Name: Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Öğrenin oligodendrosit saflaştırma ve ko-kültür yöntemlerini; sallama tekniği ile yüksek verimli hücre elde ederek miyelinasyon mekanizmalarını ve nöron etkileşimlerini araştırın. Bu yöntem, oligodendrosit-koşullu ortam üretimi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Rémi Ronzano'ya el yazması düzenlemedeki bilge tavsiyeleri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma ICM, INSERM, NSF'ye ARSEP vakfı hibesi ve Bouvet-Labruyère fiyatı ile finanse edilmiştir.

Bu deneyde farelerin bakımı ve kullanımı kurumsal politika ve yönergelere (UPMC, INSERM ve Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi 86/609/EEC) uygundur. Standart 12 yavru için aşağıdaki protokol oluşturulmuştur.
1. Şişelerin hazırlanması (~5 dk)
NOT: Steril koşullarda laminar akış kaputunda diseksiyondan bir gün önce aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Coat 150 cm2 şişe (T150) filtre kapağı ile (2 yavru için 1 şişe) polietilenin 5 mL kullanarak (PEI, 100 mg / L, Ek Dosya 1protokolüne bakın).</li>
	<li>Şişeleri gece boyunca 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Diseksiyon gününde steril distile su ile 3 kez durulayın kaplı şişeler.</li>
</ol>2. Ortamın hazırlanması (~10 dk)
NOT: Adımları steril koşullarda laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
<ol><li>Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamından (DMEM) oluşan ve fetal baldır serumunun (FCS) %10'u ve penisilin-streptomisinin (100 IU/mL) %10'u ile desteklenen 500 mL kültür ortamı hazırlayın.</li>
	<li>20 mL DMEM, 200 μL DNase (50 g/mL), 200 μL papain (30 U/mL) ve 200 μL L-sistein (0,24 mg/mL) içeren 50 mL'lik bir tüpte enzim sindirim ortamının 20,6 mL'sini hazırlayın.</li>
	<li>0,22 μm'lik bir filtre kullanarak ortamı filtreleyin.</li>
	<li>Medyayı, diseksiyona kadar ortam sıcaklığında (RT) laminar akış kaputunda tutun.</li>
</ol>3. Diseksiyon için hazırlık (~10 dk)
NOT: Adımları steril koşullarda laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
<ol><li>Kalsiyum ve magnezyum olmadan 100 mL fosfat tamponlu salin hazırlayın (PBS; 1x). 0,22 μm filtre kullanarak filtre sterilize edin.</li>
	<li>50 mL buz gibi 1x PBS çözeltisi ve %45 glikoz 750 μL hazırlayın. 0,22 μm filtre kullanarak filtre sterilize edin.</li>
	<li>100 mm'lik Petri kabını temizleme aletleri için 1x PBS ve doku hasadı için buz gibi PBS-glikoz içeren üç 60 mm Petri kabını doldurun. Petri tabaklarını diseksiyona kadar buza koyun.</li>
</ol>4. Diseksiyon
NOT: Diseksiyon doğum sonrası (P) 2'de erkek ve dişi Wistar sıçan yavrularından yapılır.
<ol><li>Steril bir ortam sağlamak için, % 100 etanol ile tezgah temizlemek için emin olun. Tüm cerrahi aletleri %100 etanol ile sterilize edin.</li>
	<li>Yavaşça% 70 etanol ile yavrunun boyun sprey.</li>
	<li>Hayvanın kafasını kesmek ve başı buz gibi PBS-glikoz içeren 100 mm'lik Petri kabına yerleştirmek için büyük cerrahi makas kullanın.</li>
	<li>Göz seviyesinde hayvanın başını korumak için kavisli forceps kullanın. Kafatasının tabanında küçük bir kesi yapmak ve beyin orta hattı aşağıdaki kafatası kesmek için küçük cerrahi makas kullanın.</li>
	<li>Kafatasının iki parçasını orta hattan yavaşça soymak için forceps kullanın.</li>
	<li>Baş boşluğundan beyin kaldırmak için küçük bir cerrahi kaşık kullanın. Beyni buz üzerinde buz gibi PBS-glikoz içeren 60 mm'lik petri kabına koyun.</li>
	<li>Bir steromicroscope altında görüntüleme, beyincik kaldırmak için ince çifenler kullanın, beyin sapı ve koku ampulleri serebral hemisfer.</li>
	<li>İki serebral hemisferi ayırmak için ince pratisyen ler kullanın. Menenjitleri soymak için ince forceps kullanın. Serebral kortikülleri buzüzerinde 60 mm'lik bir kabın içine koyun. NOT: Buz gibi PBS doğru menenjlerin çıkarılması için çok önemlidir.</li>
</ol>5. Doku dissociasyonu
NOT: Adımları steril koşullarda laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
<ol><li>Ince serebral korteksleri doğramak için keskin bir neşter kullanın. Kıymalı dokuyu enzim sindirim ortamı içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>37 °C'de %5 CO2'ninaltında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçka .</li>
	<li>Kortikal dokunun 50 mL tüpün altında kalmasını sağlarken enzim sindirim ortamını nazikçe çıkarmak için p1000 mikropipet kullanın.</li>
	<li>1 mL DMEM-10% FCS eklemek ve dokuyu hafifçe triturate etmek için p1000 mikropipet kullanın.</li>
	<li>Kortikal dokuyu 50 mL'lik bir tüpe filtrelemek için 70 m filtre ve 1 mL şırınganın pistonu kullanın. NOT: DMEM-10% FCS ile iç tüp duvarında birkaç kez artık doku durulayabilir.</li>
	<li>50 mL'lik tüpü DMEM-%10 FCS ile doldurun. SENTRIFUGE 423 x g 5 dk RT. Dikkatle supernatant kaldırmak ve DMEM-10% FCS 2 mL ile hücre pelet resuspend.</li>
	<li>P1000 mikropipet li ve p200 mikropipetli hücre peletini hafifçe triturate. DMEM-10%FCS uygun hacmi ile hücre süspansiyon seyreltmek. NOT: İki beyin = bir T150 = 5 mL DMEM-10%FCS.</li>
	<li>T150'de 1 x 105 hücre/cm2yoğunlukta hücre süspansiyonunun 5 mL plakası. Her T150'ye 20 mL sıcak DMEM-%10 FCS ekleyin. 37 °C'de %5 CO2'ninaltında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Sıcak DMEM-10% FCS ile 6 gün in vitro (DIV) sonra kültür ortamının yarısını yenileyin.</li>
</ol>6. Sallayarak hazırlık
<ol><li>Steril koşullar altında bir laminar akış kaputsal sallayarak önce gün sallayarak hazırlık gerçekleştirin.</li>
	<li>Şişeye taze sıcak kültür ortamı ekleyerek kültür ortamının yarısını yenileyin ve %5 CO2'ninaltında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>7. Sallayarak
<ol><li>Pei ile coat üç 100 mm Petri yemekleri. Bir gecede 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Parafin film ile şişe kapağı kapağı ve plastik bir torbaya şişeleri koymak. 37 °C'de 250 rpm'de glial hücreleri içeren şişeleri bir gecede çalkalayın. NOT: İlk sallayarak 8 DIV yapılır ve bir üç farklı sallayarak kadar gerçekleştirebilirsiniz (zamanlama için Şekil 1'e bakın).</li>
</ol>8. OL soy hücreleri hasat ve kültür
NOT: Bu adımlar steril koşullar altında laminar akış kaputunda yapılmalıdır.
<ol><li>Sallayarak sonra gün, Tablo 1göre Bottenstein-Sato (BS) orta hazırlamak.</li>
	<li>Steril distile su ile 3 kez durulayın Petri yemekleri.</li>
	<li>Hasat şişeleri 'supernatant ağırlıklı OL soy hücreleri içeren değil, aynı zamanda bazı mikroglial hücreler ve kaplamasız 100 mm Petri yemekleri üzerine plaka. NOT: Bu adım, mikroglial hücrelerin çanak yüzeyindediral hızlı yapışma yoluyla uzaklaştırılmasına olanak sağlar.</li>
	<li>Petri yemeklerini %5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Her T150 şişesini 25 mL sıcak taze hazırlanmış kültür ortamı ile doldurun ve 37 °C'de %5 CO2'nin altında nemli bir kuluçka makinesinde ikinci titrene kadar kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Petri kaplarından süpernatantı, artık mikroglial hücrelerin yapışmasını sağlamak için kaplamasız yeni 100 mm Petri kaplarına aktarın.</li>
	<li>Petri yemeklerini %5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Yapışmaz OL soy hücreleri içeren supernatant'ı çıkarın ve 50 mL tüplere aktarın (50 mL tüp için 2 Petri kabından süpernatant). Mikroglia ile kaplanmış Petri tabaklarını atın.</li>
	<li>423 x g5 dk için supernatant santrifüj . 1 mL BS orta ile supernatant ve resuspend hücre peletini dikkatlice çıkarın. Tüm peletleri ortak bir 50 mL tüpte birleştirin ve bs orta ile sesi 10 mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>Hücre yoğunluğu nu mikroskop altında sayma hücrelerini belirleyin. NOT: 3 x 105/mL ile 5 x 105/mL arasında bir hücre yoğunluğu elde edilmelidir.</li>
	<li>Hücre yoğunluğu 30 mL'den daha yüksek veya 4 x10 5/mL'den yüksekse 20 mL BS ekleyin veya hücre yoğunluğu 4 x 10 5/mL'den azsa sadece 10 mL BS ekleyin ve 20 mL'lik son bir hacim elde edin.</li>
	<li>10 mL hücre süspansiyonlu iki veya üç önceden kaplanmış 100 mm Petri kabını kaplayın. 37 °C'de %5 CO2'ninaltında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüm BS orta 2 saat sonra ferahlatıcı tarafından Petri yemekleri enkaz temizleyin. NOT: Hücre yoğunluğunu ve enkaz kaldırma etkinliğini doğrulamak için temizlemeden önce ve sonra mikroskop altında kültürü inceleyin.</li>
	<li>%5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 2 gün BS ortamda kuluçkaya yatırın. NOT: Kültürü mikroskop altında inceleyin. Kesişme %70 ila %80 arasında olmalıdır.</li>
</ol>9. OCM üretimi
NOT: Bu adımları steril koşullar altında laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
<ol><li>Tablo 2'yegöre NB-B27low ortamını hazırlayın.</li>
	<li>10 mL sıcak NB-B27low ortam ile kültür ortamını yenileyin. %5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 2 gün kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hasat OCM, yani, SUPERnatant OL salgılanan faktörler içeren. 0,22 μm filtre kullanarak OCM'yi filtreleyin. NOT: OCM'yi 4 °C'de en fazla 2 ay saklayın.</li>
</ol>10. OCM ilavesi
NOT: Adımlar steril koşullar altında laminar akış kaputunda yapılmalıdır. OCM aşağıdaki protokol14uyarınca hazırlanan saflaştırılmış hipokampal nöron kültürleri eklenebilir , ve ekleyerek elde, 24 saat izolasyon sonra, anti-mitotik ajanlar uridine ve 5- fluorodeoxyuridine (5 μM) için 36 h.
<ol><li>3 DIV'de, anti-mitotik ajanlar içeren tüm nöron kültür ortamını çıkarın ve 500 μL taze sıcak OCM ekleyin.</li>
	<li>Taze yapılmış sıcak NB-B27 ile her 3 günde bir orta ortamın yarısını yenileyin. NOT: Bu tür kültürler 21 DIV'ye kadar korunabilir.</li>
</ol>11. Saflaştırılmış hipokampal nöron kültürüne OL eklenmesi
NOT: Steril koşullarda laminar akış kaputunda aşağıdaki adımları gerçekleştirin. OL'ler yukarıda açıklandığı gibi elde edilen saflaştırılmış hipokampal kültürlere eklenebilir.
<ol><li>Tablo 3'egöre ortak kültür ortamı hazırlayın.</li>
	<li>OL kültürünü %70 ile %80 oranında bir araya getirmekle alın. 2 mL ılık 1x PBS ile durula.</li>
	<li>Hücreleri ayırmak için, 100 mm Petri kabına %0,25 tripsin 2 mL ekleyin.</li>
	<li>%5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 5 dakika kuluçka .</li>
	<li>Enzimatik reaksiyonu engellemek için 2 mL DMEM-10% FCS ekleyin. OL soy hücrelerini içeren süpernatanthas hasat.</li>
	<li>Sentrifüj 423 x g 5 dk RT. Dikkatle supernatant kaldırmak ve 1.25 x 105 hücre/mL konsantrasyonu elde etmek için sıcak co-kültür orta hücre pelet resuspend.</li>
	<li>200 μL nöron kültür ortamını çıkararak ve 24 kuyulu bir plakanın her kuyubaşına 200 μL hücre süspansiyonu (2.5 x 104 hücre/kuyu) ekleyerek saflaştırılmış hipokampal nöron kültürüne OL ekleyin.</li>
	<li>Her 2-3 günde bir ortak kültür ortamının yarısını yenileyin. NOT: Ortak kültürler 24 DIV'ye kadar korunabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+myelin%3A+a+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Novartis+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li>
<li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li>
<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li>
<li>Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li>
<li>Frühbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604(2013).</li>
<li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993(2014).</li>
<li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222(2015).</li>
<li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+in+the+Central+Nervous+System%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li>
<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li>
<li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte%2C+Astrocyte%2C+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development%2C+Damage%2C+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).</li>
<li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li>
<li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+steps+of+oligodendrogenesis%3A+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li>
<li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li>
<li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573(2019).</li>
<li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li>
<li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression%3A+in+vitro+models+of+proliferation%2C+differentiation+and+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li>
<li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li>
<li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin rakip çıkarları veya çelişen çıkarları yoktur.

Burada, daha önce yayınlanmış bir yöntem 16 uyarlanmış karışık glial kültürlerden son derece zenginleştirilmiş oligodendroglial soy hücre kültürleri elde etmek için ayrıntılı bir protokol sağlamak16, ve OL-klimalı orta sonraki üretim. Bu sallayarak tekniği pahalı değildir, üç kez tekrarlanabilir ve saflaştırılmış OL'lerin yüksek miktarda elde etmek için en uygun, Bottenstein-Sato kültürlü hücreler olarak (BS) ortamda PDGFα çoğalır. Glial hücreler P2 Wistar sıçanların serebral kortiküller kullanıla...

Oligodendrocytes (OL) merkezi sinir sisteminin glial hücreleridir (CNS) aksonlar etrafında miyelin sarma oluşturmak. OL'ler, embriyonik CNS'nin ventriküler bölgeleri içinde çoğalan ve daha sonra tamamen olgun OL'lere (yani miyelin oluşturanhücrelere)göç eden ve farklılaşan oligodendrocyte öncül hücrelerinden (OPCs) kaynaklanır. OPCs erken gelişim sırasında bol, ama aynı zamanda büyük proliferatif hücre popülasyonu temsil yetişkin beyinde devam2. Tek bir OL, çıkarılabilir olmayan bölümlerde birden fazla aksonları (yani, internodes) ensheathes ve her miyelin döngü kenarı miyelin yalıtım özellikleri için çok önemli olan paranodal etki alanı oluşturan akson bağlanır1,3. Paranodlar arasında Ranvier düğümleri denilen küçük myelinated boşluklar vardır. Bu düğümler voltaj kapılı sodyum kanalları (Nav) açısından zengindir ve tuzatory iletkenlik4ile etki potansiyellerinin yenilenmesine ve hızlı yayılmasına olanak sağlar. Bu sıkı etkileşim aynı zamanda OLs 5 laktat nöronal alımıyoluyla aksonal enerji desteği sağlar5 ,6.
Oligodendroglial soy hücrelerinin olgunlaşması ve miyelinasyon süreci sıkı nöronlar ile etkileşimleri tarafından düzenlenir7. Nitekim, OLs ve OPCs, ayrıca NG2 hücreleri olarak adlandırılan, nörotransmitterler için reseptörlerin bir dizi ifade, ve uyarıcı ve inhibitör nöronlar giriş alabilirsiniz, onları miyelinating hücrelere onların çoğalma ve / veya farklılaşma tetikleyebilir nöronal aktivite algılamak için izin2. Buna karşılık, OPCs / OLs tek başına veya sinerjik nöromodülatif ve nöroprotektif fonksiyonlar8,9,10,11,12aracılık ekstrasellüler uzaya mikroveziküller ve proteinler salgılar . Ancak, oligodendroglial soy hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerin birden fazla modları kontrol moleküler mekanizmalar henüz tam olarak deşifre olmak.
Ayrıca, çeşitli CNS patolojik koşullarda, OLs öncelikle etkilenir, böylece nöronlar ile etkileşimi rahatsız. Örneğin, Multipl Skleroz (MS), nörolojik disfonksiyon CNS fokal demiyelinasyon neden olur, aksonal hasar ve buna bağlı sakatlık birikimine yol açabilir OLs kaybı ikincil. Remiyelinasyon, çoğu durumda yetersiz olsa da13gerçekleşebilir. Son on yılda kaydedilen ilerleme, immünoterapilerin gelişmesi nedeniyle nüks etme oranını azaltmış, ancak remiyelinasyonu teşvik etmek bugüne kadar karşılanmamış bir ihtiyaç olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, OL'lerin rolünün, işlevlerinin ve etkilerinin daha iyi anlaşılması, cns koşullarının geniş bir yelpazesi için yeni tedavilerin geliştirilmesiaçısından özellikle ilgi çekicidir.
Burada, OSB'lerin arınma ve kültür yöntemlerini açıklıyoruz. Bu, gelişimlerini ve biyolojilerini düzenleyen içsel mekanizmaların hassas bir şekilde incelenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu tür son derece zenginleştirilmiş OL kültürleri oligodendrocyte klimalı orta üretimine izin (OCM), hangi saflaştırılmış nöron kültürleri eklenebilir nöronal fizyoloji ve bağlantı üzerinde OLS gizli faktörlerin etkisi hakkında fikir edinmek için. Ayrıca, saflaştırılmış oligodendrositler ve nöronların bir araya gelerek miyelinasyonu düzenleyen mekanizmaların ele alınmasına olanak tanıyan bir in vitro co-kültür sisteminin nasıl uygulanacağını anlatıyoruz.

<table><tbody><tr><td>5-florodeoksiüridin</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNaz (Deoksiribonükleaz I)</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %100 </td><td>Sigma</td><td>32221-M</td><td></td></tr><tr><td>Etanol% 70</td> <td>VWR Kimyasalları</td><td>83801.360</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Fosfat Tamponlu Salin</td><td>ThermoFisher</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin (PEI)</td> <td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborat dekahidrat</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>Sigma Üridin</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Bottenstein-Sato (BS) ortamı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin insan</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Sığır Serum Albümini)</td> <td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-13A</td> Penisilin-Streptomisin <td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putresin dihidroklorür</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum selenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3 ', 5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu)</td> <td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>T4 ( L-Tiroksin)</td> <td>Sigma</td><td>T1775</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > ko-kültür ortamı< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin insan</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Sığır Serum Albümini)</td> <td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Seruloplazmin</td><td>Sigma</td><td>239799</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>N-Asetil-L-sistein</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescin</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan CNTF</td><td>Sigma</td><td>450-13</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum selenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3 ',5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu)</td> <td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>B12</td><td>Vitamini Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Araçlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m filtre</td><td>Sartorius</td><td>514-7010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>Terumo</td><td>1611127</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri kabı</td><td>Dutscher</td><td>193100</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüp</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1867</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1869</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri kabı</td><td>Dutscher</td><td>067003</td><td></td></tr><tr><td>70 & mikro; m filtresi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Binoküler mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Büyük cerrahi makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Swann-morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük cerrahi makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Küçük cerrahi kaşık</td><td>Bar Naor Ltd</td><td>BN2706</td><td></td></tr><tr><td>T150 cm2 filtre kapaklı şişe</td><td>Dutscher</td><td>190151</td><td></td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Wistar sıçan</td><td>Janvier</td><td>RjHAn:WI</td><td></td></tr></tbody></table>

oligodendrocytes ve oligodendrocyte-ko-kültür deneyleri için Şartlı orta Üretimi

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Merkezi sinir sisteminde, oligodendrocytes iyi akson miyelinasyon rolleriyle bilinir, bu tuzlu iletim yoluyla eylem potansiyellerinin yayılmasını hızlandırır. Ayrıca, raporların giderek artan sayıda oligodendrocytes myelination ötesinde nöronlar ile etkileşim öneririz, özellikle çözünür faktörlerin salgılayan yoluyla. Burada, glial hücre kültürlerinden de astrositler ve mikroglial hücreler içeren oligodendroglial soy hücrelerinin saflaştırılmasına izin veren ayrıntılı bir protokol saklıyız. Yöntem, 37 °C'de gece boyunca sallamaya dayanır, bu da üstteki oligodendrogial hücrelerin ve mikroglial hücrelerin seçici ayrılmasına ve mikroglianın diferansiyel adezyon la ortadan kaldırılmasını sağlar. Daha sonra oligodendrocytes kültürünü ve oligodendrocyte-conditioned orta (OCM) üretimi açıklar. Biz de co-kültür deneylerde saflaştırılmış hipokampal nöronlar için OCM tedavi veya oligodendrocytes ek kinetik sağlamak, oligodendrocyte-nöron etkileşimleri çalışma.

Bu protokolde, OL soy hücreleri göksitler ve mikroglia kapalı sallayarak glial kültürlerden saflaştırılır. OL kültürlerinin saflık ve fenotipik muayenesi glial belirteçleri ile immünboyama ile değerlendirilebilir15</stro...

Burada, oligodendrositlerin saflaştırılması ve ortak kültür deneyleri için kullanılabilecek oligodendrosit şartlı ortamın üretimi için etkili bir yöntem gösteriyoruz.

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Biz oligodendroglial soy hücrelerinin arınma ve kültür etkili bir yöntem açıklar. Bu miyelinasyon sürecinde oligodendrocytes farklılaşma ve nöronlar ile etkileşimlerini kontrol moleküler mekanizmaları ele sağlar. Bu sallayarak tekniği pahalı değildir ve oligodendrocytes yüksek miktarda elde etmek için en uygun.Bu tür kültürler nöronlar ile oligodendrocytes oligodendrocytes orta ve co-kültürlerin üretimine izin verir. Multipl skleroz merkezi sinir sisteminde fokal de-miyelinasyon neden olduğu bir hastalıktır, oligodendrocytes kaybı sekonder. Oligodendrocytes kültürü nasıl yeniden miyelinasyon teşvik etmek için daha iyi anlamak için bir araç sağlar.Sadece oligodendroglial hücre kültürü gelişmeleri ve oligodendrocytes biyoloji düzenleyen içsel mekanizmalar içine anlayışlar sağlayabilir. Nöronlar ile co-kültürler nöronal fizyoloji üzerindeki etkileri hakkında fikir edinmek için izin verir. Başlamak için, göz seviyesinde hayvanın başını korumak için kavisli forceps kullanın.Kafatasının tabanında küçük bir kesi yapmak ve beyin orta hattı aşağıdaki kafatası kesmek için küçük cerrahi makas kullanın. Kafatasının iki parçasını orta hattan yavaşça soymak için forceps kullanın. Baş boşluğundan beyin kaldırmak için küçük bir cerrahi kaşık kullanın.Beyni 60 milimetrelik petri kabına koyun. Bir stereo mikroskop altında görüntüleme, beyincik kaldırmak için ince çerçiler kullanın, beyin sapı, ve serebral hemisfer koku ampulleri. İki serebral hemisferi ayırmak için ince pratisyen ler kullanın.Menenjitleri soymak için ince forceps kullanın. Serebral kortikülleri 60 milimetrelik petri kabına koy. Bir laminar akış kaputunda, ince serebral korteksleri doğramak için keskin bir neşter kullanın.Kıymalı dokuyu enzim sindirim ortamı içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kortikal doku tüpün alt kısmında kalır emin yaparken yavaşça enzim sindirim ortamı kaldırmak için bir pipet kullanın.Bir mililitre DMEM %10 fetal buzağı serumu eklemek ve dokuyu hafifçe triturate etmek için P1000 mikropipet kullanın. Kortikal dokuyu 50 mililitrelik bir tüpe filtrelemek için 70 mikronluk bir filtre ve bir mililitrelik şırınganın pistonu kullanın. 50 mililitrelik tüpün iç tüp duvarındaki artık dokuyu DMEM %10 fetal baldır serumu ile birkaç kez durulayın.50 mililitrelik tüpü DMEM %10 fetal baldır serumu ile doldurun. Oda sıcaklığında beş dakika 423 kez g santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve DMEM iki mililitre ile hücre pelet resuspend 10% fetal buzağı serum.Hücre peletini P1000 mikropipeti ile ve ardından P200 mikropipetiyle hafifçe triturate. DMEM uygun hacmi ile hücre süspansiyon seyreltmek 10%fetal baldır serum. Bir T-150 şişesiüzerinde, santimetre kare başına beşinci hücrelere bir kat 10 yoğunlukta hücre süspansiyonunun beş mililitresini kesin.Her T-150 şişesine 20 mililitre sıcak DMEM %10 fetal buzağı serumu ekleyin. %5 karbondioksit altında 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka. 250 rpm ve 37 santigrat derece de bir gecede örnek sallayarak sonra, şişe de supernatant ağırlıklı olarak oligodendrosit soy hücreleri içeren hasat, ama aynı zamanda, bazı mikroglial hücreler, ve kaplamasız 100 milimetre Petri yemekleri plaka.Petri yemeklerini 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bu, mikroglial hücrelerin bulaşık yüzeyindeki diferansiyel hızlı yapışma yoluyla uzaklaştırılmasına olanak sağlar. Bu arada, her T-150 şişesini 25 mililitre sıcak, taze hazırlanmış kültür ortamı yla doldurun ve 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksit insantisinde ikinci titrene kadar kuluçkaya yatırın.Daha sonra, petri kapsallarından süpernatantı, artık mikroglial hücrelerin yapışmasını sağlamak için kaplamasız 100 milimetrelik yeni Petri kaplarına aktarın. Petri yemeklerini %5 karbondioksit in altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. Yapışık olmayan oligodendrosit soy hücreleri içeren her iki Petri kabından süpernatantı çıkarın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Mikroglia ile kaplanmış Petri tabaklarını atın. Tüpleri 423 kez 5 dakika santrifüj edin. Dikkatle supernatant çıkarın ve Bottenstein-Sato orta bir mililitre ile hücre pelet resuspend.Ortak bir 50 mililitrelik tüp tüm pelet havuz ve Bottenstein-Sato orta ile hücre yoğunluğuna bağlı olarak 20 veya 30 mililitre hacmi ayarlayın. İki veya üç önceden kaplanmış 100 milimetrelik Petri kapını ve 10 mililitre hücre süspansiyonu. %5 karbondioksit altında 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka.İki saat sonra, Bottenstein-Sato ortamının tamamını yenileyerek Petri tabaklarından enkazı temizleyin. %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde iki gün boyunca kuluçkaya yatırın. İki gün sonra, bir mikroskop altında kültürü inceleyin.Bir laminar akış kaputunda, steril koşullar altında, sıcak MPB-27 düşük orta 10 mililitre ile kültür ortamı yenilemek. %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde iki gün kuluçkaya yatırın. OCM hasat için, oligodendrocytes salgılanan faktörler içeren supernatant toplamak.Filtre 0,22 mikron filtre kullanarak OCM sterilize. Bu protokolde, oligodendrosit soy hücreleri göksitler ve mikroglia kapalı sallayarak glial kültürlerden arındırılır. Farklı belirteçlerin ekspresyonunun analizi, oligodendrosit kültürlerinin çoğunlukla O4 pozitif hücrelerin in 90 artı veya eksi %4'ü ile oligodendrosit öncesi, %85 artı veya eksi %7 NG2 pozitif hücreler ve PLP pozitif hücrelerinin 4,7 artı veya eksi %2,1'i ile gfap pozitif astrositi olduğunu göstermiştir.Bu tür kültürlerden üretilen OCM saflaştırılmış hipokampal nöron kültürleri için vitro üç gün eklendi. Bu tedavi notal proteinlerin kümelemesi teşvik eder. Hipokampal nöronların miyelinasyonu 14 gün in vitro oligodendroctyes eklenmesi ile çalışıldı.20 ila 24 gün in vitro, miyelin temel protein gibi miyelin belirteçlerinin immün boyanması, miyelin segmentlerinin ve Ranvier düğümlerinin görüntülenmesine olanak sağladı. Core PBS menenjlerin çıkarılması için önemlidir. Tempolu takas oligodendroctyes canlılığı ve pipet ile uygulanan akış güçlü fark için önemlidir.Oligodendrocyte-conditioned orta nöronal fizyolojisi üzerinde oligodendroctyes salgılanan faktörlerin etkisi içine fikir kazanmak için nöronal kültürlere eklenebilir. Nöronlar ile oligodendroctyes co-kültürler de miyelinasyon sürecini incelemek için yapılabilir.

generation-oligodendrocytes-oligodendrocyte-conditioned-medium-for-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler...

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Bu video, yetişkin fare beyninden lateral ventrikül duvarlarını izole etmek ve tek hücreler elde etmek için enzimatik doku ayrışması gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücrelerin proliferasyonunu seçici olarak artıran ve bunların oligodendrositlerin ve astrositlerin ko-kültürlerine farklılaşmasını teşvik eden spesifik kültür koşullarına tabi tutulur.

Yetişkin fare nöral kök hücrelerinden karışık oligodendrosit ve astrosit kültürü elde edilmesi

Bu video, insan kaynaklı nöronların (iN'ler) ve indüklenmiş oligodendrosit öncü hücrelerinin (iOPC'ler) bir ko-kültürünün kurulmasını göstermektedir. iN'ler bir ko-kültürde iOPC'lerle karıştırılır ve daha sonra her iki iN'nin nöronlara ve iOPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını desteklemek için inkübe edilir. Nöronlar, diğer nöronlar ve oligodendrositlerle sinaptik bağlantılar oluştururken, oligodendrositler, nöronların aksonlarının etrafında miyelin kılıfları geliştirir.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Bir Ko-Kültür Yöntemi

Video, oligodendrosit öncü hücrelerini (OPC'ler) oligodendrositlere farklılaştırmak ve dorsal kök ganglion (DRG) nöronları ile bir ko-kültürde miyelinasyonu indüklemek için bir protokolü göstermektedir. OPC'ler, miyelinasyonu düzenleyen bir sinyal proteinini kodlayan lentiviral vektörlerle dönüştürülür. Dönüştürülen OPC'ler, oligodendrositlere farklılaşmayı ve sinyal proteini kaynaklı miyelinasyonu değerlendirmek için DRG nöronları ile birlikte kültürlenir.

Oligodendrosit Öncü Hücreleri için İn Vitro Transdüksiyonla İndüklenen Miyelinasyon Testi

Bu video, oligodendrosit soy hücrelerinden oligodendrosit koşullu ortamın (OCM) üretimini, ortama moleküler salınımlarını artırmak için onları vurgulayarak gösterir. Büyüme faktörleri, sitokinler ve diğer biyoaktif moleküller açısından zengin olan bu besiyeri, oligodendrositlerin salgıladığı faktörlerin nöronal fizyoloji ve bağlantı üzerindeki etkisi hakkında fikir edinmek için nöron kültürlerine eklenebilir.

Oligodendrosit Şartlandırılmış Ortam Üretmek İçin Bir Yöntem

Bu video, fare yavrusu beyin korteksinden oligodendrosit öncü hücrelerini (OPC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir tekniği göstermektedir.

Fare Yavrusu Beyin Korteksinden Oligodendrosit Öncü Hücrelerinin İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Globoid hücreler, şu anda etkili bir uzun süreli tedavisi olmayan bir lökodistrofi olan Krabbe hastalığının tanımlayıcı bir patolojik özelliğidir. Aktive edilmiş mikrogliaların doğuştan gelen biyolojisini ve patojenik potansiyelini ve bunların globoid hücrelere dönüşümünü incelemek için bir hücre kültürü modeli geliştirdik.

Bir İn Vitro Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli

Burada, oligodendrosit öncü hücrelerini, merkezi sinir sistemi miyelinasyonunun in vitro modeli aracılığıyla oligodendrositlerdeki rollerini spesifik olarak sorgulamak amacıyla, ilgilenilen proteinleri aşırı eksprese etmek üzere viral olarak manipüle etmek için esnek ve stratejik bir temel sunan protokoller sunuyoruz.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller

Nörodejenerasyonda nöron-glial etkileşimler yetersiz araç ve yöntemler nedeniyle iyi anlaşılamamıştır. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden indüklenmiş nöronlar, oligodendrosit öncü hücreleri ve oligodendrositler elde etmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz ve Alzheimer hastalığında hücre tipine özgü katkıları anlamada bu yöntemlerin değerlerine örnekler sunuyoruz.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

Olgun oligodendrositlere dönüşen fetal veya yetişkin nöral kök hücrelerden elde edilen astrositlerin ve oligodendrosit öncül hücrelerin karma kültürlerinin üretimini ve zararlı uyaranların in vitro modellemesini anlatıyoruz. Hücre tabanlı yüksek içerikli tarama tekniği ile bağlantı, güvenilir ve sağlam bir ilaç tarama sistemi oluşturur.

Fetal ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Türevi Oligodendrosit Öncül Hücre Kültürlerinin Yüksek İçerik tarama farklılaşması ve olgunlaşma analizi

Öğrenin oligodendrosit saflaştırma ve ko-kültür yöntemlerini; sallama tekniği ile yüksek verimli hücre elde ederek miyelinasyon mekanizmalarını ve nöron etkileşimlerini araştırın. Bu yöntem, oligodendrosit-koşullu ortam üretimi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

Daha fazla video keşfet