Name: Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Öğrenin, fare kalbinden yüksek saflıkta kardiyak fibroblast ve miyofibroblast izolasyonu için bu protokolü. Yara iyileşmesi ve fibroz araştırmalarında hücre fonksiyonlarını anlamak için kritik bir yöntem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr. Ivo Kalaycı'ya αSMA-GFP fareleri için teşekkür etmek istiyorlar. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIH) tarafından R01GM118300 (S.S.), Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve BIYOmühendislik Enstitüsü (S.S.) altında desteklenmiştir. Ödül Numarası R21EB019509 (P.P.Y.) ve Amerikan Kalp Derneği Bilim Adamı Geliştirme Hibe si 17SDG33630187 (S.S.) altında. Vanderbilt Ingram Kanser Merkezi (P30 CA68485) ve Vanderbilt Sindirim Hastalığı Araştırma Merkezi (DK058404) tarafından desteklenen VUMC Flow Sitometri Ortak Kaynak'ta akış sitometrisi analizleri yapıldı.

<ol><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%3A+From+Inflammation+to+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt1%2Fbetacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li>
<li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+myocardial+infarction%3A+a+role+in+inflammation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li>
<li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((View+from+the+heart%3A+cardiac+fibroblasts+in+development%2C+scarring+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li>
<li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li>
<li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Fibrosis%3A+The+Fibroblast+Awakens%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts%3A+implications+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li>
<li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+fibroblasts+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li>
<li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li>
<li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li>
<li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+fibroblast%3A+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Fibroblastlar, çeşitli belirteçler kümesi ile tanımlanan heterojen bir hücre grubudur. Fibroblastları tanımlamak için kullanılan protein belirteçleri diskoidin etki alanı reseptörü 2 (DDR2), fibronektin, vimentin, kollajen I ve III ve Thy115,16,17,18,19,20. Vimentin yaralanmamış quiescent kardiyak fibroblastlar tanımlamak içi...

Kardiyak fibroblastlar, mezenkimal kökenli hücreler, homeostaz sırasında kardiyak mimarinin bakımına ek olarak kalpte elektrikiletimi ve mekanik kuvvetlerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır1. Yaralanmadan sonra, bu hücreler aktive edilir, genişletilir ve ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleriüretir2. Birçok preklinik çalışmalar da yaralı bir kalp yapısal bütünlüğünü korumak kritik hücresel düzenleyiciler olarak fibroblastlar ortaya koymuştur3 yanı sıra kontrolsüz üretim ve ECM proteinlerin birikimisorumlu ana efektör hücreleri, sert yara oluşumu ve kalp yetmezliği ile sonuçlanan4. Fibroblastlar heterojen bir hücre grubudur, bu da reparatif fonksiyonlarını pro-fibrotik maladaptif özelliklerden ayırmakiçin zorlayıcı dır. Son zamanlarda, miyokardiyal yaralanma sonrası iki farklı fibroblast alt tipinin fonksiyonel heterojenliği tanımlanmış, farklı fibroblast alt tiplerini izole etme ve yara iyileşmesindeki rollerini inceleme olasılığıgösterilmiştir 5.
Saf fibroblast popülasyonu elde etmek, onarım ve fibrozisteki fonksiyonel rollerini ortaya§ almakta çok önemlidir. Ancak, diğer hücre tiplerini tanıyan birden fazla fibroblast belirteçlerinin varlığı önemli ölçüde saf fibroblastpopülasyonu 6izole etmek için zor olun. Çeşitli zarif çalışmalar yaralanmamış ve yaralanmalı miyokardyum kardiyak fibroblastlar izole etmek için akıllı yollar icat var. Fibroblastları zenginleştirmenin en popüler ve köklü yöntemi enzimatik doku sindirimini7takiben seçici yapışma yoluyla 7.
Ayrıca, hücre yüzeyi antijenlerine dayalı fibroblastların floresan aktive hücre sıralama (FACS) başarıyla tarif edilmiştir8. Çalışmada enzimatik sindirimitaki mezenkimal hücreler fare kalplerinden soy-negatif (Lin: Ter119−CD45−CD31− )ve gp38-pozitif (gp38+) olarak sıralandı. Gp38+ve hücrelerinin col1α1 ve diğer mezenkimal belirteçlerin ortak ekspresyonuna göre fibroblast olduğu doğrulandı. En doku sindirim petri çanak ventrikül dışarı diseksiyon sonra tamamlanmış olsa da, yeni bir çalışma da miyositler ve fibroblastlar içeren non-miyositizole etmek için sol ventrikül doğrudan iğne enzim perfüzyonu kullanımını araştırdı9. Fibroblastlar daha sonra bu durumda selektif yapışma ile izole edildi.
Bu protokol, fibroblastların izolasyonu ve zenginleşmesini üç yöntemle açıklar. İlki enzimatik sindirimi takiben fibroblastların seçici yapışmasını içeren zaten kurulmuş bir yöntemdir. İkinci yöntem öncelikle miyofibroblastları ifade eden yaralanmaya bağlı alfa düz kas izole etmek için kullanılır. Üçüncü yöntem hematopoetik ve endotel hücrelerinin enzim sindirilmiş kardiyak hücre süspansiyonunun sıralı, manyetik olarak tükenmesini içerir. Tükenmeden sonra fibroblastlar/miyofibroblastlar manyetik boncuklar kullanılarak mefsk4 antijeninin varlığına göre izole edilir. Son zamanlarda, MEFSK4 quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar üzerinde bir antijen mevcut olarak tarif edilmiştir, fibroblast tanımlama ve izolasyon için uygun bir belirteç yapma. Doğal olarak, burada açıklanan tüm yöntemlerin benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, akış analizi, immünboyama ve yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR ile izole hücre popülasyonunun saflığını kontrol etmek şiddetle tavsiye edilir. Ancak, bu metodolojiler üzerine genişletilebilir ve önemli deneyler için fibroblast ve miyofibroblast popülasyonları kullanmadan önce diğer kirletici popülasyonları dışlamak için ek belirteçler eklenebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aseton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-fungal (Amfoterisin B-çözünür; Mantar bölgesi)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9528</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serium Albümini (BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitrat Tampon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz karışımı (Liberaz Blendzyme 3 TH)</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDI suyu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin ve HEPES</td><td>Life teknolojilerine</td><td></td> sahip DI su DMEM-F12 11330057 <td></td></tr><tr><td>Dnase I(20U/mL)</td><td>BioRad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Ca2+ ve Mg2+Gibco içermeyen Fosfat Tamponlu Salin (dPBS)</td><td></td> <td>13190-144</td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr> FC <tr><td></td> Blokeri (Saflaştırılmış)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> anti-fare CD16 / CD32)</td> <td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Yaşam teknolojileri</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>% 10 keçi serumu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Ca2 + ve Mg2 + ile Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td> <td>Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-Ci</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit Tampon tozu</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma profilaktik (Plazmosin)</td><td>İnvivojen</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10x Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Yavaş Solan Montaj Ortamı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF ve beta;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke (% 0.4)</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tip 1 Sıçan Kollajen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>7AAD (stok: DMSO'da 1 mg / mL çözelti)</td> <td>Moleküler Problar</td><td>A1310</td><td>seyreltme = 1: 1000; RRID =</td></tr> <tr><td>CD45-APC</td><td>BD Bioscience</td><td>559864</td><td>seyreltme = 1:200; RRID =</td></tr><tr><td>AB_398672 CD31-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>553373</td><td>seyreltme = 1:200; RRID = AB_394819</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>seyreltme = 1:250; RRID = AB_394816</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>553076</td><td>seyreltme = 1:250; RRID = AB_394606</td></tr><tr><td>SÜTUN 1 & alfa; 1</td><td>MD Biyoürünler</td><td>203002</td><td>seyreltme = 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>Hayalet boya menekşe 510 (Formülasyon: DMSO'da 1 uL / test)</td> <td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870</td><td>seyreltme = 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>Keçi anti-fare Alexa Fluor 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11029</td><td>seyreltme = 1:200; RRID = AB_138404</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan-Cy3</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>seyreltme = 1:200; RRID = AB_2795952</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan-FITC,</td><td>Jackson İmmünoaraştırma Laboratuvarları</td>, <td>711-165-152</td>, <td>seyreltme = 1:200; RRID = AB_2307443</td></tr><tr><td>Keçi sıçan önleyici Alexa Fluor 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11006</td><td>seyreltme = 1:200; RRID = AB_2534074</td></tr><tr><td>Keçi sıçan önleyici Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A21247</td><td>seyreltme = 1:200; RRID = AB_141778</td></tr><tr><td>Periostin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC67233</td><td>seyreltme = 1:100; RRID = AB_2166650</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2258</td><td>seyreltme = 1:200; RRID = AB_261856</td></tr><tr><td>&alfa;-düz kas aktini (&alfa;SMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td>seyreltme = 1:1000; RRID = AB_476701</td></tr><tr><td>Fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)</td><td>Millipore 07-2274</td><td>07-2274</td><td>seyreltme = 1:100; RRID = AB_10807552</td></tr><tr><td>CD45 Manyetik Boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Manyetik Boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-087-418</td><td></td></tr><tr><td>Besleyici önleyici hücreler-APC (MEFSK4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-900</td><td>seyreltme = 1:100; RRID = AB_2660619</td></tr><tr><td>anti-APC Boncuk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-034</td><td>seyreltme = 1:100; RRID = AB_2661598</td></tr><tr><td>Eşek sıçan önleyici Alexa Fluor405</td><td>Abcam</td><td>ab175670</td><td>seyreltme = 1:100</td></tr><tr><td>anti-AN2/NG2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-455</td><td>seyreltme = 1:11; RRID = AB_2651235</td></tr><tr><td><güçlü>Diğer Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m Filtre</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>10 cm2 Hücre Kültürü Kabı</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>40 & mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Tüp</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu Plaka</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sitometri Tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek Kenar Bıçağı</td><td>PAL</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-&alfa;SMA Muhabir Fareler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS Ayırıcı Manyetik Alan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS Ayırma Kolonu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td><td>Qaigen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Ambion RNAqueous Mikro Toplam İzolasyon Kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kiti</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>48 Kuyulu Plaka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30G İğne</td> 3 Lazer Akış <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitometri Makinesi (BD LSRFortessa)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 Lazer Akışı Sitometri Makinesi (BD FACSAria III)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akış Verisi Toplama Yazılımı (BD FACSDiva Software v8.0a)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akış Veri Analiz Yazılımı (FlowJo Software)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erişkin kardiyak fibroblastlar ve miyofibroblastların İzolasyon ve karakterizasyonu

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Kardiyak fibrozis yaralanmaya yanıt olarak yara iyileşmesi için fizyolojik bir yanıttır. Fibrozisi azaltan fibroblast alt tiplerinin incelenmesi ve hedef altına inme çalışmaları yapılmıştır. Ancak, fibroblast araştırma quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar tanımlamak için evrensel olarak kabul edilebilir fibroblast belirteçleri eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Fibroblastlar heterojen hücre popülasyonuolup, onları izole etmek ve karakterize etmek zordur. Sunulan protokol, yaralanmamış ve yaralanan fare kalplerinden fibroblastve miyofibroblastları zenginleştirmek için üç farklı yöntem tanımlanmaktadır. Fibroblastları izole etmek için standart ve güvenilir bir protokol kullanmak, homeostazdaki rollerinin ve fibrozis modülasyonunun incelenmesini sağlayacaktır.

ΑSMA-GFP muhabiri fareler kullanılarak miyofibroblast izolasyonu gösteren akış şeması Yaralanmamış kalpler αSMA-GFP muhabiri fare modelinde tespit edilebilir GFP+ hücreleri göstermedi; bu nedenle, gfp kanalının arka plan sinyali için bir geçit kurmak için kullanılmıştır sonra-tazminat (Şekil 2). αSMA+ hücreleri MI'den 10 gün sonra yaralı sol ventrikülden GFP ekspresyonunun varlığına göre sıralandı. Endotel (GFP+/CD31+ hücrelerinin küçük bir yüzdesi; ...

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Bu protokol bize önemli saflıkta hem quiescent ve yaralanma kaynaklı aktif fibroblast popülasyonları izole sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı doğaçlama esnekliğidir. Akış için, yanı sıra boncuk tabanlı izolasyon, bir izole hedef hücrelerinden onları dışlamak için kirletici hücrelere karşı antikorlar dahil edebilirsiniz.Bu teknik öncelikle kardiyak fibroblast izolasyonu için kullanılır. Ancak, diğer dokulardan fibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. Bu prosedürü gösteren meiling Melzer, bir lisans stajyeri ve David Beier, benim laboratuvar bir araştırma asistanı olacaktır.Diseksiyon sırasında altı kalbi depolamak için altı kuyuluk bir tabak hazırlamak için, her kuyuya iki mililitre soğuk KHB dağıtın ve plakayı buza yerleştirin. Sprey% 70 etanol ile vücut. Ventral tarafı deneyciye bakacak şekilde yönlendirin.Paraziti önlemek için uzantıları sabitleyin. Karaciğer piercing olmadan, karın deri ve kas açık kesti. Göğüs kafesini dikey olarak kesin, kalbi delmeden göğüs kafesini dikkatlice aç.Sonra, kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesmeye devam edin. Forseps kullanarak, yavaşça göğüs kalbini kaldırın, herhangi bir akciğer veya kalp dışında bağlı aşırı doku keserek. Sol ventrikülden ayırın.Her diseksiyon için, altı kuyu plaka ayrı bir kuyuda ventrikül yerleştirin. İlk olarak, art arda sıkmak ve fazla kan kaldırmak için KHB ventrikül ajite forseps kullanın. Ventrikül'u temiz, steril, 10 santimetre karelik bir tabağa aktarın.Daha sonra, tek kenarlı bir bıçak kullanarak, hızlı bir şekilde küçük parçalar halinde ventrikül kıyma. Kollajenaz sindirim kokteyli bir mililitre ekleyin ve kıyma devam edin. Parçalar bir mililitrelik mikropipet ile aktası olacak kadar küçük olduğunda, bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Tabağı iki mililitre kokteylle iki kez yıkayın ve yıkamayı tüpe aktarın. Tüpü 30 dakika kuluçkaya yatırın ve el yazmasında açıklandığı gibi hücreleri beş mililitrelik pipet kullanarak yeniden askıya alın. İlk süspansiyondan sonra hücreleri 15 dakika kuluçkaya yatırın ve 10 mililitrelik pipet kullanarak tekrar askıya alın.Daha sonra, yeni, 50 mililitrelik konik tüpün üzerine 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirin ve süzgeci bir ila iki mililitre KHB ile ıslatarak süzgeçe asal layın. Sindirim süspansiyon için KHB 25 mililitre ekleyin ve resuspend. Gerektiğinde süzgeç yerine, süzgeç üzerinden süspansiyon filtre.400 kez g ve 4 santigrat derece 10 dakika filtrasyon santrifüj. Supernatant çıkarın ve kalp başına tampon beş mililitre kullanarak 1x RBC lysis tampon pelet resuspend. Süspansiyonu oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yattıktan sonra, süspansiyonu 400 kez g'de 10 dakika oda sıcaklığında santrifüj edin.Supernatant çıkarın ve sonra KHB bir mililitre pelet resuspend. Sonra, süspansiyon için KHB dokuz mililitre ekleyin. Süspansiyonu astarlı, 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün.Konik tüpü 400 kez g'de oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Son olarak, supernatant çıkarın ve fibroblast medya veya PBS bir mililitre pelet resuspend. Hücre numarası belirlendikten sonra, fibroblastlar el yazmasında açıklanan üç farklı yöntemle süspansiyondan izole edilebilir.Diferansiyel kaplama ile izolasyona başlamak için, her kuyuya iki mililitre fibroblast media ekleyerek altı kuyulu bir plaka hazırlayın. Iyi dipleri kapsayacak şekilde plaka girdap. Fare kalp hücreleri PBS askıya ise, santrifüj ve kalp başına fibroblast media bir mililitre onları resuspend.Her kuyuya bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı döndürün. Kuyu başına dört mililitreye kadar toplam hacim için iyi başına fibroblast medya ek bir ila iki mililitre ekleyin.4 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Fibroblastlar seçici olarak kuyulara yapışacağı için, ortam çıkarılarak ve atılarak izole edilebilirler. Kalan bağlı hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın ve daha sonra her kuyubaşına iki ila dört mililitre steril fibroblast media ekleyin.37 derecede kuluçkaya yat, her iki ila dört günde bir medya değiştirin. CD45-pozitif hematopoetik hücrelerin manyetik etiketleme ve ayrılmasına başlamak için, fare kalp hücrelerinin 500 kez g beş dakika için bir süspansiyon santrifüj. Supernatant çıkarın ve denge tampon bir mililitre hücre pelet yeniden askıya.Hemositometre kullanarak hücreleri say. Hücreleri tekrar santrifüj ettikten sonra, denge tampon hücre pelet resuspend. CD45-pozitif manyetik boncuklar ekleyin ve iyice karıştırın.En az 15 dakika 4 santigrat derecede kuluçkaya yat. Hücreleri denge tamponu ekleyerek yıkayın ve 500 kez g santrifüj dört santigrat derece 10 dakika boyunca. Supernatant çıkarın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak.Denge tamponunda peleti yeniden askıya alın. Hücre kümelerinin ayırma sütununun tıkanmasını önlemek için süspansiyonu 40 mikrometrelik bir filtreden geçirin. Ardından, uygun bir ayırıcının manyetik alanına bir ayırma sütunu yerleştirin ve sütunu en az üç mililitre PBS ile dengeleyin.Hücre süspansiyonuna sütundan dökün ve etiketlenmemiş hücreleri içeren akışı 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Sütunu üç mililitre lik denge tamponuyla üç kez yıkayın ve yıkamaları akışla birleştirin. Sütunu ayırıcıdan çıkarın ve sütunu 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.Etiketli CD45-pozitif hücreleri, pipet beş mililitre denge arabelleği sütuniçine ve sıkıca sütun dalma. Elüent tüpünü ve akış tüpünü 500 kez g.0.00'da santrifüj edin. Hemositometre kullanarak hücreleri say.İzolasyonun tamamlanması için, CD31-pozitif endotel hücreleri ve CD45-pozitif hücreler için protokole benzer MEFSK4-pozitif fibroblastlar için el yazmasındaki protokolleri uygulayın. Floresan aktive hücre sıralaması miyokard enfarktüsü sonrası alfa-SMA-GFP fare kalplerinden izole edilen tek hücrelerde yapıldı. Temsili bir gating şeması, CD31, CD45 veya AN2'yi birlikte ifade eden GFP pozitif hücreleri gösterir.Yaralı fare kalplerinde, endotel hücreleri ve hematopoetik hücrelerin küçük bir yüzdesi GFP ifade. Ancak, GFP-pozitif/CD31-negatif/CD45-negatif hücreler perisit belirteci AN2'yi ifade etmediler. GFP-pozitif hücreler alfa-SMA, kollajen bir alfa bir, periostin ve vimentin ifade.Selektif adezyon ile izole edilen yaralanmamış fibroblastlar vimentin imal etti ancak alfa-SMA, periostin veya kollajen bir alfa bir ekspresyonu göstermedi. Hem yaralanmamış hem de aktif fibroblastlar MEFSK4 antijenini ifade etti. Selektif adezyon la izole edilen yaralanmamış fibroblastlar ve alfa-SMA-GFP farelerinden izole edilen ve sıralanan miyofibroblastlar kollajen leziz olma yeteneğini gösterdi.Kuluçkadan önce dokuyu iyice kıymak önemlidir. Boncuk bazlı ayırmadan önce, hücre toplamalarını önlemek için süspansiyonun 40 mikrometrelik bir filtreden geçmesi önemlidir. Bu yöntemle saflaştırılan hücreler, yüksek saflık düzeyi sağlamak için perisite özgü antikorlarla ilişkili manyetik boncuklar kullanılarak daha da saflaştırılabilir.Yeni boncuk konjuge antikorların yanı sıra muhabir transgenik farelerin mevcudiyeti ile, bir izole etmek ve farklı hücresel popülasyonları incelemek için bu teknikleri kullanabilirsiniz, sadece fibroblastlar.

isolation-characterization-adult-cardiac-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yetişkin, kardiyak miyositler hayvan kalpleri izole edilebilir ve birkaç gün kültüre temel hücrelerdir. Bu kültür süre içinde adenoviral gen transferi, genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs) ya da floresan füzyon proteinleri ifade etmek için kullanılır. Her iki yaklaşım konfokal mikroskobi ile hücresel soruşturma izin verir.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Miyofibroblast fenotipine sahip murin ve insan özofagus stromal hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Kültürlenmiş hücreler iğ şeklinde morfolojiye sahiptir, α-SMA ve vimentin eksprese eder ve epitelyal, hematopoietik ve endotel hücre yüzey belirteçlerinden yoksundur. Karakterize edilmiş stromal hücreler, epitelyal-stromal etkileşimlerin fonksiyonel çalışmalarında kullanılabilir.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Bir fare kalpten farklı kardiyak hücre tiplerinin izolasyonu için çeşitli protokoller geliştirilmiş ve açıklanmıştır. Burada, yüksek kaliteli ana kardiyak hücre tiplerinin (kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastların) tek bir preparasyondan izole edilmesini sağlayan deneysel maliyetleri düşüren optimize edilmiş bir protokol tarif edilmiştir.

Bir Yetişkin Sıçan Kalpten Yüksek Kalitede Kardiyomiyosit, Endotel Hücresi ve Fibroblastların Eşzamanlı İzolasyonu

Burada, yalıtım ve yetişkin fare Ventriküler cardiomyocytes (R.V.C) tarımı için bir iletişim kuralı mevcut. İzole R.V.C kısa ve uzun vadeli tarım için kullanılabilir. Yalıtım ve R.V.C ekimi kalp hastalıkları için yeni tedavi rejimlerinin geliştirilmesi önemli bir rol oynayabilir.

Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı

Burada, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu tek hücreli atriyal cardiomyocytes yalıtım için açıklayınız. El ile düzenleme intraluminal basınç kalp boşlukları, işlevsel olarak sağlam miyositler uyarma-kasılma-kaplin çalışmaları için uygun verim için uygulanır.

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Rafine bir doku temizleme yöntemi geliştirildi ve yetişkin fare kalbine uygulandı. Bu yöntem, genetik bir muhabir stratejisine atfedilen etiketli fibroblast floresan korurken yoğun, otoflüoresan kalp dokusunu temizlemek için tasarlanmıştır.

Sağlıklı ve Yaralı Fare Kalplerinde Üç Boyutlu Fibroblast Organizasyonu için Rafine CLARITY Tabanlı Doku Temizleme

Öğrenin, fare kalbinden yüksek saflıkta kardiyak fibroblast ve miyofibroblast izolasyonu için bu protokolü. Yara iyileşmesi ve fibroz araştırmalarında hücre fonksiyonlarını anlamak için kritik bir yöntem sunar.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet