Name: RNA-Seq Analizi ile İnsan Primer Keratinositlerin In Vitro Farklılaşmasının Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Öğrenin, insan primer keratinositlerin temas inhibisyonu ile in vitro farklılaşmasını ve RNA-seq ile moleküler karakterizasyonunu. Bu yöntem, epidermal biyoloji ve epigenomik araştırmalar için gen ifadesi profillerini analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) tarafından desteklenmiştir. (NWO/ALW/Açık Rekabet/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud Üniversitesi bursu (H.Z.); ve Çin Burs Konseyi hibe 201406330059 (J.Q.).

<ol><li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin%3A+from+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li>
<li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507(2013).</li>
<li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li>
<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents%3A+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li>
<li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li>
<li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li>
<li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1%2FK10+keratins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li>
<li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li>
<li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li>
<li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li>
<li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).</li>
<li>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019).</li>
<li>Doyle, K. aM. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoyle%2C+KaM+%22Protocols+and+applications+guide%22">Protocols and applications guide</a>. , Promega Corporation. Madison. (1996).</li>
<li>Roche. Hyperprep Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019).</li>
<li>Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GOrilla%3A+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).</li>
<li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((clusterProfiler%3A+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li>
<li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+whole+transcript+and+3%27+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9(2019).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21(2014).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1(2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
<li>Soneson, C. ARMOR. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019).</li>
<li>Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışma, RNA-seq analizleri kullanılarak insan keratinosit farklılaşması ve sonraki karakterizasyonu indükleyen bir yöntemi açıklamaktadır. Mevcut literatürde, insan keratinosit farklılaştırma üzerinde birçok çalışma, yüksek kalsiyum konsantrasyonu veya serum ile farklılaşmaiknayöntemleri olarak iki diğer yöntemler kullanın 2,3,23. Bir önceki rapor dikkatle bu üç farklı yöntem3 karşılaştırıldığında ve ...

İnsan derisinden elde edilen insan birincil keratinositler genellikle epidermisin biyolojisi çalışmak için hücresel bir model olarak kullanılır1,2,3,4. Epidermisin tabakalaşması keratinosit farklılaşması ile modellenebilir, ya 2D batık monolayer moda veya 3D hava asansörü organotipik model2,3,5,6,7. Epidermal yapı ve fonksiyonu değerlendirmek için 3D modeller giderek daha önemli hale gelmiş olsa da, 2D farklılaşma modelleri, kolaylıkları ve analizler için çok sayıda hücre üretme olasılığı nedeniyle hala yaygın olarak kullanılmaktadır.
Serum eklenmesi, yüksek kalsiyum konsantrasyonu, düşük sıcaklık ve epidermal büyüme faktörüreseptörlerinininhibisyonu 2 ,3dahil olmak üzere, 2D keratinosit farklılaşmasıinin indüklemesi için çeşitli koşullar uygulanmıştır. Bu yöntemlerin her biri keratinosit farklılaşma belirteç genleri bir dizi tarafından doğrulanmış ve patolojik koşullar altında da dahil olmak üzere keratinosit farklılaşması değerlendirilmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Ancak, bu indüksiyon koşulları da marker genlerin belirli paneller incelendiğinde onların farklılaşma verimliliği ve kinetik farklılıkları göstermektedir2,3.
Bu yöntemlerden biri keratinosit kontak inhibisyonu ve kültür ortamı nda büyüme faktörlerinin tükenmesi içerir8. Bu keratinositler hücreler tam yoğunluğa ulaştığında kendiliğinden ayırt edebilirsiniz gösterilmiştir.  Kültür ortamındaki büyüme faktörlerinin dışında kılması farklılaşmayı daha da artırabilir. Temas inhibisyonu ve büyüme faktörlerinin tükenmesini birleştiren yöntem, çeşitli epidermal belirteçler kullanırken normal tabakalı epidermis benzer gen ekspresyonu desenleri ile farklılaştırılmış keratinositler oluşturmak için gösterilmiştir3, Bu model normal keratinosit farklılaşması için uygun olduğunu düşündürmektedir. Son zamanlarda, bu modeli kullanarak keratinosit farklılaşması iki kapsamlı gen ekspresyonu analizleri bildirilmiştir9,10. Araştırmacılar bu modeli moleküler düzeyde doğruladı lar ve normal ve hastalıklı keratinosit farklılaşmasını incelemek için kullanılabileceğini gösterdiler.
Bu protokol, in vitro diferansiyasyon yöntemi ve RNA-seq kullanarak farklılaşmış hücrelerin moleküler analizi için prosedürü açıklar. Ayrıca, farklılaşma günü 0 (proliferasyon aşaması), 2. gün, 4. Diferansiye keratinositlerin epidermal tabakalaşma sırasında hücrelere büyük ölçüde benzeyen gen ekspresyonu desenlerini gösterdiği gösterilmiştir. Bu yöntemin deri patolojisi üzerinde çalışılıp kullanılamayacağını incelemek için, ektoderaktili, ektodermal displazi ve yarık dudak/damak (EEC) sendromu11,12olan hastalardan elde edilen transkripsiyon faktörü p63 mutasyonlarını taşıyan keratinositleri araştırmak için aynı deneysel ve analiz boru hattını uyguladık. Bu protokol, keratinositlerin in vitro farklılaşmasına ve rna-seq'nin sonraki biyoinformatik analizine odaklanır. RNA çıkarma, RNA-seq numune hazırlama ve kütüphane inşaatı gibi komple yordamdaki diğer adımlar iyi belgelenmiştir ve özellikle yaygın olarak kullanılan birçok ticari kit kullanılırken kolayca takip edilebilir. Bu nedenle, bu adımlar yalnızca kısa bir süre protokolü açıklanır. Veriler, bu boru hattının sağlıklı ve hastalıklı keratinositlerde epidermal farklılaşma sırasında moleküler olayların incelenmesi için uygun olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Biyoanalizör 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>Sığır hipofiz özü (BPE)</td><td>Lonza</td><td></td><td>bulletKit'in bir parçasıKit</td></tr><tr><td>CFX96 Gerçek Zamanlı sistem</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>qPCR makinesi</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parçası bulletKit</td></tr><tr><td>Ethanolamine > = %98</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli DNA çipleri</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Lonza</td><td></td><td>BulletKit'in bir parçası</td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Lonza</td><td></td><td>BulletKit'in bir parçası</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA sentezi</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Kütüphanesi Quant Kit</td><td>Roche</td><td>07960255001</td><td>Düşük konsantrasyon ölçüm kiti</td></tr><tr><td>RiboErase Roche ile KAPA RNA HyperPrep Kiti</td><td></td><td>KK8540</td><td>RNAseq kiti</td></tr><tr><td>KGM Altın Keratinosit Büyüme Ortamı BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX (model)</td><td>DNA ve RNA ölçümleri için Nanodrop ve Qbit</td></tr><tr><td>NEXTflex DNA barkodları -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 bp uzun primerler</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seq analizi ile İnsan primer keratinositlerin in vitro farklılaşmasının karakterizasyonu

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

İnsan primer keratinositler genellikle epidermal farklılaşma ve ilgili hastalıklar üzerine çalışmalar için in vitro modeller olarak kullanılır. Çeşitli indüksiyon koşulları kullanılarak iki boyutlu (2D) batık şekillerde kültürlenmiş keratinositlerin in vitro farklılaşması için yöntemler bildirilmiştir. Burada tanımlanan kontak inhibisyonu ve RNA-seq tarafından sonraki moleküler karakterizasyon ile 2D in vitro keratinosit diferansiyasyon yöntemi için bir prosedürdür. Kısacası, keratinositler tanımlanmış keratinosit orta büyüme faktörleri ile tam olarak konca kadar takviye olarak yetiştirilir. Farklılaşma keratinositler arasındaki yakın temaslar tarafından indüklenen ve daha fazla orta büyüme faktörleri hariç uyarılır. RNA-seq analizleri kullanılarak, her iki 1) farklılaştırılmış keratinositlerin farklılaşma sırasında farklı moleküler imzalar gösterdiği ve 2) dinamik gen ekspresyonu deseni epidermal tabakalaşma sırasında hücrelere büyük ölçüde benzediği gösterilmiştir. Normal keratinosit farklılaşmasına karşılık gelince, transkripsiyon faktörü p63 mutasyonlarını taşıyan keratinositler, farklılaşma kusurları ile uyumlu morfoloji ve moleküler imzalar sergilerler. Sonuç olarak, bu protokol 2D in vitro keratinosit farklılaşması ve moleküler karakterizasyonu için adımları ayrıntıları, RNA-seq verilerin biyoinformatik analizi üzerinde durularak. RNA çıkarma ve RNA-seq yordamları iyi belgelenmiş olduğundan, bu protokolün odak noktası değildir. İn vitro keratinosit farklılaşması ve biyoinformatik analiz boru hattının deneysel prosedürü, sağlıklı ve hastalıklı keratinositlerde epidermal farklılaşma sırasında moleküler olayların incelenmesinde kullanılabilir.

Normal keratinosit farklılaşması ve RNA-seq analizi Bu deneyde, beş kişiden elde edilen keratinosit çizgileri farklılaşma ve RNA-seq analizleri için kullanılmıştır. Şekil 1, farklılaşma ve RNA-seq analizi sonuçlarının deneysel prosedürünü özetler. Normal keratinositlerin in vitro farklılaşma prosedürlerine genel bir bakış ve farklılaşma sırasında hücre morfolojisi değişiklikleri Şekil 1A'dagösterilmiştir. İlke komponent analizi (PCA), farklıl...

Burada sunulan kontak inhibisyonu ile insan primer keratinositlerin in vitro farklılaşması için adım adım bir prosedürdür ve rna-seq analizi ile moleküler düzeyde karakterizasyon uyguluyor.

RNA-Seq Analizi ile İnsan Primer Keratinositlerin In Vitro Farklılaşmasının Karakterizasyonu

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

Bu protokolde, iki bölümden içeren bir yordamı tanımlıyoruz. İlk olarak, temas inhibisyonu ile in vitro bir monolayer 2D keratinosit diferansiyasyon yöntemi. İkincisi, RNA-seq ile moleküler karakterizasyonu.2D in vitro diferansiyasyon yöntemi basit ve kolay bir şekilde gerçekleştirilir. Özellikle çok sayıda hücre gerektiğinde epidermal farklılaşmayı incelemek için kullanılabilir. Örneğin, epigenomik analizde.Ayrıntılı RNA-seq analiz boru hattı, temel biyoinformatik becerileri olan araştırmacılar için açık ve şeffaftır ve herhangi bir toplu RNA-seq analizi için kullanılabilir. Farklılaşma protokolünü ilk kez gerçekleştirirken, tohumlama yoğunluğunun zor olabileceğini unutmayın. Hücre çizginizle hangisinin en iyi çalıştığını bulmak için birden fazla tohumlama yoğunluğudeneyin.Keratinosit büyüme ortamı veya KGM ve 500 mililitre her bir proliferasyon orta ve farklılaşma orta el yazması talimatlara göre hazırlayarak başlayın. 5 ila 20, santimetre karebaşına 000 hücre yoğunluğunda tohum birincil keratinositler ve hücreleri kapsayacak kadar çoğalma ortamı ekleyin. Tohumlamadan iki gün sonra hücreleri çoğalma ortamı ile yenileyin.Hücreleri mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin ve her gün ortamı yenileyin. Hücreler %90 biraraya geldiğinde, ortayı farklılaşma ortamına değiştirerek farklılaşmaya neden olur. Daha fazla RNA analizleri için hücreleri toplamak için, DPBS ile hücreleri iki kez yıkayın ve sonra lysis tampon ekleyin.Farklılaşma gün sıfır, iki, dört ve yedi hücreleri toplamak. RNA izolasyonundan sonra çift iplikli cDNA dönüştürülecek ve yeni nesil sıralama için RNA-seq kütüphaneleri hazırlanacaktır. Sıralamanın ardından, sıra lar indirilecek ve insan genomuna eşlenecektir.R paketlerini indirip yükledikten sonra readspergene.out'tan hesap tablosu oluşturun. sekme dosyaları ve tüm dosya adlarını içeren bir örnek veri dosyası yazmak, farklılaşma günü ve diğer ilgili örnek verileri. Bir örnek için ek kodlama dosyalarına bakın.Daha sonra hem sayılabilir hem de örnek verileri içeren bir deseq2 nesnesi oluşturmak için sayım tablosunu ve örnek verileri kullanın. Gen ekspresyonu normalizasyonu için deseq2RLD veya VST normalleştirme yi kullanarak deseq2 nesnesindeki sayım tablosunu normalleştirin. RLD normalizasyonu tercih edilirken, VST normalizasyonu çok daha hızlıdır.Normalleştirilmiş okuma sayısı yoğunluklarına göre örnek mesafesini çizmek için R'deki dist işlevini kullanın, ardından örnek uzaklığı temel alınarak hclust kümeleme gerçekleştirin. Ardından, ısı haritasını pheatmap işlevini kullanarak çizin. Son olarak, deseq2 plotPCA işlevini kullanarak normalleştirilmiş okuma sayısı yoğunluklarının bir ilke bileşeni analizi veya PCA arsa oluşturun.PCA, araştırmacı veri analizinde bir araç olarak hizmet vermektedir ve farklı numuneler arasındaki mesafeyi ve bağlantıyı görselleştirmek için kullanılabilir. Farklı zaman noktalarından gelen örnekler arasındaki varyans üzerine sıralayarak ilk 500 son derece değişken geni ayıklayan rowVars fonksiyonu ile son derece değişken gen ekspresyonu analizi yapın. Bu genler, farklılaşma günlerinde normalleştirilmiş yoğunluklarının en yüksek standart sapmasına sahiptir.Farklı ifade desenlerine göre kümelemek için çok değişken genler üzerinde kümeleme k-anlamına gelir gerçekleştirin. Pheatmap paketi ile bir ısı haritası nda genleri görselleştirin. Isı haritasında çizilen yoğunluk, ortanca değeri çıkarılmış deseq2 normalleştirilmiş yoğunluk.Tek bir örnekte 10'dan fazla sayı içeren tüm genleri içeren ifade edilmiş arka plan genlerinin bir listesini oluşturun ve her kümeden genlerle bir liste yapın. Son olarak, GOrilla kullanarak Gen Ontoloji analizi gerçekleştirin. Arka plan gen listesini arka plan kümesi olarak ve hedef kümeler halinde ki yüksek değişken genlerin listesini hedef küme olarak kullanın, ardından arama zenginleştirilmiş GO terimlerine tıklayın.Alternatif olarak, daha gelişmiş R kullanıcıları GO terim zenginleştirme analizini otomatikleştirmek için paket clusterProfiler'ı kullanabilir. RNA-seq analizlerinde farklılaşma için beş kişiden elde edilen keratinosit çizgileri kullanılmıştır. Ana bileşen analizi, farklılaşma geçiren keratinositlerin bağlı ancak farklı genel gen ekspresyonu profilleri olduğunu göstermiştir.Çok değişken genler farklılaşma sırasında gen ekspresyonu dinamiklerini ve desenlerini görselleştirmek için kümelenmiştir. Genlerin her kümesi keratinosit farklılaştırma özelliği genleri ile temsil edildi ve Gen Ontoloji ek gösterimi gen fonksiyonlarında açık bir fark gösterdi. İkinci deneyde ise sağlıklı kontrollerden alınan keratinositler ile P63 mutasyonu taşıyan hastalardan elde edilen hücre hatları arasında hücre morfolojisi ve gen ekspresyonu farklılıkları karşılaştırıldı.Ana bileşen analizi, kontrol hücre hatlarının açıkça bir farklılaşma deseni izlediğini, ancak farklılaşma sırasında mutant hücrelerin gen ekspresyonu deseni büyük ölçüde çoğalan veya farklılaşmamış hücrelere benzer olduğunu göstermiştir. Kümeleme analizinde, küme 1'deki genler kontrol hücrelerinde alt regüle edildi ve R204W ve R279H mutasyonları taşıyan hasta hücrelerinde kısmen indirgendi, ancak R304W taşıyan hücrelerde yüksek kaldı. Bu genler büyük olasılıkla Gene Ontoloji analizinde gösterildiği gibi hücre çoğalmasında rol oynamaktadır.Küme iki gen ilk tanıtıldı ve daha sonra kontrol hücrelerinde downregulated. Epidermal farklılaşma ve keratinizasyon fonksiyonları bu küme için yüksek zenginleştirilmiş olarak bu genler büyük olasılıkla keratinosit farklılaşma dahil. Küme üçdeki genler sadece kontrol hücrelerinde farklılaşma sonunda indüklendi ler ve bu da epidermisin en dış tabakasında rol oynayabileceklerini gösteriyor.RNA-seq verilerini analiz ederken, ne beklemesi gerektiğini önceden bilmek önemlidir. Bu hem kalite kontrolü ve PCA arsa yorumlama ve sonuçları mantıklı olup olmadığını değerlendirmede size yardımcı olacaktır. Yöntemlerimiz hem epidermal biyolojide hem de diğer biyolojik sistemlerde gen transkripsiyonlarını incelemek için kullanılabilir.

characterization-vitro-differentiation-human-primary-keratinocytes

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

MıkroRNA (miRNA) insan kaynaklı-pluripotent kök (iPS) hücreleri (iPS-RPE), ve fetal RPA'nin türetilen insan kaynaklı-pluripotent kök profilleri (iPS) hücreleri, retina pigment epiteli (RPE), karşılaştırıldı.

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

Bu video, in ovo elektroporasyon ile transfeksiyon sonrası diseke civciv embriyonik omurilik örnekleri üzerinde tüm transkriptom analizi yapmak için temel adımları göstermektedir.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

İnsan derisi dış ortamda karşı savunma ilk satırı olarak davranır. Biz yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi izole bir yöntem mevcut. Bu izole lenfositi çok sayıda deneysel kurulumları yararlıdır ve kutanöz Biyoloji vitro. moleküler mekanizmalar çalışmak için son derece uygun bir model...

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA'lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Öğrenin, insan primer keratinositlerin temas inhibisyonu ile in vitro farklılaşmasını ve RNA-seq ile moleküler karakterizasyonunu. Bu yöntem, epidermal biyoloji ve epigenomik araştırmalar için gen ifadesi profillerini analiz etmeyi sağlar.

RNA-Seq Analizi ile İnsan Primer Keratinositlerin In Vitro Farklılaşmasının Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet