Name: Hayvan Kokusu Sinyallerinin Örneklemesi ve Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Keşfedin hayvan iletişimindeki koku sinyallerinin kimyasal analizi için solid-phase mikroekstraksiyon ve gaz kromatografi-kütle spektrometrisi yöntemlerini. Bu teknikler uçucu bileşikleri tanımlayarak davranışsal ekoloji araştırmalarına değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Keith Holding'e Rosalind Franklin Bilim Merkezi, Wolverhampton ve Ben Mantle'daki kimyasal analizlere yaptığı yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Prof. Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini ve Floransa Üniversitesi Kütle Spektrometre merkezi üyelerine ve CNR'nin ARCA Lab, Floransa'dan Prof. Luca Calamai ve Dr. Marco Michelozzi'ye bu metodolojinin kurulmasına yardımcı oldukları için minnettarız. Makalenin örneklemesi ve analiz yöntemlerini içeren araştırma projeleri, iki Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), Büyük Britanya Primat Derneği'nden küçük bir hibe ('Duyusal zenginleştirilmiş primat') ve küçük bir araştırma hibesi ('Avcı-toplayıcıların özel bir koku alma duyusu var mı?') İngiliz Akademisi/Leverhulme Vakfı'ndan S.V. Bu metodolojiyi kurmak için gereken laboratuvar çalışmaları, Fen Ve Mühendislik Fakültesi Yıllık Finansman Yarışması'ndan (Wolverhampton) S.V.'ye de finansman sağladı.

1. Örnek toplama
<ol><li>Aşağıdakilerden biri olan örnek kokular:<ol>
<li>Alışılmış çalışma denekleri (örneğin, hayvanat bahçesi primatları) tarafından steril filtre kağıdında (örneğin, koku bezi koku salgıları) veya doğrudan şişelere (örneğin idrar) koku işareti yoluyla kendiliğinden salınanları toplayın.</li>
		<li>Eğitim çalışma deneklerinden sonra pozitif takviye eğitimi kullanarak steril pamuklu çubukları ovalayarak toplayın.</li>
		<li>Çalışma deneklerinin sedasyonundan sonra steril pamuklu çubukları ovalayarak toplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numuneleri steril 10 mL vidalı şeffaf cam şişelere yerleştirin ve FTFE/ silikon septa içeren vidalı kapaklarla kapatın. Hemen -20 °C'de saklayın. NOT: Nitril eldivenler gibi temiz kişisel koruyucu ekipman kullanmak hayati önem taşır; sık sık değiştirin; numuneler ve şişelerle doğrudan cilt temasından kaçının. Yepyeni şişelerin kullanılması tercih edilir; ancak, kullanılmış şişeler durumunda, şişeleri önceden temizlemek ve ardından aynı protokolü kullanmak çok önemlidir.</li>
	<li>Koku işaretleri her toplandığı zaman çevresel boşluklar alın. Örneğin, örnekleme ortamı (örneğin, filtre kağıdı veya çubuk) ve örnekleme yapılırken ortama maruz kalan bir kafa boşluğu şişesini toplayın.</li>
</ol>2. Numune hazırlama
<ol><li>Koku işaretli bir filtre kağıdından veya çubuğun başından yaklaşık 10 mm karelik bir bıçakla keserek ve 10 mL vidalı kafa boşluğu şişesine yerleştirerek alandaki örnekleri hazırlayın.</li>
	<li>Her numune hazırlandıktan sonra, numune alma ortamını kesmek için kullanılan bıçağı uygun bir antibakteriyel mendil ve/veya alkol kullanarak atın veya temizleyin ve iyice kurulayın.</li>
	<li>Tüm numuneleri -20 °C'de saklayın. NOT: -20 °C'de veya sahada mümkün olduğunca düşük bir alanda tercih edilir.</li>
</ol>3. Analize hazırlık
<ol><li>Numuneleri dondurucudan çıkarın ve en az 1 saat boyunca doğal olarak oda sıcaklığına ısınmaya bırakın.</li>
	<li>GC-MS'deki analitik yöntemi aşağıdaki gibi ayarlayın:<ol>
<li>SPME analiz koşulları için, ilk kullanımdan önce SPME liflerini koşullandırmak için üreticinin talimatlarını izleyin: fiber ön koşulu (5 dakika için 260 °C), numune inkübasyonu (2 dakika için 40 °C), ekstraksiyon süresi (15 dk), desorpsiyon süresi (2 dk) ve fiber sonrası durumu (20 dakika için 260 °C).</li>
		<li>Aşağıdaki GC koşullarını kullanın: sütun (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), enjektör sıcaklığı (270 °C), debi (1 mL/dk), enjeksiyon modu (bölünmez), GC fırın profili (2 dakika için 45 °C; 4 °C/dk ila 170 °C; 20 °C/dk ila 300 °C), MSD transfer hattı (280 °C). NOT: Örnek saklama süresi tutarlılığı arasında iyileştirme yapmak için analitik yöntem saklama süresi kilitlidir).</li>
		<li>Aşağıdaki MSD koşullarını kullanın: solvent gecikmesi (2,5 dk) ve tarama aralığı (29 ila 400 amu). NOT: Önceki protokollerde 10 ila 400 arasında bir aralık kullanılmıştır4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiber şartlandırma ünitesine giden temizleme gazı kaynağının açık olduğundan emin olun. NOT: SPME tertibatın otomatik örnekleyiciye doğru şekilde takılması ve otomatik numune alma tepsilerine, fiber şartlandırma ünitesine ve GC giriş portuna hizalanmış olması çok önemlidir. Yanlış hizalama SPME fiberinin hasar görmesine veya tahrip olmasına neden olabilir.</li>
</ol>4. Analiz
<ol><li>GC-MS otomatik örnekleyici tepsisinin ilk konumuna boş bir kafa boşluğu şişesi (sistem boş olarak hareket etmek için) yerleştirin. Çevresel boşluğu otomatik örnekleyici tepsisinin ikinci konumuna yerleştirin. Analiz için numuneleri otomatik numune tepsisinin sonraki konumlarına yerleştirin.</li>
	<li>Örnek tepsisteki her örneği analiz etmek için analitik bir sıra oluşturun.<ol>
<li>MassHunter giriş ekranında Sıralı | Yükleme sırası.</li>
		<li>Uygun bilgileri ekleyerek tüm boşluklar ve örnekler için sıra tablosunu tamamlayın. Tamamlanan sıra tablosunu kaydedin. NOT: Sıra tablosu için kesin bilgiler, tablo için laboratuvar biçimlendirmeye bağlı olacaktır. Minimum bilgiler normalde örnek türü, örnek adı, şişe konumu ve numarası, analitik yöntem ve veri dosyası konumu ve adını içerir (örnek adla eşleşen bir veri dosyası adının ayrılması gelecekteki veri işlemeye yardımcı olur). Analiz sırasında sıraya ek örnekler eklenebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıra | seçerek sırayı çalıştırma Sırayı çalıştır.</li>
	<li>Analizden sonra numuneleri mümkün olan en kısa sürede dondurucuya iade edin. NOT: Örneklerin yeniden analiz edilmesi mümkün olabilir, ancak bazı uçucu bileşenlerin ilk analiz sırasında tamamen çıkarılmış olabileceği ve bazı bileşiklerin 40 ° C'de termal ve bakteriyel ayrışmaya uğramış olabileceği unutulmamalıdır, bu nedenle ortaya çıkan kromatogram orijinal koku işaretini tamamen temsil etmeyebilir.</li>
</ol>5. Veri analizi
NOT: İlk veri analizi, kromatogramların saklama süresi ve pik alan verilerini elde etmek için entegrasyonunu ve ChemStation yazılımı ve NIST (Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü) kütle spektral veritabanlarını, MSD F.01.01.2317 sürümünü kullanarak zirvelerin belirsiz bir şekilde tanımlanmasını içerir. Veri analizi manuel olarak veya yarı otomatik bir yöntemle gerçekleştirilebilir. Yarı otomatik yöntem kullanılırsa, belirsiz tanımlamaları doğrulamak için bir dereceye kadar manuel veri analizi yapmak bazen faydalıdır.
<ol><li>Sol gezinti çubuğunda uygun dosyayı tıklatarak veri dosyasını açın. Toplam iyon kromatogramı (TIC) veri analizi ekranının üst penceresinde görüntülenir.</li>
	<li>RTE entegratörini kullanarak TIC'yi tümleştirmek için Kromatogram | Tümleştirme.</li>
	<li>Tümleştirme parametrelerini, 3 x taban çizgisi gürültüsünden büyük tepeler entegre olacak şekilde ayarlayın. Kromatogram | Seç MS Sinyal Tümleştirme Parametreleri. Çıkış kutusunda minimum tepe alanını uygun şekilde ayarlayın (1.0 örneklerimizde kabul edilebilir sonuçlar üretir).</li>
	<li>Zirveleri tanımlamak ve özet rapor oluşturmak için Raporları Dışarı Aktar | XLS'ye kitaplık arama sonuçları raporu. NOT: Bir kütüphane araması yapılmadan önce, görüntülenecek kitaplık eşleşmelerinin sayısı ile birlikte aranacak spektral kütüphanelerin yazılım içinde önceden ayarlanabilmesi gerekir.</li>
	<li>Elde edilen elektronik tablo raporu, her tepe noktası için tümleştirme verileri ve kimlik atamak için belirsiz bir spektral kitaplık eşleşmesi içerir. Genellikle, kitaplık kalitesi/kitaplık eşleşmesi belirsiz tanımlamayı kabul etmek için >80 olmalıdır. Elektronik tabloyu kaydedin.</li>
	<li>Doğrudan TIC'den bir tepe tanımlayın.<ol>
<li>İlginin zirvesini seçin.</li>
		<li>Tepe küçükse, sol el fare düğmesini basılı tutarak tepenin etrafına bir kutu çizerek yakınlaştırın, kutuyu tepenin üzerine uzatın ve bırakın.</li>
		<li>İmleç çizgisini tepenin en yüksek noktasına (veya hemen sonrasına) yerleşecek şekilde yerleştirin.</li>
		<li>Sağ fare düğmesini çift tıklatın ve tepe için kütle spektrumu veri analizi ekranının alt penceresinde görünecektir.</li>
		<li>Spektral kitaplıkta arama yapmak için imleci spektral pencerede herhangi bir yere taşıyın ve sağ fare düğmesini çift tıklatın. Kitaplık arama sonuçları yeni bir pencerede görünecektir.</li>
		<li>Arka plan gürültüsünü ilgi çekici bir spektrumdan kaldırmak için, önce söz konusu tepedeki sağ fare düğmesini çift tıklatın. Ardından, ilgi zirvesinin hemen önünde zirve olmayan bir alanda sağ fare düğmesini çift tıklatın. Kromatogram | Seç Spectra'ı çıkarın. Çıkarılan spektrum, veri çözümleme ekranının alt penceresinde görüntülenir ve pencere üstbilgislerindeki SCAN verilerinin yanında '(-)' görüntüler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWyatt%2C+TD+%22Pheromones+and+Animal+Behavior%3A+Chemical+Signals+and+Signatures%22">Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).</li>
<li>Heymann, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+sense-olfaction+in+primate+behavior%2C+ecology%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution.</a> American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).</li>
<li>Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22secret%22+in+secretions%3A+Methodological+considerations+in+deciphering+primate+olfactory+communication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication.</a> American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).</li>
<li>Vaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sternal+gland+scent-marking+signals+sex%2C+age%2C+rank+and+group+identity+in+captive+mandrills%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills.</a> Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).</li>
<li>Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dung+odours+signal+sex%2C+age%2C+territorial+and+oestrous+state+in+white+rhinos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).</li>
<li>Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+phylogenetic+signal+in+milliped+chemical+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Systematics+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses.</a> Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).</li>
<li>Kimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+substances+in+feces%2C+urine+and+urine-marked+feces+of+feral+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses.</a> Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).</li>
<li>Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+signals+during+pregnancy%3A+a+possible+chemical+basis+for+mother-infant+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+of+scent-gland+secretions+in+an+Old+World+monkey+%28Mandrillus+sphinx%29%3A+influence+of+sex%2C+male+status%2C+and+individual+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity.</a> Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+signals+MHC+genotype+in+an+Old+World+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Odour signals MHC genotype in an Old World monkey.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).</li>
<li>Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawliszyn%2C+J+%22Solid+phase+microextraction%3A+theory+and+practice%22">Solid phase microextraction: theory and practice</a>. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).</li>
<li>Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+scent-marking+in+captive+red-ruffed+lemurs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs.</a> American Journal of Primatology. 81 (1), 22951(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kontrol örneklerinin kullanımı, hem numune toplama sırasında oluşturulan çevresel kontroller hem de sistem boşlukları, koku işareti örneklerinin yorumlanması için çok önemlidir. Örnekleme ortamına veya enstrümantal sisteme atfedilen tüm zirvelerin koku işareti örneklerinden dışlanması gerekir, böylece herhangi bir yoruma yalnızca ilginin zirveleri dahil edilir. Bu kontroller, enstrümantasyonun 'sağlığının' değerlendirilmesinde ve izlenmesinde de rol oynayabilir.
Protokol, her ekstraksiyondan ö...

Hayvanlardaki koku sinyallerini destekleyen kimyasal değişiklikler hakkında çok az şey bilinmektedir1, ayrıca kokuların uçucu kimyasal profillerinin kaydedilmesi ve ölçülmese metodolojik zorluklar nedeniyle2. Son derece karmaşık, kimyasal matrislerle çalışırken birkaç potansiyel tuzak vardır; bunlar koku örneklerini örnekleme ve analiz ederkeniçerir 3.
Wolverhampton Üniversitesi Rosalind Franklin Bilim Merkezi'nde, kokuların ve koku izlerinin hayvanlar tarafından nasıl kullanılabileceğini anlamak için analizini yapıyoruz. Yarı-biyoseksiktriyi davranışsal ekoloji, endokrinoloji ve sitoloji ile birleştirerek koku sinyallerinin hayvan iletişiminde oynadığı rolü anlamamızı geliştiriyoruz.
Bir metodoloji geliştirdik ve daha sonra birkaç insan dışı primat (yani taçlı lemurlar, kırmızı-fırfırlı lemurlar, Japon makaklar, zeytin babunları, şempanzeler) ve diğer memeliler (örneğin kediler, inekler) dahil olmak üzere çeşitli türlerin kokularını ve işaretlerini analiz ettik. İdrar, dışkı, saç ve koku bezi koku salgıları da dahil olmak üzere çeşitli örnekleri topladık ve analiz ettik. Bu kokular ve koku işaretleri karmaşık bileşik karışımlarından oluşur ve bu nedenle analizleri için kullanılan herhangi bir metodolojinin bir tür ayırıcı teknik içermesi gerekir. Gösterildiği gibi, ilgi çekici bileşenleri çıkarmak için tekniklerin kullanılmasını gerektiren bir dizi matriste de ortaya çıkarlar.
Vaglio ve ark.4 ve diğer yazarlar tarafından yapılan önceki çalışmalar5 gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile dinamik kafa boşluğu ekstraksiyonu (DHS) kullanılırken, doğrudan solvent ekstraksiyonu6 ve karmaşık solvent ekstraksiyonları7 de kullanılmıştır. Özellikle, dinamik kafa boşluğu örneklemesi, numune matrisi için güçlü bir yakınlık gösterenler (örneğin, sulu numunelerdeki kutup bileşikleri) hariç, sonuçta tüm uçucu bileşikleri kaldıran bilinen bir inert gaz hacmi ile kafa boşluğunun temizlenmesini içerir.
Mevcut metodoloji için, GC-MS ile birlikte headspace katı faz mikroextraction (HS-SPME) tekniğini benimsedik. Özellikle, Vaglio ve arkadaşları tarafından önceki GC-MS laboratuvarında 8 ,9,10'dazaten kullanılan metodolojiyi geliştirdik ve geliştirdik.
Solventsiz ekstraksiyon teknikleri, küçük, yüksek uçucu bileşikleri analiz etmek için çok etkilidir (aksi takdirde bir numuneden kolayca kaybolabilir) çünkü bu yöntemler bileşikleri kararlı, katı faz desteği üzerinde hareketsiz hale getirebilir. HS-SPME, numune kafa boşluğundaki uçucu bileşikleri yakalamak veya sulu bir biyolojik sıvıya daldırarak çözünmüş bileşikleri çıkarmak için adsorbent polimer ile kaplanmış bir elyaf kullanır11. Polimer kaplama bileşikleri güçlü bir şekilde bağlamaz, bu nedenle GC'nin enjeksiyon portunda ısıtarak çıkarılabilirler. Bu yöntem solvent ekstraksiyon tekniklerinden daha güçlüdür ve dhs'den daha etkilidir.
Mevcut yaklaşımda numuneler cam şişeler içinde bulunur. Bu şişeler, şişenin baş boşluğunda yer kaplamak için koku işaretinin uçucu bileşenlerini teşvik etmek için hayvan vücut sıcaklığını simüle etmek için 40 ° C sıcaklığa ısıtılır. 65 μm polidimetilsiloksisan/divinylbenzene (PDMS/DVB) sorbent malzeme ile kaplanmış bir SPME elyafı kafa boşluğu ortamına maruz kalır ve numuneden uçucu bileşenler fiberin üzerine adsorbe edilir. Bir GC-MS'in giriş portunda fiberin ısıtılmasında, uçucu bileşenler fiberden desorbe edilir ve daha sonra GC ile ayrılır. MS kullanılarak her bileşen için kütle spektral parçalanma desenleri elde edilir. Bu kütle spektrumlarının kütle spektral veritabanları ile karşılaştırılmasıyla, koku işaretinin bileşenlerini belirsiz bir şekilde tanımlamak mümkün olabilir. Otomatik örnekleyici kullanarak, birden fazla örneği toplu olarak tutarlı bir şekilde analiz edebiliyoruz.
Her bir SPME lifi türünün kutup kimyasalları ile farklı bir yakınlığı olduğu göz önüne alındığında, lif genellikle hedef kimyasal bileşiklerin polaritesine ve / veya moleküler ağırlığına bağlı olarak seçilir. Ek olarak, GC koşulları GC sütununun türüne ve hedef kimyasal bileşiklerin özelliklerine bağlı olarak değiştirilir.
Bu teknik, numunedeki bileşenlerin ayrılmasını ve belirsiz tanımlanmasını sağlayarak koku işaretlerinin uçucu bileşenlerinin yarı nicel analizine ve ardından sinyalizasyonda yer alabileceğini belirten koku işaretleme bileşenlerini işaretleyebilecek eğilimleri aramak için tepe alanı oranlarının analizine olanak tanır.
Bu mevcut yaklaşımın temel güçlü yönleri şunlardır:
<ul style="list-style-type: square;"><li>Analiz edilebilen örnek türleri aralığı.</li>
	<li>Karmaşık numune hazırlama veya ekstraksiyon gerekmez.</li>
	<li>Uçucu bileşenleri analiz etme yeteneği.</li>
	<li>Bir karışımın bileşenlerini ayırma yeteneği.</li>
	<li>Algılanan bileşenleri tanımlayabilmek.</li>
	<li>Tespit edilen bileşenler hakkında yarı nicel ve potansiyel olarak nicel bilgi sağlama yeteneği.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>10 mL otomatik numune alma cihazı şişeleri</td><td>Agilent</td><td>5188-5392</td><td>18 mm flakon kapaklı 10 ml vidalı flakonlar</td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>8010-0139</td><td>PTFE/silikon septalı manyetik</td></tr><tr><td>Otomatik numune alma cihazı</td><td>Agilent</td><td>GC120 PAL otomatik numune alma cihazı</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal kolon</td><td>Agilent</td><td>HP5-MS</td><td>30 m x 0,25 mm; 0,25 & mikro; m</td></tr><tr><td>Veri analiz yazılımı</td><td>Agilent-ChemStation</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gaz Kromatografı</td><td>Agilent</td><td>7890B</td><td></td></tr><tr><td>Giriş septası</td><td>Agilent</td><td>5182-3442</td><td>Merlin mikro mühür</td></tr><tr><td>Kütle Seçici Dedektör</td><td>Agilent</td><td>5977A</td><td></td></tr><tr><td>Raporlama yazılımı</td><td></td> <td>Microsoft-Excel</td><td></td></tr> <tr><td>Spektral kitaplığı</td><td>NIST</td><td>-</td><td>NIST/EPA/NIH Kütle Spektral</td></tr><tr><td>Kitaplığı Spektral kitaplık arama programı</td><td>NIST-MS</td><td></td> <td>Search v.2.2</td></tr><tr><td>Bölünemez Giriş astarı</td><td>Agilent</td><td>5190-4048</td><td></td></tr><tr><td>SPME fiberler</td><td>Agilent</td><td>SU57345U</td><td>65 & mikro; m PDMS/DVB fiber</td></tr></tbody></table>

hayvan kokusu sinyallerinin Örneklemesi ve analizi

Sampling and Analysis of Animal Scent Signals

Hayvan iletişiminde nasıl kullanılabileceğini anlamak için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birleştiğinde kafa boşluğu katı faz mikroextraction kullanarak koku sinyallerinin örneklemesi ve analizi için etkili bir metodoloji geliştirdik. Bu teknik, numunedeki bileşenlerin ayrılmasını ve belirsiz bir şekilde tanımlanmasını sağlayarak koku salgılarının uçucu bileşenlerinin yarı nicel analizine ve ardından sinyalizasyonda yer alabileceği bileşikleri işaret edebilecek eğilimleri aramak için tepe alan oranlarının analizine olanak tanır. Bu mevcut yaklaşımın temel güçlü yönleri, analiz edilebilen örnek türlerin aralığıdır; herhangi bir karmaşık numune hazırlama veya ekstraksiyona ihtiyaç duymaması; bir karışımın bileşenlerini ayırma ve analiz etme yeteneği; algılanan bileşenlerin tanımlanması; ve tespit edilen bileşenler hakkında yarı nicel ve potansiyel olarak nicel bilgi sağlama yeteneği. Metodolojinin ana sınırlaması örneklerin kendisiyle ilgilidir. Belirli ilgi bileşenleri uçucu olduğundan ve bunlar kolayca kaybolabileceğinden veya konsantrasyonları değiştirilebileceğinden, numunelerin toplanmasından sonra uygun şekilde depolanıp taşınması önemlidir. Bu aynı zamanda örnek depolama ve taşıma koşullarının nispeten maliyetli olduğu anlamına gelir. Bu yöntem çeşitli örneklere (idrar, dışkı, saç ve koku bezi koku salgıları dahil) uygulanabilir. Bu kokular, bir dizi matriste meydana gelen karmaşık karışımlardan oluşur ve böylece bireysel bileşenleri ayırmak ve biyolojik ilgi bileşiklerini çıkarmak için tekniklerin kullanılmasını gerektirir.

Bu protokolün ardından, kırmızı-fırfırlı lemurlar (Varecia variegata rubra) tarafından filtre kağıdına kendiliğinden salınan 14 ano-genital koku işaretinin analizinden toplam 32 uçucu kimyasal bileşik belirledik ve koku profillerini sinyalcinin özellikleriyle karşılaştırdık12. Hidrokarbonlar, terpenler, terpene alkolleri ve ketonlar gibi doğal olarak meydana gelen uçucu bileşikler bu profillerde mevcuttu ve daha önce seks feromonları ve diğer hayvan türlerinde fitness ipuçları olarak işle...

Koku sinyallerinin hayvan iletişiminde nasıl kullanılabileceğini anlamak için örnekleme ve analiz için etkili bir metodoloji geliştirdik. Özellikle, hayvan kokularının ve koku işaretlerinin uçucu bileşenlerini analiz etmek için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birleştiğinde kafa boşluğu katı faz mikrokstrasyonu kullanıyoruz.

Hayvan Kokusu Sinyallerinin Örneklemesi ve Analizi

We have developed an effective methodology for sampling and analysis of odor signals, by using headspace solid-phase microextraction coupled with gas ...

Kokunun hayvan iletişiminde oynadığı rol şu anda küçümseniyor ve çok yetersiz. Özellikle insanlar da dahil olmak üzere hayvanlardaki koku sinyallerini destekleyen kimyasal değişiklikler hakkında çok az şey bilinmektedir. Ve bunlar aynı zamanda metodolojik zorluklardan, hayvanlar tarafından iletişim kurmak için kullanılan kokuların kimyasal bileşiklerini kaydetmekten ve ölçmekten kaynaklanmaktadır.Son derece karmaşık kimyasal karışımlarla çalışırken çeşitli potansiyel zorluklar vardır ve bunlar koku örneklerini örnekleme ve analiz ederken de içerir. Hayvanlar arasında iletişim kurduklarında nasıl kullanılabileceğini anlamak için hayvanlar tarafından kullanılan kokuların analizini yapıyoruz. Hayvan iletişiminde kokunun oynadığı rolü anlamamızı geliştirmek için Sitokimya ile Biyoekoloji endokrinoloji ve sitolojiyi birleştirdik.Wolverhampton'daki mevcut metodolojimiz için, headspace katı faz mikroyapı tekniğini gaz kromatografisi kütle spektrometresi ile birleştiğinde benimsedik, üzerine inşa edildi ve geçmişte metodolojinin görünmeyen bir kısmı kullanıldı. Örnek kokular aşağıdaki yollardan biriyle toplanır. Birincisi, alışılmış çalışma deneklerinden kendiliğinden salınan örnek kokular.Örneğin, hayvanat bahçesi primatları, steril filtre kağıdında veya idrar örneklerinde koku işareti yaparak koku bezi koku salgılarını doğrudan şişelere toplar. İki, eğitim sonrası çalışma konuları pozitif takviye kullanarak koku salgılarını steril pamuklu çubuklarla koku bakışını ovalayarak toplar. Üç, çalışma deneklerinin yatıştırıcıdan sonra, koku bezlerini steril pamuklu çubuklarla ovalayarak, steril 10 mililitre vidalı kapaklı, şeffaf cam şişelere ve P T T E silikon sektörünü içeren vidalı kapaklı contaya sokarak koku salgılarını toplar.Şişeleri hemen eksi 20 santigrat derecede saklayın. Örnekleme sırasında nitril eldiven gibi temiz kişisel koruyucu ekipmanların kullanılması hayati önem taşımaktadır. Eldivenleri değiştirin Sık sık numuneler ve şişelerle doğrudan cilt temasından kaçının.Yepyeni şişelerin kullanılması tercih edilir. Bununla birlikte, kullanılmış şişeler durumunda, şişeleri önceden temizlemek ve ardından aynı protokolü kullanmak çok önemlidir. Koku işaretleri her toplandığı zaman çevresel boşluklar alın.Örnekleme yapılırken kullanılmayan bir filtre kağıdını veya pamuklu çubuk ve şişeleri çevreye maruz kalarak bunu yapın. Sahada numuneler hazırlanır. İşaretli bir filtre kağıdı kokusu için kağıttan yaklaşık 10 milimetre kare kesin ve 10 mililitre vidalı tepeli kafa boşluğu şişesine yerleştirin.Bir çubuk için, çubuk milinin en ucundaki çubuk başını kesin ve bir kafa boşluğu şişesine yerleştirin. Her numune hazırlandıktan sonra, örnekleme ortamını kesmek için bıçak kullanımını uygun bir antibakteriyel silme ve veya alkolle atın veya temizleyin ve iyice kurulayın. Tüm örnekleri eksi 20 santigrat derecede saklayın.Bununla birlikte, numuneler eksi 20 santigrat derecede saklanmalıdır, ancak en düşük sıcaklıktaki tarla deposunda ve ilk fırsatta eksi 20 santigrat dereceye aktarılmalıdır. Analizden önce numuneleri dondurucudan çıkarın ve en az bir saat boyunca doğal olarak oda sıcaklığına yürümesine izin verilir. SPMS analiz koşulları için GCMS'deki analitik yöntemleri aşağıdaki gibi ayarlayın, ilk kullanımdan önce SBME fiberlerini koşullamak için üreticinin yönergelerini izleyin.SBME tertibatın otomatik numune alma sistemine doğru şekilde monte edilmiş olması ve otomatik örnekleyici tepsileri fiber şartlandırma ünitesine ve GC giriş portu ile hizalanmış olması hayati önem taşımaktadır. Yanlış hizalama, Sbme lifinin hasar görmesine veya tahrip olmasına neden olabilir. Fiber şartlandırma ünitesine levrek gazı beslemesinin açık olduğundan emin olun.Örnek saklama süresi tutarlılığı arasında iyileştirme yapmak için, analitik yöntem saklama süresi kilitli numune şişelerini otomatik örnekleyici tepsisine ekleyin otomatik örnekleyici tepsisinin ilk konumunda sistem boş olarak hareket etmek için boş bir kafa boşluğu şişesi yerleştirin. Çevresel boşluğu ikinci konuma yerleştirin ve ardından analiz için kalan tüm numuneleri otomatik örnekleyici tepsisinin sonraki konumlarına yerleştirin. Örnek tepsisteki her örneği analiz etmek için analitik bir sıra oluşturun.Kitle avcısı giriş ekranında, menü çubuğu için sırayı seçin ve ardından açılır menüden sırayı yükleyin. Boş bir sıra tablosu görüntülenir, tamamlanmış sıra tablosu olarak kaydetmek için uygun bilgileri ekleyerek tüm boşluklar ve örnekler için sıra tablosunu tamamlayın. Sıra tablosu için kesin bilgilerin tablonun laboratuvar biçimlendirmesine bağlı olacağını unutmayın.Minimum bilgiler normalde örnek türü örnek adını, dosya konumunu ve sayı analitik yöntemini ve veri dosyası konumunu ve gelecekteki veri işlemede örnek adla eşleşen bir veri dosyası adının ad ayırmasını içerir. Analiz sırasında sıraya ek örnekler eklenebilir. Menü çubuğundan sırayı seçerek sırayı çalıştırın ve sonra sırayı çalıştırın.Analizden sonra numuneler en kısa sürede dondurucuya iade edildi. Örneklerin yeniden analiz edilebileceğini unutmayın. Ancak, bazı uçucu bileşenlerin ilk analiz sırasında tamamen çıkarılmış olabileceği ve bazı bileşiklerin 40 santigrat derecede termal ve bakteriyel ayrışmaya uğramış olabileceği belirtilmelidir.Bu nedenle, kromatogramdaki sonuç orijinal koku işaretini tam olarak temsilemeyebilir. İlk veri analizi, saklama süresi ve tepe alanı verilerini elde etmek için kromatogramların entegrasyonunu ve kam istasyonu yazılımı ve yuva kütle spektral veritabanlarını kullanarak tepelerin belirsiz bir şekilde tanımlanmasını içerir. Veri analizi manuel olarak veya yarı otomatik bir yöntemle gerçekleştirilebilir.Yarı otomatik yöntem kullanılırsa, belirsiz tanımlamaları doğrulamak için bir dereceye kadar manuel veri analizi yapmak bazen faydalıdır. Veri çözümlemesi başlatmak için, sol gezinti çubuğundaki uygun dosyayı tıklatarak veri dosyasını açın. Toplam iyon kromatogram TIC, veri analizi ekranının üst penceresinde görüntülenir.RTE entegratörü kullanarak TIC'yi tümleştirmek için, önce menü çubuğundan kromatogramı seçin ve ardından açılır menüden bir açılır kutu açılır ve RTE entegratörünün öğesini seçin. Kromatogram menüsüne geri dönün ve şimdi tümleştir'i seçin. Tümleştirme parametrelerini, tepelerin veya üç kattan büyük temel gürültünün tümleşik olmasını sağlamak için, menü çubuğundan kromatogramı ve ardından açılır menüden MS Signal tümleştirme parametrelerini yeniden seçin.Açılır kutuda, minimum tepe alanını uygun 1.0 olarak ayarlayın, örneklerimizde kabul edilebilir sonuçlar üretir. Tepeleri tanımlamak ve özet rapor oluşturmak için, menü çubuğundan raporları dışa aktar'ı seçin ve ardından arama sonuçları raporunu XLS'ye kitaplayın. Bir kitaplık araması yapılmadan önce, görüntülenecek kitaplık eşleşmelerinin sayısıyla birlikte aranacak spektral kitaplıkların yazılım içinde önceden ayarlanabilmesi gerekir.Elde edilen elektronik tablo raporu, her tepe noktası için tümleştirme verileri ve kimlik atamak için belirsiz bir spektral kitaplık eşleşmesi içerir. Genellikle kitaplık kalitesi veya kitaplık eşleşmesi belirsiz tanımlamayı kabul etmek için 80'den büyük olmalıdır. Elektronik tabloyu kaydedin.Doğrudan TIC'den bir tepeyi tanımlamak için ilginin zirvesini seçin. Tepe noktası küçükse, tepenin etrafına bir kutu çizerek, sol fare düğmesini basılı tutarak kutuyu tepenin üzerine uzatın ve fare düğmesini bırakın. İmleç çizgisini tepenin en yüksek noktasına veya hemen sonra olacak şekilde yerleştirin.Çift tıklayın, sağ fare düğmesi ve tepe için kütle spektrumu veri analizi ekranının düşük penceresinde görünecektir. Spektral kitaplıkta arama yapmak için, imleci spektral pencerede herhangi bir yere taşıyın ve sağ fare düğmesini çift tıklatın kitaplık arama sonuçları yeni bir pencerede görünecektir. Önce ilgi spektrumundan arka plan gürültüsünü kaldırmak için, söz konusu tepedeki sağ el fare düğmesini çift tıklatın, ardından ilgi zirvesinin hemen önünde tepe noktası olmayan bir alanda sağ el fare düğmesini tıklatın, menü şeridindeki çıkar düğmesine tıklayın veya menü çubuğu için kromatogramı seçin ve ardından açılır menüden spektrayı çıkarın.Çıkarılan spektrum, veri çözümleme ekranının alt penceresinde görüntülenir ve pencere başlığındaki tarama verilerinin yanında bir tire görüntüler. Bu protokolün ardından, kırmızı fırfırlı lemurlar tarafından filtre kağıdına kendiliğinden salınan 14 genital koku işaretinin analizinden toplam 32 uçucu kimyasal bileşik belirledik ve koku profillerini hidrokarbonlar gibi sinyalcinin doğal olarak oluşan uçucu bileşiklerin özellikleriyle karşılaştırdık, terpenes, Turpin alkolleri ve ketonları bu profillerde mevcuttu ve daha önce seks hormonları ve fitness ipuçları olarak işlev bulduğu tespit edilen bileşikleri içerir. diğer hayvan türlerinde. Belirsiz bir şekilde tanımlanan bileşikler tablo 1'de listelenmiştir.Temsili kromatogramlar bir kontrolden ve bir Lima koku işaretinden şekil bir olarak gösterilmiştir. Bileşenlerin sayısı ve göreceli bolluğu, farklı çalışma konularında numuneden örneğe değişmektedir. Bununla birlikte, kromatogramda A'dan F'ye etiketlenmiş altı bileşik tüm örneklerde mevcuttu.Bu bileşikler sırasıyla E'nin bir altılı parakristal parakristal altı paramentha iki sekiz boya bir iki pinene dört ve pentodecane yüksekliğe kadar büküldü. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, kırmızı fırfırlı lemurların, sosyo cinsel iletişimde rol oynayan genital işareti olmayan seks ve kadın yaşı hakkında bilgi iletmek için gönderilen işaretlemeyi kullandığını öne sürmektedir. Bu protokolün kullanılmasını takiben bir başka temsili sonuç, dişi zeytin babunları tarafından doğurganlık reklamı çalışmamızdı.395 kadın babun vajinal koku örneğinin analizinden toplam 74 uçucu bileşik tespit ettik. Bunlar arasında ketonlar, alkoller, aldehitler, terpenler, uçucu yağ asitleri ve hidrokarbonlar gibi doğal olarak oluşan bir dizi kokulu uçucu bileşik vardı. Tipik kromatogramlar, doğurgan ve doğurgan olmayan dönemlerden boş trol ve dişi babun vajinal koku örneklerini karşılaştırmak için kullanılır.Vajinal koku profilleri ile kadın babunların cinsel duyarlılığı arasındaki ilişkileri inceliyoruz. Sonuçlarımız, toplam vajinal koku miktarının doğurganlıkla farklılık gösterdiğini ve kokunun kadın babun doğurganlığının sinyalini vermede rol oynayabileceğini gösterdi. Ayrıca grup tipleri arasında vajinal koku farklılıkları bulduk, ancak grup kompozisyonunun etkilerini, kadın yaş safsızlığını ayırt edemedik.GCMS'nin örnekleme ve kullanımının kombine avantajlarıdır. Bu nedenle, kafa boşluğu katı faz mikro ekstraksiyonu kullanılarak GCMS kullanılarak çok çeşitli numunelerin analiz edilmesine olanak tanır. Bu karmaşık işaretlerin bileşenlerini ayırabiliyoruz ve sonra kütle spektrometresini kullanarak bu bileşenlerin her birini tanımlayabiliyoruz.Ve sonra, tüm kombine teknik çok güçlüdür ve bize bu koku işaretleri hakkında çok fazla bilgi verir, ki geçmişte sonuçları elde edebilmek için çok fazla numune hazırlama ekstraksiyonu gerekirdi.

sampling-and-analysis-of-animal-scent-signals

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Kemirgen koku alma sisteminin temel karşın benzersiz özellikleri biyologlar arasında artan çalışmaya yol açmıştır. Işlevi nispeten basit bir değerlendirme daha sonra da ihtiyaç vardır. Burada fare koku alma hassasiyeti ve tercih karakterizasyonu için hassas testler açıklar.

Yetişkin Fare Olfaktör Davranış Testi

Karşılaştırmalı tür yaklaşım davranışsal sinirbilimciler, belirli bir hayvan modelinin karakteristik olarak görülmelidir özel davranışları ile ilgili çeşitli nörobiyolojik faktörler keşfetmek için izin verir. Yakından ilgili türler arasındaki davranış farklılıkları doğal olarak meydana gelen yararlanarak, bu tekniği invaziv tekniklerin davranış ifade işlemek için gerekli değildir.

Baba Yanıtları Nörobiyoloji incelenmesi Karşılaştırmalı Türlerin Yaklaşım

Olfaktör ipuçları böcekler birçok farklı davranışlar arabuluculuk, bileşikler ve uçucu yüzlerce onlarca oluşan genellikle kompleks karışımlarıdır. Böcek anten lob çok kanallı bir kayıt ile gaz kromatografisi kullanarak, biyolojik olarak aktif bileşiklerin belirlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Böcek antennal Lob Gaz Kromatografisi-Multi-ünite Recordings (GCMR) kullanarak Olfaktör Uçuculuk tanımlanması

Biz omurgasız koku yolunun ilk üç aşamada koku-uyarılmış yanıtlar karakterize etmek ekstraselüler çoklu ünite kayıt tekniği varyasyonları göstermektedir. Bu teknikler kolayca başka sinir sistemlerinin topluluk etkinliği incelemek için adapte edilebilir.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Otonom robotlarda elektroantennogramlar (EAG'ler) şeklinde böcek antenleri kullanmak için bir protokol açıklıyoruz. Deneysel tasarımımız, bir gün içinde sabit kayıtlara izin verir ve 10 Hz'e kadar bireysel koku yamalarını çözer. Koku aramaları için EAG sensörlerinin verimliliği, bir robotu bir koku kaynağına doğru sürerken gösterilmiştir.

Koku Aramalar için Otonom Robotlar Böcek elektroantenogram Sensörleri kullanarak

Fareler, ultrasonik vokalizasyonlar (USV'ler) gibi karmaşık bir multisylabic repertuar üretirler. Bu USV'ler, nöropsikiyatrik bozukluklar için okundu olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, fare şarkılarının akustik özelliklerini ve sözdizimini sürekli olarak teşvik etmek, toplamak ve analiz etmek için öğrendiğimiz ve geliştirdiğimiz bazı uygulamaları anlatmaktadır.

Erkek Fare Ultrasonik Seslendirme (USV) Şarkılarından Yararlanma ve Analiz Etme

Bu iletişim kuralı--dan geleneksel bilgisayarları kullanan geleneksel web kamera video böcek anten ve hortum pozisyonların kare kare takibi için yeni yazılım, SwarmSight, kullanma adımları açıklar. Ücretsiz, açık kaynak yazılım çerçeveler yaklaşık 120 kez insanlar daha hızlı işler ve insan doğruluğu daha iyi at gerçekleştirir.

SwarmSight: Gerçek zamanlı izleme böcek anten hareketleri ve hortum uzantısı refleks bir ortak hazırlık ve geleneksel donanım kullanarak

Kontrollü Koku Mimik Permeasyon Sistemi koku testi ve eğitimi için koku teslim basit, alan taşınabilir, düşük maliyetli bir yöntemdir. Bir adsorbent malzeme üzerinde tutulan bir odorant inşa edilmiş ve zaman içinde odorant buharı kontrollü serbest bırakılması sağlayan geçirimli polimer çanta içinde yer almaktadır.

Koku Alma Eğitimi ve Saha Testi için Kontrollü Koku Mimik Permeasyon Sistemleri

Bu protokol, bir koku tüyünde gezinen farelerde hipokampal CA1'deki beyin-davranış ilişkisini araştırır. Hipokampusun görüntülenmesine erişmek için ameliyat, davranışsal eğitim, beynin miniskop GCaMP6f kaydı ve işlenmesi ve ROI nöral aktivitesinden fare pozisyonunun kodunu çözmek için davranışsal veriler dahil olmak üzere adım adım bir protokol sunuyoruz.

Bir koku bulutunda gezinen farelerin hipokampusunda kalsiyum sinyallerini kaydeden miniskop

Bu protokol, C. elegans'taki uçucu seks feromonuna verilen yanıtların çıkarılması ve ölçülmesi için yöntemler oluşturur ve kimyasal iletişim ve navigasyon yörüngesini incelemek için araçlar sağlar.

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Keşfedin hayvan iletişimindeki koku sinyallerinin kimyasal analizi için solid-phase mikroekstraksiyon ve gaz kromatografi-kütle spektrometrisi yöntemlerini. Bu teknikler uçucu bileşikleri tanımlayarak davranışsal ekoloji araştırmalarına değerli bilgiler sunar.

Hayvan Kokusu Sinyallerinin Örneklemesi ve Analizi

Daha fazla video keşfet