eşiği uygulamak için Uygula'yı tıklayın.
Ardından, istenen tüpün üzerine bilinen uzunlukta bir dikdörtgen çizin. Alanın tümleşik yoğunluğunu ölçmek için, Analiz Et ve Ölç'ü tıklatın Sıvı nanotüp düğümlerindeki lipit bölümlemesini belirlemek için, ilgili düğüm üzerine bir çizgi çizmek ve hem yeşil hem de kırmızı kanallardaki düğüm yoğunluğunu ölçmek için çizgi aracını kullanın. Bu temsili analizde, sıvı nanotüp ağları, sıvı düzensiz ve düzenli fazların yanı sıra fazdan ayrılmış veziküller üretmek için gösterildiği gibi üretildi.
Örneğin,% 45 doymuş lipit ve% 55 doymamış lipit ile sentezlenen veziküller, birlikte var olan sıvı düzensiz ve katı fazlara ayrılan veziküllerle sonuçlanır. Bununla birlikte, kolesterol dahil edilirse, sıvı-sıvı bir arada bulunabilir ve birlikte var olan sıvı sıralı ve sıvı düzensiz fazlara ayrılan GUV'lar yaratılabilir. Ayrıca, fazdan ayrılmış karışımlar içinde düğümler gözlemlenebilir.
Hatırlanması gereken en önemli şey, floroforları foto-ağartmadan lipit nanotüplerini görselleştirebilmek için uygun pozlama süresini ve ND filtresini seçmektir. Lipid nanotüplerinin faz davranışının bileşimini uyarlamak, hücreleri birbirine bağlayan tünelleme nanotüplerinin biyofiziğini incelemeye başlamak için minimalist bir model sistemi kullanmamızı sağlar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kayan kinesin hareketliliği kullanılarak büyük ölçekli lipid nanotüp ağlarının basit bir şekilde oluşturulmasına olanak tanır. Münferit nanotüpler, ana veziküllerinkine benzer faz ayrışma davranışı sergiler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Lipid nanotüpler, membran dinamiklerinin çalışılması için önemlidir.
- Kinezin motorları, lipid yapılarının kendi kendine düzenlenmesini kolaylaştırır.
- Lipid sistemlerindeki faz ayrımı, hücresel süreçlere dair içgörüler sağlayabilir.
- Bu yöntem, nanotüp üretiminin ölçeklenebilirliğini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Lipid nanotüp ağlarını verimli bir şekilde üretmek.
- İnsan müdahalesi olmadan kendi kendine montaj için moleküler motorları kullanmak.
- Lipid nanotüplerin faz davranışlarını incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- Kinesin ve mikrotübüller kullanılarak kayma hareketliliği (gliding motility) analizinin hazırlanması.
- Bir lam üzerinde akış hücresi oluşturmak için çift taraflı bant kullanımı.
- Kinesin ve mikrotübül çözeltilerinin ardışık olarak eklenmesi.
- Nanotüp oluşumunu kolaylaştırmak için yıkama yapılması ve streptavidin eklenmesi.
Temel Sonuçlar
- Lipid nanotüp ağlarının başarıyla üretilmesi.
- Nanotüplerde faz ayrışma davranışının gösterilmesi.
- Moleküler motorların kullanımı sayesinde yöntemin yüksek ölçeklenebilirliği.
- Membran dinamiği ve hücresel süreçlerin incelenmesindeki potansiyel uygulamaları.
Sonuçlar
- Protokol, lipid nanotüplerin üretimi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Kinesin motorlarının kullanılması, verimli bir öz-montaj sağlar.
- Bu yaklaşım, lipid biyolojisi ve membran dinamiği alanındaki araştırmaları ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Uygunluk
Kayan kinesin hareketlilik analizi kullanılarak çok bileşenli lipid nanotüp ağlarının hızlı bir şekilde üretilmesi; membranla ilişkili transport ve lipid biyofiziği için ölçeklenebilir, tekrarlanabilir in vitro modellerin oluşturulmasına olanak tanır. Bu yaklaşım, hücresel lipid tüplerinin karmaşıklığını taklit eden, ayarlanabilir ve biyolojik olarak ilgili sistemler sunarak erken aşama keşif sürecini destekler. Söz konusu yöntem, membran hedefli terapötik araştırmalarda mekanistik çalışmalar ve portföy önceliklendirmesi için öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Kontrollü ve ayarlanabilir bir sistemde membran transport mekanizmalarının incelenmesine olanak tanır.
- Lipid dinamikleri ve transportu ile ilgili moleküler hedeflerin fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Faz ayrımı ve lipid bölümlenme davranışlarını modelleyerek mekanistik risklerin azaltılmasını kolaylaştırır.
- Hastalık yollarıyla ilgili lipid-protein etkileşimleri üzerine hipotez testi için bir platform sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt analizler için lipid nanotüp ağlarının tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir hazırlanmasını sağlar.
- Analiz standardizasyonu için nanotüp uzunluğunun, genişliğinin ve lipid partisyonunun kantitatif ölçümüne olanak tanır.
- Standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak kompleks lipid sistemlerinin hızlı bir şekilde oluşturulmasını sağlar.
- Membran yapısını veya taşıma süreçlerini etkileyen bileşiklerin taranmasını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hücreler arası iletişimde rol oynayan tünelleme nanotüplerinin incelenmesi için hastalıkla ilgili bir model sunar.
- Lipid faz davranışının ve bölümlenmesinin analizine olanak tanıyarak translasyonel biyobelirteç keşfiyle uyum sağlar.
- Membran hedefli müdahalelerin keşif aşamasından preklinik doğrulamasına kadar olan sürekliliği destekler.
- Membran aktif bileşikler için preklinik model seçimindeki biyolojik belirsizliği azaltır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken dönem mekanik çalışmalardan membranla ilişkili hedefler için preklinik model geliştirmeye kadar uzanan keşif sürecine entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Lipid aracılı taşıma ve sinyalizasyon için hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Ayarlanabilir özelliklere sahip, analize hazır ve tekrarlanabilir lipid nanotüp ağları sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler için nanotüp boyutlarının ve lipid bölümlenmesinin kantitatif ölçümüne olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: In vitro mekanistik içgörüleri, hastalıkla ilgili membran fenomenleri ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla araştırma programına uyarlanabilen standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Membran biyolojisi araştırmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Karmaşık lipid sistemlerinin üretimini, standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini optimize eder.
- Stratejik Değer: Membran hedefli portföyler için karar verme süreçlerini ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Membran aktif terapötik adaylarının riskle uyumlu önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Kantitatif analiz için lipid biyofiziği ve floresan mikroskopi alanlarında uzmanlık gerektirir.
- Akış hücresi kurulumu ve görüntüleme için standart laboratuvar ekipmanlarına ihtiyaç duyar.
- Görüntüleme ve ölçüm protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Çeşitli araştırma ihtiyaçlarına yönelik bir dizi lipid kompozisyonuna ve model sistemine uyarlanabilir.
- Florofor fotobeyazlamasını önlemek için görüntüleme parametrelerinin dikkatli kontrolüne bağlıdır.
