Name: In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Keşfedin in vivo hızlı fotokimyasal protein oksidasyonu (IV-FPOP) tekniğini, Caenorhabditis elegans model organizmasında protein etkileşimlerini ve yapı değişikliklerini incelemek için. Bu yöntem, kütle spektrometrisi ile birleştirilerek canlı organizmalarda protein dinamiklerini gerçek zamanlı analiz etme olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Maryland Üniversitesi, Baltimore ve LMJ'ye verilen NIH 1R01 GM 127595 başlangıç fonları tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, dr. Daniel Deredge'e el yazmasının düzenlenmesindeki yardımları için teşekkür eder.

1. C. elegans bakım ve kültür
<ol><li>Büyümek ve standart laboratuvar prosedürleri 8 aşağıdaki dördüncü larva (L4) aşamasına solucan kolonileri senkronize.</li>
	<li>IV-FPOP deney günü, Bakteriyel çimenlerden L4 solucanları yıkayın (OP50 E. coli)M9 tampon (0.02 M KH2PO4, 0.08 M Na2HPO4, 0.08 M NaCl, 1 mM MgSO4).</li>
	<li>IV-FPOP numunesi başına ~10.000 solucanın 500 μL aliquot'u edinin.</li>
</ol>2. Mikroakışkan akış sistemi montajı
<ol><li>2 cm'lik florlu etilen propilen (FEP) boru (1/16 in. dış çap (o.d.) x 0,020 iç çapı (i.d.)) keserek akış sistemi montajını başlatın.</li>
	<li>Temiz bir kesme iğnesi kullanarak, FEP borularının iliğini genişleterek sadece bir ucunda küçük bir krater, ~50 mm uzunluğunda olun. Krater, erimiş iki adet 360 μm o.d. parçasını sığdıracak kadar büyük olmalıdır. NOT: Bu uç sadece çıkış kılcal sığdırmak için kullanılacak gibi ters ucu genişletmeyin.</li>
	<li>Bir seramik kesici ile, 250 μm i.d. erimiş silika iki 15 cm adet kesti. Bu iki parça akış sisteminin infüzyon hatları olacak.</li>
	<li>Kendinden yapışkanlı bant kullanarak, iki 250 μm i.d. kılcal damarları birbirine paralel ve uçları0 kızartılır sağlamak için bantlayın. NOT: Erimiş silika uçlarının kesimden sonra ezilememesi ve düz ve 0 birbirine kızarmaması için büyüteç le veya stereo mikroskop altında incelenmesi tavsiye edilir.</li>
	<li>İki bantlı kılcal damarı FEP borunun el yapımı kraterine takın. Kılcal damarları el yapımı kraterin kenarına doğru itin. DİkKAT: Akış sisteminin etkinliğini korumak için, el yapımı kraterin ötesine itmeyin (Şekil 1a).</li>
	<li>Temiz bir yüzeye epoksi reçine küçük bir nokta yerleştirin ve bir kesme iğnesi ile karıştırın.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde, aynı iğneyi kullanarak, FEP tüpü ile bağlanan ve rekarin kurumasını sağlamak, çıkış tarafı kadar asılı, birkaç dakika için infüzyon kılcal damarların sonuna rezorin küçük bir damla yerleştirin(Şekil 1a).</li>
	<li>Rezorin kururken, FEP tüpü ve iki kılcal damarı birbirine bağlayarak, yeni bir 250 μm i.d. kılcal damar ı kesin. Yeni kılcal akış sisteminin çıkış kılcal olacak. Kılcal damarın istenilen uzunluğu aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60910/60910eq1.jpg"> L santimetre olarak kesilecek kılcal damar uzunluğu, t dakika içinde istenilen reaksiyon süresi, f mL /min akış hızı, i.d. santimetre olarak kapiller iç çapıdır. NOT: Çıkış kılcal damarını kestikten sonra uçları düz ve ezmemesini sağlayarak inceleyin.</li>
	<li>Rezorin kuruduktan sonra, fep boru çıkış ucundan yeni kılcal yerleştirin. Çıkış kılcal ve iki infusing kılcal damarların iç uçları FEP tüpü içinde birbirlerine karşı floş olmalıdır, bu karıştırma-T oluşturur (Şekil 1b).</li>
	<li>2.6 ve 2.7 adımlarında açıklandığı gibi çıkış kılcal damarını ve FEP tüplerini taze epoksi reçine ile bağlayın.</li>
	<li>Reişin bir gecede kurumasını bekleyin ve akış sistemini birbirine bağlayın. Ertesi gün mikroakışkan akış sistemini kurmak(Şekil 1c).</li>
</ol>3. In vivo FPOP için mikroakışkan akış sistemi
<ol><li>Bir 5 mL şırınganın içine dört manyetik karıştırıcı yerleştirin. Bu şırınga örnek şırınga olur. Manyetik karıştırıcılar IV-FPOP sırasında şırınga nın içine yerleşen solucanları önler (Şekil 2A).</li>
	<li>İki 5 mL şırıngayı M9 ile doldurun. Onlar akış hızı ve karıştırma verimliliği etkileyebilir gibi her şırınga içinde hiçbir hava kabarcıkları olduğundan emin olun.</li>
	<li>Luer adaptörünü her 5 mL şırıngaya bağlayın ve parmaklarını sıkıca sıkıtutun ve yerinde sabitlenin.</li>
	<li>Her şırıngayı tek bir 3-2 valfine takın. Şırınga vananın orta noktasına takılmalıdır(Şekil 2B).</li>
	<li>Her 5 mL şırıngayı çift şırınga pompasına sabitleyin ve itici bloğundan şırınganın aşırı basıncını önlemek için mekanik stop yakasını ayarlayın. Stop yakasını ayarlarken manyetik karıştırıcıların eklenmesini unutmayın.</li>
	<li>Ev yapımı mikroakışkan akış sisteminin her bir infusing kapiller ucunu süper flangeless somunu, FEP kılıfı ve süper flangeless ferrule kullanarak her 3-2 valfin üst portuna takın (Şekil 2B).</li>
	<li>3-2 valfin (alt bağlantı noktası) kalan açılan bağlantı noktasına, süper flangeless somunu, FEP kılıfı ve süper flangeless ferrule kullanarak 10 cm 450 μm i.d. kılcal damar ı takın (Şekil 2B). Bu kılcal damarlar geri çekilen örnek kılcal damarlar haline gelir.</li>
	<li>Pompa akışını başlatın ve mikroakışkan akış sisteminin tüm bağlantılarını görsel sızıntılar için kontrol edin. Deneysel akış hızını kullanarak en az üç şırınga hacmi akışı. Son akış hızı lazer ışınlama penceresine, lazer frekansına ve sıfır dışlama fraksiyonhacmine bağlıdır. NOT: Bu protokol için 2,55 mm, 250 μm i.d. erimiş silika, sıfır dışlama fraksiyonu ve 50 Hz frekanslı lazer ışınlama penceresinden 375,52 μL/dk nihai akış hızı hesaplanmıştır.<ol>
<li>Akış yolu 3-2 valf sapındaki oklarla işaretlenir. Her şırınga, valf kolunun sınır dışı konumundan geri çekilme pozisyonuna taşınması yla manuel olarak doldurulabilir. NOT: 3-2 valftaki sızıntılar süper flangeless somunu yeniden vidalayarak veya vana bağlantılarından herhangi birinin (süper flangeless somunu, FEP kılıfı veya süper flangeless ferrule) değiştirilmesiyle düzeltilebilir. Karıştırma-T'deki sızıntılar mikroakışkan akış sisteminin yeniden bir araya alınmasını gerektirir (2.1-2.11. adımlar).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroakışkan akış sistemini deneysel tezgaha taşıyın ve 360 μm paslanmaz çelik birliğini kullanarak çıkış kılcal damarını yayılan aşamaya sabitle(Şekil 2C,D).</li>
	<li>Uzun menzilli bir çakmak kullanarak, lazer ışınlama penceresinde erimiş silika nın kaplamasını yakın. Yanmış kaplamayı tüy bırakmayan doku ve metanol kullanarak temizleyin. NOT: Aşırı ısı eriyebileceği ve/veya kılcal damarı kırabileceğinden kapillerin aşırı ısınmasını önlemek için yanma döngüleri ve metanol temizleme döngüleri arasında geçiş yapabilirsiniz.</li>
	<li>Manyetik karıştırıcı bloğunu manyetik karıştırıcıları içeren 5 mL şırınganın üzerine yerleştirin. Manyetik karıştırıcı bloğunun hızını ve konumunu, 5 mL şırınganın içindeki manyetik karıştırıcıların yavaş ve sürekli dönmesini sağlayacak şekilde ayarlayın.</li>
</ol>4. In vivo FPOP
<ol><li>KrF excimer lazerini açın ve thyratron'un ısınmasını bekleyin. DİkKAT: Lazer, gözlere zarar verebilecek 248 nm dalga boyunda görünür ve görünmez radyasyon yayar. Lazeri açıp ışın çıkış penceresini açmadan önce uygun göz koruması takılmalıdır.</li>
	<li>Lazer enerjisini en az 100 darbe için 50 Hz frekansta, optik sensörü ışın çıkış penceresine yerleştirerek ölçün. NOT: Bu protokol için 150 ± 2,32 mJ lazer enerjisi ile 2.55 mm ışınlama penceresi kullanılmıştır.</li>
	<li>Yaklaşık 10.000 solucan (500 μL) edinin ve numuneyi numune şırıngasına el ile çekin.</li>
	<li>3 mL'lik son numune hacmi için numune şırıngasını 2,5 mL M9 tamponuyla doldurun. Numune şırıngasına hava kabarcıkları girmediğinden emin olun.</li>
	<li>İkinci şırıngayı 3 mL 200 mM H2O2ile doldurun , yine şırıngaya hava kabarcıkları girmemesini sağlar.</li>
	<li>Çıkış kılcal damarının sonunda, 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) içeren alüminyum folyoya sarılmış 15 mL konik tüp ve h2 O2,hidroksil radikalleri ve methionin süloksit redüktaz aktivitesini söndürmek için %1 dimetil sülfoksit yerleştirin.</li>
	<li>Excimer lazerini yazılım penceresinden başlatın, ilk darbeyi bekleyin ve çift şırıngadan örnek akışını başlatın. NOT: Numuneler 3 örnek altında teknik trikifler halinde biyolojik tekrarlar halinde çalıştırılmalıdır: H2O2 (örnek) ile lazer ışınlama, H2O2 ile lazer ışınlama ve hiçbir lazer ışınlama h2O2 (kontroller), biyolojik set başına 9 örnek toplam.</li>
	<li>Numune şırıngasından gelen bazı geri basınç bazen birikebileceğinden, numunenin tamamını 15 mL tüpte toplayın ve herhangi bir görsel sızıntı için numune akışını aktif olarak izleyin.</li>
	<li>IV-FPOP'tan sonra, 2 dk için 805 x g santrifüjlü pelet solucanları söndürme solüsyonu çözeltisini çıkarın, 250 μL lysis tamponu ekleyin (8 M üre, %0.5 SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM fenilmetilülfonil florür [PMSF]) ekleyin. Numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, flaş dondurun ve numune sindirimi kadar -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>5. Protein ekstraksiyonu, saflaştırma ve proteozis
<ol><li>Buzüzerinde dondurulmuş örnekleri eritmek ve 10 s için sonication tarafından homojenize, 60 s buz kuluçka takip. Birden fazla sonication tur gerekli olabilir, homojen bir stereomikroskop altında bir mikroskop slayt üzerinde 2 μL örnek aliquot yerleştirerek görülebilir. Küçük ve hiç solucan parçası görülmediğinde örnek homojenizasyon tamamlanır.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika 400 x g'de homojenize solucanları santrifüj edin ve süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını kullanarak bicinchoninic asit testini (BCA tsay) kullanarak örnek protein konsantrasyonlarını belirleyin. NOT: Numune konsantrasyonu herhangi bir biyokimyasal protein konsantrasyonu sonucu seçilebilir. Lysis tamponu ile reaktif uyumluluğunu unutmayın (8 M üre, %0.5 SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Ayrıca, bir tampon seyreltme gerekli olabilir.</li>
	<li>Her numuneden 100 μg protein alın ve temiz mikrosantrifüj tüplere yerleştirin.</li>
	<li>Tüm numunelerde disülfür bağlarını azaltmak için 10 mM'lik son konsantrasyona dithiothreitol (DTT) ekleyin. Girdap, aşağı spin ve 45 dakika boyunca 50 °C'de inkübasyon örnekleri.</li>
	<li>Numuneleri 10 dk oda sıcaklığına kadar soğutun.</li>
	<li>Azaltılmış kalıntıları alkillemek için 50 mM'lik son konsantrasyona iodoacetamide (IAA) ekleyin. Vorteks, aşağı spin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübasyon örnekleri.</li>
	<li>Alkililasyondan hemen sonra, protein örneğini 4 cilt önceden soğutulmuş aseton ekleyerek çökün ve gece boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ertesi gün, pelet protein10 dakika için 16.000 x g santrifüj tarafından çökelti.</li>
	<li>Protein peletini 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL) olarak yeniden askıya alın. 1:50 (w/w) protein oranına son bir proteazda tripsin ekleyin ve numuneleri bir gecede 37 °C'de sindirin.</li>
	<li>Ertesi gün% 5 formik asit ekleyerek tripsin sindirim reaksiyonu söndürmek. NOT: LC-MS/MS analizi için numune başına en az 0,5 μg peptid gereklidir (6.1-6.5 adım). Üreticiprotokolünde açıklandığı gibi nicel kolorimetrik peptit testini (Malzemeler Tablosunabakın) kullanarak örnek peptid konsantrasyonlarını belirleyin.</li>
</ol>6. Yüksek performanslı sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS)
<ol><li>Aşağıdaki LC mobil fazlarını kullanın: %0,1 FA (A) ve %0,1 FA (B) ile ACN'de su.</li>
	<li><li><li><li> </li></ol><ol><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60910/60910eq2.jpg"> </li></ol>

<ol><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li>
<li>Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+for+Epitope+Mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping.</a> Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li>
<li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li>
<li>Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+Biological+Interactions+with+in+Vivo+Protein+Footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting.</a> Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).</li>
<li>Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+protein+structure+by+hydroxyl+radical+footprinting-mediated+structural+mass+spectrometry%3A+a+protection+factor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis.</a> Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).</li>
<li>Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+photobiology+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+action+spectra%2C+absence+of+photoreactivation+and+effects+of+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine.</a> Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).</li>
<li>Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+Folding+Kinetics+Studied+by+Time-Resolved+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Xu, G., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical-mediated+modification+of+proteins+as+probes+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics.</a> Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li>
<li>Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfate+radical+anion+as+a+new+reagent+for+fast+photochemical+oxidation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).</li>
<li>Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+quantitation+strategy+for+hydroxyl+radical-mediated+protein+footprinting+using+Proteome+Discoverer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).</li>
<li>Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Assay+for+the+Rate+of+Removal+of+Extracellular+Hydrogen+Peroxide+by+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells.</a> Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).</li>
<li>Gazda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+chaperone+UNC-45+is+organized+in+tandem+modules+to+support+myofilament+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans.</a> Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).</li>
<li>Willard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VADAR%3A+a+web+server+for+quantitative+evaluation+of+protein+structure+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).</li>
<li>Broussard, J. A., Green, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Techniques+Made+Simple%3A+Methodology+and+of+F%C3%B6rster+Resonance+Energy+Transfer+%28FRET%29+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).</li>
<li>Kaur, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Structural+Biology+through+the+Lens+of+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).</li>
<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPulak%2C+R+%22C.+elegans%3A+Methods+and+Applications%22">C. elegans: Methods and Applications</a>. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).</li>
<li>Rinas, A., Jones, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Coupled+to+Multidimensional+Protein+Identification+Technology+%28MudPIT%29%3A+Expanding+Footprinting+Strategies+to+Complex+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).</li>
<li>Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Initiated+Radical+Trifluoromethylation+of+Peptides+and+Proteins%3A+Application+to+Mass-Spectrometry-Based+Protein+Footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).</li>
</ol>

Bu yayın JAE Doktora tezinin kısmen yerine getirilmesi ile yazılmıştır. Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

In vivo protein-protein etkileşimlerinin (ÜFE) araştırılmasında geçerli kriter floresan rezonans enerji transferidir (FRET). Bu teknik, en basit haliyle, iki molekül arasındaki enerji transferi ile ÜFE'yi, birbirine yakın olduklarındainceler 15. MS tekniklerinin aksine, FRET amino-asit düzeyinde konformasyonel değişiklikleri ve etkileşim bölgelerini karakterize etme çözünürlüğüne sahip değildir. MS tabanlı teknikler ppi16çalışması için giderek kullanılmaktadır. IV-FPOP, C. elegans in vivo protein yapısal analizisağlayan bir HRPF yöntemidir. C. eleganları IV-FPOP ile başarılı bir şekilde etiketlemek için numune kaybını azaltmak için mikroakışkan akış sisteminin düzgün bir şekilde monte edilmesi önemlidir. 250 μm i.d. kılcal damar, daha küçük i.d. kılcal damarlara kıyasla numune geri kazanımını en üst düzeye çıkarmıştır4. Daha büyük i.d. kılcal damarlar test edilmemiştir, ancak mikroakışkan akış sistemi C. eleganssıralama için ticari olarak kullanılabilir akış sitometri sistemi olarak aynı i.d. ile bir kılcal kullanılarak tasarlanmıştır. 17 Solucan numunesi boyutu da önemlidir, FPOP'dan önce numune başına ~10.000'den az bir numune boyutu LC-MS/MS analizi için yeterince yüksek protein konsantrasyonları sağlamaz. Daha yüksek numune boyutları (>10.000 solucanlar) da ilk başlangıç hacmi (adım 4.5) ayarlayarak kullanılabilir.
Mikroakışkan akış sisteminin doğru montajı önemlidir. Örnek yoldaki sızıntılar solucanların tutarsız akışına veya H2O2'yeneden olur. Ferrules, kollu ve 3-2 vanalar, her deneyden sonra düzgün bir şekilde temizlenirse birden fazla IV-FPOP deneyinden yeniden kullanılabilir. Ancak, her biyolojik çoğaltma için yeni bir mikroakışkan akış sistemi monte öneririz. Mikroakışkanlar düzgün bir şekilde monte edilirse, solucanlar ve H2O2 karıştırma-T'de en az geri basınçla karışır. Mikroakışkan akış sisteminin kalite kontrolü (QC) olarak, renkli boyalar kullanarak karıştırma verimliliğini test etmenizi öneririz. IV-FPOP sırasında solucan şırıngasının içindeki manyetik karıştırıcıların hareketini izlemek önemlidir, solucan şırıngasında yanlış numune karıştırılması veya karıştırma-T'nin geri basınç la ilgili sızıntılara neden olması önemlidir. Buna ek olarak, kötü karıştırma koşulları büyük numune kayıplarına, lazer penceresinde solucanların kötü lazer maruziyetine ve tıkanmaya yol açar.
C. elegans bakımı arka plan oksidasyonunu azaltmak için önemlidir. Yüksek sıcaklıklar toplam arka plan oksidasyonunu etkileyebileceğinden, solucanların düşük stresli sıcaklıklarda düşük sıcaklıklarda büyümesini öneririz. Sadece bir kontrol solucanı örneği seti, h2O2 ve lazer ışınlaması yok, tüm IV-FPOP deneyleri için laboratuvar bakımı nedeniyle arka plan oksidasyonu için hesap önerilir. Bu tekniğin mevcut sınırlamalarından biri, daha yüksek protein yapısal bilgi elde etmek için tanımlanan oksidatif modifiye peptidlerin toplam sayısı ve peptid başına oksitlenmiş toplam kalıntı sayısıdır. Tavsiye edilmese de, oksidatif modifikasyonlarda bir artış hidrojen peroksit yüksek konsantrasyonlarda kullanılarak elde edilebilir. Hidrojen peroksit bir artış önemli biyolojik yolları önemli ölçüde değiştirmek yanı sıra oksidasyona bağlı unfolding yol açabilir. IV-FPOP için hidrojen peroksit konsantrasyonu artarsa, 200 mM'nin üzerinde konsantrasyonlar test edilmedikçe solucancanlılığı ve arka plan oksidasyonunun test edilmesi önerilir.
Açıklanan LC-MS/MS protokolü diğer laboratuvarların MS QC'sini karşılayacak şekilde optimize edilebilir ve değiştirilebilir. 2D-kromatografi tekniklerinin kullanımı daha önce oksidatif modifiye peptidler ve proteinlerin belirlenmesini artırmak için gösterilmiştir18. Bununla birlikte, belirli bir proteini hedefleyen protein zenginleştirme teknikleri antikor yağışları veya aşağı çekme tahlilleri dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere tavsiye edilmez. Proteinin epitop/bağlayıcı bölgesi IV-FPOP tarafından oksidatif olarak değiştirilmişse, bu teknikler bir protein konkordatocuya karşı önyargılı olabilir. Sülfat radikal anion10 veya trifluoromethylation19 gibi radikal reaktiflerin ayak izindeki yeni gelişmeler IV-FPOP'un çok yönlülüğünü artırabilir. Şimdiye kadar in vivo test edilen tek etiketleme reaktifi hidrojen peroksit olmasına rağmen, diğer lazer ile aktive radikaller optimize edilebilir. Diğer radikallerin kullanımı solucan canlılığı ile uyumlu olduğu kanıtlanmalıdır, hücre geçirgen, ve 248 nm lazer dalga boyu. Birçok insan hastalıkları için bir model sistem olarak C. elegans kullanımı sayesinde, IV-FPOP hastalık patogenezinde protein yapısının rolünü n çalışmada güçlü bir etkiye sahip potansiyeline sahiptir.

Protein ayak izi kütle spektrometresi (MS) ile birleştiğinde son yıllarda protein etkileşimleri ve konformasyonel değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır. Hidroksil radikal protein ayak izi (HRPF) yöntemleri protein amino asit yan zincirleri değiştirerek protein çözücü erişilebilirliğini araştırmak. HRPF yöntemi, proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonu (FPOP)1, in vitro protein yapısını araştırmak için kullanılmıştır2, hücre içi (IC-FPOP)3, ve en son in vivo (IV-FPOP)4. FPOP hızla hidroksil radikalleri oluşturmak için hidrojen peroksit fotolizi ile hidroksil radikalleri oluşturmak için bir 248 nm dalga boyu excimer lazer kullanır1. Buna karşılık, bu radikaller 20 amino asitten 19'unu mikrosaniye ölçeğinde etiketleyebilirler, proteinlerin ortaya çıkabileceğinden daha hızlı. Her amino asitin hidroksil radikallerle olan reaktivitesi 1000 kat uzamasına rağmen, bir koruma faktörü (PF)5hesaplanarak yan zincir oksidasyonunu normalleştirmek mümkündür.
FPOP proteinleri büyüklüklerine veya primer sekanslarına bakılmaksızın oksidatif olarak değiştirebildiği için, hücre içi ve in vivo protein çalışmaları için avantajlı olduğunu kanıtlamaktadır. IV-FPOP, C. elegans'taki protein yapısını in vitro ve hücre içi çalışmalara benzer şekilde inceler4. C. elegans nematod ailesinin bir parçasıdır ve yaygın insan hastalıkları çalışma için bir model olarak kullanılır. Solucanın hem pasif hem de aktif difüzyon ile hidrojen peroksit alabilme yeteneği farklı vücut sistemlerinde protein yapısının incelenmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, C. elegans FPOP6için gerekli 248 nm lazer dalga boyu kendi şeffaflık nedeniyle IV-FPOP için uygundur. Bu yöntemin kütle spektrometresi ile birleşmesi, geleneksel aşağıdan yukarıya proteomik yaklaşımlar kullanarak birden fazla modifiye proteinin belirlenmesine olanak sağlar.
Bu protokolde, C. elegansprotein yapısının analizi için IV-FPOP nasıl gerçekleştirilin ilerler. Deneysel protokol, Konermann ve ark7'denuyarlanan IV-FPOP için mikroakışkan akış sisteminin kurulmasını ve kurulmasını gerektirir. IV-FPOP'tan sonra proteinler protein ekstraksiyonu için homojenize edilir. Protein örnekleri proteozize edilir ve peptidler sıvı kromatograf (LC) tandem MS ile analiz edilir ve ardından nicelleştirme yapılır.

<table><tbody><tr><td>15 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>herhangi bir marka yeterlidir</td></tr><tr><td>5 mL Gaz Geçirmez Şırınga, Çıkarılabilir Luer Kilidi</td><td>SGE Analitik Bilim</td><td>008760</td><td>2 minimum</td></tr><tr><td>60 Sonik Ayırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>FM3279</td><td>Bu ürün artık kullanılamıyor. Herhangi bir düşük hacimli sonikatör yeterli olacaktır</td></tr><tr><td>Aseton, HPLC Sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>4 L miktar gerekli değildir</td></tr><tr><td>% 0.1 Formik Asit (v / v), LC / MS Sınıfı Asetonitril,</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Sınıfı Simetri C18 Tuzak Sütunu, 100 & Aring;, 5 & mikro; m, 180 ve mikro; m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td><td>Sular</td><td>186007496</td><td></td></tr><tr><td>AKLIYAT UPLC M-Sınıfı Sistem</td><td>Suları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Folyo</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>her marka yeterlidir</td></tr><tr><td>Aqua 5 &micro; m C18 125 & Aring; ambalaj malzemesi</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Görev Silecekleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon İğnesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-525</td><td>sadece bir çifte ihtiyaç var</td></tr><tr><td>Dithiothreiotol (DTT)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490-00005</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Susuz</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi anında karışım 5 dakika</td><td>Loctite</td><td>1365868</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>EX350 excimer lazer (248 nm dalga boyu)</td> <td>GAM Lazer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEP Boru 1/16 "OD x 0.020" ID</td><td>IDEX Sağlık ve Sciene</td><td>1548L</td><td></td></tr><tr><td>Formik Asit, LC / MS Sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>HV3-2 VANA</td><td>Hamilton</td><td>86728</td><td>2 minimum</td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>herhangi bir %30 hidrojen peroksit yeterlidir</td></tr><tr><td>İyodoasetamid (IAA)</td><td>ACROS Organics</td><td>122270050</td><td></td></tr><tr><td>Legato 101 şırınga pompası</td><td>KD Scientific</td><td>788101</td><td></td></tr><tr><td>Luer Adaptörü Dişi Luer 1/4-28 Erkek Polipropilen</td><td>IDEX Sağlık & Sciene</td><td>P-618L</td><td>2 minimum</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, LC / MS Sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td>4 L miktar gerekli değildir</td></tr><tr><td></td><td>Mikrosantrifüj Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>N, N ve asal; -Dimetiltiyoüre (DMTU)</td> <td>ACROS Organics</td><td>116891000</td><td></td></tr><tr><td>NanoTight Kılıf Yeşil 1/16" ID x .0155" ID x1.6"'IDEX</td> <td>Sağlık & Sciene</td><td>F-242X</td><td></td></tr><tr><td>NanoTight Kılıf Sarı 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6"</td> <td>IDEX Sağlık & Sciene</td><td>F-246</td><td></td></tr><tr><td>N-tert-Butil-&alfa;-fenilnitron (PBN)</td><td>ACROS Organics</td><td>177350250</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur Fenilmetil Sülfonil Florür (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7110-OP</td><td>herhangi bir proteaz inhibitörü yeterlidir</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Kütle Spektrometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>diğer yüksek çözünürlüklü cihazlar (örneğin Q exactive Orbitrap veya Orbitrap Fusion) kullanılabilir</td></tr><tr><td>PE50-C piroelektrik enerji ölçer</td><td>Ophir Optronics</td><td>7Z02936</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kantitatif Kolorimetrik Peptit Testi</td><td>Thermo Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>A53225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Tripsin Proteaz, MS Sınıfı</td><td>Thermo Scientific</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro Yarma Taşı, 1" x 1" x 1/32"</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>herhangi bir kılcal boru kesici yeterlidir</td></tr><tr><td>Polimikro Esnek Sigortalı Silika Kılcal Boru, İç Çap 250 ve mikro; m, Dış Çap 350 ve mikro; m, TSP250350</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150026</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro Esnek Sigortalı Silika Kılcal Boru, İç Çap 450 ve mikro; m, Dış Çap 670 ve mikro; m, TSP450670</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro Esnek Sigortalı Silika Kılcal Boru, İç Çap 75 & m, Dış Çap 375 & mikro; m, TSP075375</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150019</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>P382-500</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discover (aşağıdan yukarıya proteomik yazılımı)</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-30799</td><td></td></tr><tr><td>Döner Manyetik Tamburlu Karıştırıcı</td><td>V& P Bilimsel A.Ş.</td><td>VP 710D3</td><td></td></tr><tr><td>Döner Manyetik Tamburlu Karıştırıcı, Şırınga Pompaları V & ile kullanım için aksesuar kiti</td><td> P Bilimsel A.Ş.</td><td>VP 710D3-4</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-111-1315</td><td>herhangi bir makas yeterlidir</td></tr><tr><td>Kendinden Yapışkanlı Etiket Bandı</td><td>Fisher Scientific</td><td>15937</td><td>bir rulo yeterlidir</td></tr><tr><td>Snap-Cap Mikrosantrifüj Flex-Tüp Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402</td><td>herhangi bir marka yeterlidir</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-525-017</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik Heptahidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Zoom Mikroskop</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-014</td><td>bir büyüteç yeterlidir</td></tr><tr><td>SST Halkalı Süper Flanşsız Yüksük, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Düz Tabanlı, 1/16" OD</td><td>IDEX için Sağlık & Sciene</td><td>P-259X</td><td></td></tr><tr><td>Süper Flanşsız Somun PEEK 1/4-28 Düz Tabanlı, 1/16" & 1/32" OD</td><td>IDEX Sağlık & Sciene</td><td>P-255X</td><td></td></tr><tr><td>Süper Tamburlu Karıştırma Diski, 3,35 mm çap, 0,61 mm kalınlık</td><td>V& P Bilimsel A.Ş.</td><td>VP 722F</td><td></td></tr><tr><td>Tris Taban</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Evrensel Taban Plakası, 2.5" x 2.5" x 3/8"</td> <td>Thorlabs Inc.</td>360 ve mikro için <td>UBP2</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Fisher Scientific</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>VHP MicroTight Birliği; m OD</td><td>IDEX Sağlık & Sciene</td><td>UH-436</td><td>%</td></tr><tr><td>0,1 Formik Asit (h/h) içeren minimum 2 Su, LC/MS Sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>Su, LC/MS Sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo hidroksil radikal protein ayak İzi caenorhabditis elegans protein etkileşimleri Çalışması için

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Proteinlerin hızlı oksidasyonu (FPOP), protein yapısı, protein-ligand etkileşimleri ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılan hidroksil radikal protein ayak izi (HRPF) yöntemidir. FPOP, hidrojen peroksit fotolizi için 248 nm'de krf excimer lazer kullanır ve hidroksil radikalleri oluşturur ve bu lazerler oksidatif olarak çözücü olarak erişilebilen amino asit yan zincirleri değiştirir. Son zamanlarda, Biz Caenorhabditis elegans in vivo oksidatif etiketleme FPOP kullanımını genişletti(C. elegans),IV-FPOP başlıklı. Şeffaf nematodlar birçok insan hastalığı için model sistemler olarak kullanılmıştır. IV-FPOP tarafından C. elegans yapısal çalışmalar hidrojen peroksit alımı için hayvan Yeteneğini nedeniyle uygulanabilir, lazer ışınlama şeffaflık 248 nm, ve modifikasyon geri dönüşü olmayan doğası. IV-FPOP etiketleme, IV-FPOP parametreleri, protein ekstraksiyonu ve LC-MS/MS optimize edilmiş parametreler için mikroakışkan akış sisteminin montajı burada açıklanmıştır.

IV-FPOP için kullanılan mikroakışkan akış sisteminde, H2O2 ve solucanlar lazer ışınlamadan hemen öncesine kadar ayrı tutulur. Bu ayrım endojen katalaz ve diğer hücresel mekanizmalar12tarafından H2O2 dökümünü ortadan kaldırır. 250 μm i.d. kapiller in kullanımı iki biyolojik kopyada c-89 arasında toplam numune geri kazanımı gösterirken, 150 μm i.d. kapiller sadece !-31 iyileşme gösterir(Şekil 3A). Daha büyük bir i.d. kılcal (250 μm) kullanımı, IV-FPOP ve tek solucan akışı sırasında daha iyi solucan akışına(Şekil 3B)daha küçük bir i.d. kılcal damar (150 μm)(Şekil 3C)ile karşılaştırıldığında yol açar. 150 μm i.d. kılcal damar tek bir solucan akışına izin vermez(Şekil 3C)ve birden fazla solucanın tek bir solucan başına lazer maruziyet miktarını azaltan lazer ışınlama penceresinde birlikte aktığı görülür.
IV-FPOP, C. elegans'tasolvent erişilebilirliğini araştıran kovalent bir etiketleme tekniğidir. Şekil 4A, fpop modifiye edilmiş ve değiştirilmemiş bir peptitin temsili çıkarılan iyon kromatogramlarını (EIC) gösterir. Hidroksil radikal etiket oksidatif modifiye peptidlerin kimyasını değiştirir, böylece FPOP modifiye peptidler daha polar hale. Ters faz kromatografisinde IV-FPOP modifiye peptidler, değiştirilmemiş peptidlere göre daha erken retansiyon sürelerine sahiptir. İzole peptidlerin MS/MS parçalanması oksidatif olarak modifiye edilmiş kalıntıların tanımlanmasını sağlar(Şekil 4B).
IV-FPOP, C. elegans içinde iki biyolojik kopyada toplam 545 proteinin oksidatif olarak modifiye edilmiş olduğunu göstermiştir(Şekil 5A,B). Protein ayak izi yöntemi olarak IV-FPOP'un bir avantajı, tekniğin solucanlar içindeki çeşitli vücut sistemlerinde proteinleri değiştirme yeteneğine dayanır(Şekil 5C). Bu yöntem, solucan ın içindeki vücut dokusu veya organıne bakılmaksızın protein yapısını ve protein etkileşimini araştırmaya olanak sağlar. Ayrıca, tandem MS analizi iv-FPOP probları solvent erişilebilirlik in vivo doğrular. Miyozin şaperon proteini UNC-45 ile kompleks olan ısı şok proteini 90 'ın (Hsp90) oksidasyon paterni analiz edilmiştir(Şekil 6). Hsp90 için MS/MS analizi dört oksidatif modifiye kalıntı(Şekil 6C,D),FPOP modifikasyonunun normalleştirilmiş kapsamını (ln(PF))5 gösterir Hsp90'ın kalıntısı M698'in UNC-45'e(Şekil 6C)bağlı yken R697, E699 ve E700 artıklarından daha az çözücü olarak erişilebilir olduğunu göstermektedir. Oksidasyondaki bu farklılıklar literatür solvent erişilebilir yüzey alanı (SASA) hesaplamaları (PDB 4I2Z13)ile doğrulanır. Kalıntı M698, r697, E699 ve E700 kalıntıları ile karşılaştırıldığında gömülü bir kalıntı olarak kabul edilir 0.03 sasa değerine sahiptir(Şekil 6C). 14.000
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig1.jpg"> Şekil 1. In vivo FPOP mikroakışkan akış sistemi şeması. (A) IV-FPOP akış sisteminin iki infüzyon çizgisi (turuncu) FEP borusu içinde gösterilir (sarı), epoksi reçinenin doğru bağlanma pozisyonu açık mavi daire ile gösterilir. (B) Üç 250 μm i.d. kılcal damardan oluşan komple birleştirilmiş karıştırma-T. Priz kılcal damarının FEP borusundaki doğru rezorin bağlama pozisyonu açık mavi daire ile temsil edilir. (C) C. elegansin vivo kovalent etiketleme için komple monte akış sistemi . FPOP'tan önce solucanlar H2O2'den etiketlemeden hemen öncesine kadar ayrı tutulur; lazer ışınlama penceresi açık mavi gösterilir ve lazer ışını mor yıldırım ile temsil edilir. Rakamlar ölçeklendirilmeyecek. Bu rakam Espino ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig2.jpg"> Şekil 2. IV-FPOP sırasında mikroakışkan sistem. (A) 5 mL şırınga içinde C. elegans temsili resim. Karıştırmadan, solucanlar şırınganın altına yerleşirler (solda). Manyetik karıştırıcılar ve karıştırıcı bloğu IV-FPOP deneyleri sırasında solucanları süspansiyonda tutar (sağda). (B) 5 mL şırınganın, kılcal damar alamının ve 3-2 valile bağlı kılcal damarların çekilmesinin temsili resmi. 3-2 valf kolu geri çekme pozisyonunda gösterilir. (C) IV-FPOP sırasında mikroakışkan akış sistemi, manyetik karıştırıcı bloğu solucanların 5 mL şırınga üzerinde konumdur. (D) Çıkış kılcal damarı yayılan evreye sabitlenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig3.jpg"> Şekil 3. C. elegans akışı ve kurtarma iki i.d. kılcal damarlar kullanılarak karşılaştırılması. (A) 250 (gri) ve 150 (siyah) μm i.d. kılcal damarlı iki biyolojik çoğaltma (BR) için IV-FPOP sonrası solucanların yüzde geri kazanımı. Hata çubukları, teknik triplicates arasında standart sapma hesaplanır. C. elganlar lazer ışınlama penceresinden 250 μm(B) ve 150 μm(C)yani kılcal damarlardan akar. Solucanlar daha sıkı küçük kılcal sıkıştırılmış. 150 μm i.d. kılcal damar solucanların kümelenme gösterir. Bu rakam Espino ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig4.jpg"> Şekil 4. IV-FPOP sonrası Temsilci LC-MS/MS sonuçları. (A) Bir FPOP modifiye peptid (kırmızı) ve değiştirilmemiş (mavi) EIC. Seçilen peptid aktin-1 proteinine aittir. (B) MS/MS spektrumu iki katı olarak yüklenmemiş aktin-1 peptid 317-327. (C) MS/MS spektrumu iki katı olarak yüklü FPOP modifiye aktin-1 peptid 317-327, bu örnekte P323 oksidatif olarak modifiye edildi (y5+ iyon, kırmızı). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig5.jpg"> Şekil 5. IV-FPOP oksidatif C. elegans içindeki proteinleri değiştirir. (A) Oksidatif modifiye proteinlerin Venn diyagramı oksidatif modifiye proteinlerin iki biyolojik çoğaltma (BR) arasında 50 Hz 200 mM hidrojen peroksit varlığında, BR1 mavi ve BR2 sarı. (B) Işınlanmış numunelerde tanımlanan oksidatif modifiye proteinlerin Venn diyagramı, teknik trilikatlar arasında BR2'de hidrojen peroksit kontrolü ve yalnızca solucan kontrolü. (C) Farklı C. elegans vücut sistemleri içinde oksidatif modifiye proteinlerin Pasta grafik. Bu rakam Espino ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig6.jpg"> Şekil 6. Çözücü erişilebilirliği için IV-FPOP modifikasyonları korelasyon. (A)Myosin şaperon proteini UNC-45 (gri) (PDB ID 4I2Z13) LC/MS/MS analizi, 669−680 ve 698−706 (yeşil, sol inset) tarafından tanımlanan iki modifiye peptidi vurgular. UNC-45 Hsp90 peptit parçası (mavi) bağlıdır. Bu parçanın içindeki oksidatif modifiye kalıntılar çubuklarla (kırmızı) ve UNC-45 bir yüzey (sağ inset) olarak işlenir. (B) UNC-45 peptid 669−680 (üst) ve 698−706 (alt) co2kaybı için b ve y-iyonları gösteren Tandem MS spektrumları , bir FPOP modifikasyonu. (C) Hsp90 oksidatif modifiye kalıntılar, R697, M698, E699 ve E700 için hesaplanan ln(PF). Hsp90 için hesaplanan SASA değerleri her kalıntının üzerinde gösterilir. (D) R697, M698, E699 ve E700 için +16 FPOP modifikasyonu gösteren Tandem MS spektrumları. Bu rakam Espino ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Proteinlerin in vivo hızlı fotokimyasal oksidasyonu (IV-FPOP) kendi doğal ortamında protein yapısının haritalanması için izin veren bir hidroksil radikal protein ayak izi tekniğidir. Bu protokol, IV-FPOP mikroakışkan akış sisteminin montajını ve kurulumünü açıklar.

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

In vivo FPOP protein-protein etkileşimleri ve Protein yapısı C-elegans değişiklikler. Bu hayvanlar yaygın insan hastalığı çalışma için bir model sistem olarak kullanılır. In vivo FPOP'u kütle spektrometresi ile birbiriyle kaplayarak, canlı bir hayvandaki farklı hücresel ve vücut bölmelerindeki protein-protein etkileşimlerini belirli bir proteini izole etmeye gerek kalmadan inceleyebiliriz.Florlu etilen propilen veya FPP boru iki santimetre lik bir parça keserek akış sistemi montaj Başlayın. Borunun bir ucundaki iç çapı genişletmek için temiz bir kesme iğnesi kullanın ve yaklaşık 15 milimetre uzunluğunda küçük bir krater oluşturarak. Akış sisteminin infüzyon hatlarını oluşturmak için, 250 mikrometre iç çaplı 15 santimetrelik parçalara bölünürse, silika seramik kesici ile kaynaştırılmış.Ve iki kılcal damarı kendinden yapışkanlı bantla birlikte bantlayın, uçlarının %100 kızardığından emin olun. FPP boru krater içine iki kılcal yerleştirin, çok kenarına kadar iterek. Temiz bir yüzeye epoksi reçine küçük bir nokta yerleştirin ve diseksiyon iğne ile karıştırın.Rekarinin küçük bir damlasını hızlı bir şekilde yerleştirmek için aynı iğneyi kullanın, infüzyon kılcal damarların sonunda, FPP tüpüile bağlantı kuracakları yerde, resenin çıkış tarafını birkaç dakika boyunca kurutmasını bekleyin. Bu arada, akış sisteminin çıkış kılcal olacak yeni bir 250 mikrometre iç çaplı kılcal kesti. Rezorin kuruduktan sonra, yeni kılcal damarı FPP boru çıkışının ucuna takın.Çıkış kılcal ve iki infusing kılcal damarların iç uçları birbirine karşı floş olmalıdır, karıştırma çay oluşturma. Daha önce açıklandığı gibi taze epoksi reçine ile kılcal ve FPP tüp bağlanın ve akış sistemi gecede kurumasını bekleyin. Proteinlerin in vivo hızlı fotokimyasal oksidasyonu sırasında bu şırınga yerleşme solucanlar engelleyecek bir beş mililitreşşli şırınga içinde, dört manyetik karıştırıcılar takın veya in vivo FPOP.Bu ve M9 ile ek bir beş mililitreşşüş doldurun, kabarcıklar oluşturmaktan kaçınmak için emin olun. Her şırıngaya daha düşük bir adaptör bağlayın ve parmaklarının sıkı olduğundan ve yerinde sabitlediğinden emin olun. Daha sonra, tek bir üç-iki vana orta bağlantı noktasına her şırınga takın.Her şırıngayı çift şırınga pompasına sabitleyin ve itici bloğunaşırı basıncı önlemek için mekanik rengi ayarlayın. Her üç-iki vana üst portu için daha önce yapılmış mikroakışkan sistemin her infusing kapiller ucunu eklemek için FEP kol ve süper flanş listesi değişkendeğil süper flanş listesi kullanın. Son olarak, valf alt portuna 10 santimetre 450 mikrometrelik iç çap kılcal damar takın, bu da geri çekilen numune kapilleri olarak hizmet verecek.Pompa akışını başlatın ve sızıntılar için tüm bağlantıları görsel olarak inceleyin. Deneysel akış hızını kullanarak en az üç şırınga hacmi akışı. Akış yolu üç-iki valf sapı üzerindeki oklarla işaretlenir ve her şırınga, valf kolunun sınır dışı edilmesinden geri çekilme pozisyonuna taşınmasıyla el ile doldurulabilir.Mikroakışkan akış sistemini inceledikten sonra, onu deneysel tezgaha taşıyın ve çıkış kılcal damarını paslanmaz çelik birleşimle yayılan aşamaya sabitleyin. Lazer ışınlama penceresinde erimiş silika nın kaplamasını yakmak ve yanmış kaplamayı tiftik dokusu ve metanolile temizlemek için uzun ömürlü bir çakmak kullanın. Manyetik karıştırıcı bloğunu şırınganın üzerine manyetik karıştırarak yerleştirin ve hızı ayarlayın, böylece karıştırmalar yavaş ve sürekli döner.Kripton florür excimer lazeraçın ve tiroid tron ısınmak için izin. Lazer enerjisini en az 100 darbe için 50 hertz frekansta, optik sensörü ışın çıkış penceresine yerleştirerek ölçün. 500 mikrolitrelik bir hacimdeki yaklaşık 10.000 solucanı numune şırıngayına elle çekin.Daha sonra hava kabarcıkları önlemek için emin olun, M9 tampon 2,5 mililitre ile doldurun. En az 10.000 solucan büyüklüğünde bir örnek boyutuna sahip olmak önemlidir. Daha küçük bir örneklem büyüklüğü aşağı proteomik analiz için düşük protein verimi neden olacaktır.İkinci şırıngayı 200 milimolar hidrojen peroksitin üç mililitresi ile doldurun. Çıkış kapiller sonunda, 40 milimolar DMTU altı mililitre ile 15 mililitrekonik tüp yerleştirin, 40 milimolar PBN, ve 1% zaman elma püresi oksit. Excimer lazerini yazılım penceresinden başlatın, ilk darbeyi bekleyin ve çift şırıngadan numune akışını başlatın.Numunenin tamamını 15 mililitrelik tüpte toplayın ve herhangi bir görsel sızıntı için numune akışını aktif olarak izleyin. Vivo FPOP'tan sonra solucanları 805 kez g'de iki dakika santrifüj ile peletleyin. Söndürme çözeltisini aspire edin ve 250 mikrolitre lisanslı tampon ekleyin.Numuneyi temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, flaşı dondurun ve numune sindirimi kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. iki farklı iç çapa sahip kılcal damarlar kullanılarak in vivo FPOP sonrası solucan geri kazanımı karşılaştırıldı. 250 mikrometre lik iç çaplı kılcal damar kullanıldığında, iki biyolojik kopyada toplam %63 ile %89 arasında bir numune geri kazanımı sağlanmıştır.150 mikrometrelik iç çaplı kılcal damar kullanımı sadece %21-31 oranında iyileşme ile sonuçlandı. Daha büyük bir iç çaplı kılcal kullanımı, in vivo FPOP sırasında daha iyi solucan akışına yol açar, küçük kılcal tek solucan akışı için izin vermez, ve birden fazla solucan lazer yayılan pencerede birlikte akan görülür, hangi solucan başına lazer maruz kalma miktarını azaltır. Bir FPOP modifiye ve değiştirilmemiş peptid in iyon kromatogramları ayıklanmış hidroksil radikal oksidatif modifiye peptidlerin kimyasını değiştirerek onları daha kutupsal hale gösterdi.Ters faz kromatografisinde in vivo FPOP modifiye peptidler, değiştirilmemiş peptidlere göre daha erken retansiyon sürelerine sahiptir. İzole peptidlerin MS parçalanması, oksidatif modifiye kalıntıların belirlenmesiiçin izin verir. In vivo FPOP, C-elegans içinde iki biyolojik kopya arasında toplam 545 proteini oksidatif olarak modifiye etmiştir.Bu protein ayak izi yönteminin bir avantajı, solucanlar içinde vücut sistemlerinin çeşitli proteinleri değiştirmek için yeteneğidir. Tandem MS analizi in vivo FPOP probu solvent erişilebilirliğini in vivo doğrular. Miyozin şaperon proteini UNC 45 ile kompleks olan 90 ısı şok proteininin oksidasyon paterni analiz edildi ve oksidatif olarak modifiye edilmiş dört kalıntı bulundu.In vivo FPOP için C-elegans kullanımı, hastalık patogenezinde protein-protein etkileşimleri ve protein yapısının rolünü inceleme potansiyeli sunar.

in-vivo-hydroxyl-radical-protein-footprinting-for-study-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod...

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Burada, varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve yorumların kolaylaştırmak amacıyla bir protokol RNA, DNA ve protein aynı örnekten izolasyonu için mevcut.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Burada, canlı hücrelerdeki protein yapısını ve etkileşim alanlarını, proteinlerin hücre içi hızlı fotokimyasal oksidasyonu (IC-FPOP) olarak adlandırılan bir protein ayak izi tekniği ile karakterize ediyoruz.

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

Bu yöntem, Caenorhabditis elegans örneklerinden ve daha sonra eş-immünoselipitasyondan yüksek verimli protein özü hazırlanması için bir protokol açıklar.

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonu proteinlerin yapısal karakterizasyonu için ortaya çıkan bir tekniktir. Farklı solvent katkı maddeleri ve ligandlar çeşitli hidroksil radikal atma özelliklerine sahiptir. Farklı koşullarda protein yapısını karşılaştırmak için reaksiyonda oluşan hidroksil radikallerinin gerçek zamanlı telafisi reaksiyon koşullarını normalleştirmek için gereklidir.

Protein Topografya Değişikliklerinin Belirlenmesinde Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonlarında Gerçek Zamanlı Telafinin Sağlanması

Bu protokol, sıralı radikal dozimetri ve flaş oksidasyon proteini ayak izi gerçekleştirmek için bir plazma ışık kaynağı kullanmak için bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein çalışmalarının hızlı fotokimyasal oksidasyonunun tekrarlanabilirliğini basitleştirmek ve iyileştirmek için tehlikeli UV lazerin yerini alır.

Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Protokol, ilgilenilen bir proteine kaynaşmış bir biyotin ligaza yakınlıklarına dayalı olarak biyotinin proteinlere in vivo kovalent bağlanması için bir yöntem sunar. Bu modifikasyon, protein etkileşim çalışmalarında gerektiği gibi streptavidin boncukları kullanılarak proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir.

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Burada, geniş alan mikroskobu görüntülerinde tek tek solucanların otomatik segmentasyonu için geliştirdiğimiz bir derin öğrenme sistemi olan SegElegans'ın daha sonra ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında kullanılmak üzere etkin bir şekilde kullanılmasına ilişkin talimatlar sunuyoruz. Sistemi hem çevrimiçi hem de çevrimdışı kullanmanın yollarını sunuyoruz.

SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

Keşfedin in vivo hızlı fotokimyasal protein oksidasyonu (IV-FPOP) tekniğini, Caenorhabditis elegans model organizmasında protein etkileşimlerini ve yapı değişikliklerini incelemek için. Bu yöntem, kütle spektrometrisi ile birleştirilerek canlı organizmalarda protein dinamiklerini gerçek zamanlı analiz etme olanağı sunar.

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Daha fazla video keşfet