Tüm Genom Nanopore Sıralama doğrulama, Örnek olarak Usutu Virüs kullanarak

Virüslerin nereden geldiğini ve nasıl yayıldığını anlamak için virüs genetik dizilimi kullanıyoruz. Ve bu verileri gerçek zamanlı olarak kullanabilmek için, örneğin bir salgın sırasında, sağladığımız verilerin tam olarak ne kadar doğru olduğunu anlamamız gerekir. Bu tekniklerin başlıca avantajları nispeten ucuz olması, hızlı olması ve alan içi sıralama için kullanılabilecek gerçek zamanlı baz kodlaması sağlamasıdır.

Bu yöntem, örneğin, patojenlerin çok sayıda kökenibelirlemek için kullanılabilir dizi verilerin in zamanında nesil için kullanılabilir. Bu teknik ilk kez kullanıcılar için karmaşık olabilir ve temel Unix bilgisi gereklidir. Özellikle farklı yazılım paketlerinin kurulumu için.

Bu yöntemin görselleştirilmesi, kullanıcıların kendi özel sıralama protokollerinin hata oranını belirlemelerine yardımcı olur. Ve araştırma sorularını cevaplamak için. Dizi çalışması MinIT'e bağlı bir MinION'da başlatılır.

Nanopore platformunda bir dizi önceden bilgilendirdikten sonra, veri yükünü Porechop'a yükleyin. Kontaminasyonu önlemek ve doğruluğu artırmak için, gerekli alt vurgulamak iki kullanın, barkod bayrak altını çizin ve belirtildiği gibi komutu girin. De-multiplexing sonra, belirtilen komutu kullanarak 75 nükleotit daha kısa bir uzunlukta astar dizileri ve dizileri kaldırmak için cutadapt kullanın.

Minimap2'yi kullanarak farklı referans suşlarının paneline karşı de-multiplex sırasını haritalamak için Minimap2'yi kullanın. Ve bir fikir birliği dizisi oluşturmak için Samtools kullanın. Referans tabanlı hizalamalar için, en yakın referans türünü belirlemek için bir patlama yıkıp oluşturulan konsensüs sırası ile arama yapmak esastır.

Daha sonra referans tabanlı hizalama en yakın başvuru zorlanma referans olarak tekrarlayın. Nanopore sıralamasındaki hata profilini telafi etmek için gerekli okuma kapsamını belirlemek için, bir Amplicon'a sıra eşlemesi seçin ve Nanopore okumalarını bu Amplicon'a karşı haritalamak için Minimap2'yi kullanın. Amplicon26'ya yalnızca okuma eşlemesini seçmek ve belirtilen komutları kullanarak bam dosyasını fastq'a dönüştürmek için Samtools'u kullanın.

Rasgele seç, örneğin, 200 sıra bin kez okur. Rasgele seçilen tüm sıra okumaları Amplicon26'ya hizalanır. Bc nano bayrağında belirtildiği gibi Nanopore sıralamaiçin optimize edilmiş ayarları kullanarak sıra okumaları eşlemek ve hemen bir konsensüs sırası oluşturmak için KMA'yı kullanın.

Oluşturulan konsensüs dizilerini incelemek için belirtildiği gibi komutları kullanın. Başlık altında txt nokta istatistiklerinde hata oranını görüntülemek için, hata oranı eşlenen üsleri uyuşmazlıkları, belirtilen komutu kullanın. Indels sayısını görüntülemek için döngü başına indels başlığı altında görüntülenir belirtilen komutu kullanın.

Yeni akış hücresini temel renk flip-flop ile birlikte kullanarak, 40 kez okuma kapsamı, Illumina dizilimi ile karşılaştırıldığında aynı sonuçlarla sonuçlanır. 30 kez bir okuma kapsama sırası her 585, 000 nükleotitbir hata karşılık gelen% 0.02 bir hata oranı ile sonuçlanır. 20 kez okunan bir kapsama alanı her 63 hatayla sonuçlanırken, 529 nükleotit sıralanır.

10 kez bir okuma kapsamı sıralanmış her 3, 312 nükleotitbir hata ile sonuçlanır. Yani dört Usutu virüs genomuna 3 nükleotit yanlış deniyor. 30 kez üzerinde bir okuma kapsama ile, hiçbir indels gözlenir.

20 kez okuma kapsamı, bir indel pozisyonunun algılanmasıyla sonuçlanırken, 10 kez okunan bir kapsama alanı 29 pozisyonda indels ile sonuçlanır. Hatırlanması gereken en önemli şey, her zaman belirgin olmasa da, yazılım güncellemeleri sık sık meydana gelir ve sonuçları etkileyebilir. Kullanılacak yazılımların birkaç seçeneği vardır.

Biz en sık kullanılan programları göstermiştir. Ancak farklı yazılımlar ve bu yazılımların farklı sürümleri farklı sonuçlara neden olabilir. Oluşturduğumuz dizi verilerinin kalitesini nasıl kontrol ettiğimize dair bir örnek gösterdik.

Ve bu güvenilir salgın desteği için çok önemli.