Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

Biz oligodendroglial soy hücrelerinin arınma ve kültür etkili bir yöntem açıklar. Bu miyelinasyon sürecinde oligodendrocytes farklılaşma ve nöronlar ile etkileşimlerini kontrol moleküler mekanizmaları ele sağlar. Bu sallayarak tekniği pahalı değildir ve oligodendrocytes yüksek miktarda elde etmek için en uygun.

Bu tür kültürler nöronlar ile oligodendrocytes oligodendrocytes orta ve co-kültürlerin üretimine izin verir. Multipl skleroz merkezi sinir sisteminde fokal de-miyelinasyon neden olduğu bir hastalıktır, oligodendrocytes kaybı sekonder. Oligodendrocytes kültürü nasıl yeniden miyelinasyon teşvik etmek için daha iyi anlamak için bir araç sağlar.

Sadece oligodendroglial hücre kültürü gelişmeleri ve oligodendrocytes biyoloji düzenleyen içsel mekanizmalar içine anlayışlar sağlayabilir. Nöronlar ile co-kültürler nöronal fizyoloji üzerindeki etkileri hakkında fikir edinmek için izin verir. Başlamak için, göz seviyesinde hayvanın başını korumak için kavisli forceps kullanın.

Kafatasının tabanında küçük bir kesi yapmak ve beyin orta hattı aşağıdaki kafatası kesmek için küçük cerrahi makas kullanın. Kafatasının iki parçasını orta hattan yavaşça soymak için forceps kullanın. Baş boşluğundan beyin kaldırmak için küçük bir cerrahi kaşık kullanın.

Beyni 60 milimetrelik petri kabına koyun. Bir stereo mikroskop altında görüntüleme, beyincik kaldırmak için ince çerçiler kullanın, beyin sapı, ve serebral hemisfer koku ampulleri. İki serebral hemisferi ayırmak için ince pratisyen ler kullanın.

Menenjitleri soymak için ince forceps kullanın. Serebral kortikülleri 60 milimetrelik petri kabına koy. Bir laminar akış kaputunda, ince serebral korteksleri doğramak için keskin bir neşter kullanın.

Kıymalı dokuyu enzim sindirim ortamı içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kortikal doku tüpün alt kısmında kalır emin yaparken yavaşça enzim sindirim ortamı kaldırmak için bir pipet kullanın.

Bir mililitre DMEM %10 fetal buzağı serumu eklemek ve dokuyu hafifçe triturate etmek için P1000 mikropipet kullanın. Kortikal dokuyu 50 mililitrelik bir tüpe filtrelemek için 70 mikronluk bir filtre ve bir mililitrelik şırınganın pistonu kullanın. 50 mililitrelik tüpün iç tüp duvarındaki artık dokuyu DMEM %10 fetal baldır serumu ile birkaç kez durulayın.

50 mililitrelik tüpü DMEM %10 fetal baldır serumu ile doldurun. Oda sıcaklığında beş dakika 423 kez g santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve DMEM iki mililitre ile hücre pelet resuspend 10% fetal buzağı serum.

Hücre peletini P1000 mikropipeti ile ve ardından P200 mikropipetiyle hafifçe triturate. DMEM uygun hacmi ile hücre süspansiyon seyreltmek 10%fetal baldır serum. Bir T-150 şişesiüzerinde, santimetre kare başına beşinci hücrelere bir kat 10 yoğunlukta hücre süspansiyonunun beş mililitresini kesin.

Her T-150 şişesine 20 mililitre sıcak DMEM %10 fetal buzağı serumu ekleyin. %5 karbondioksit altında 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka. 250 rpm ve 37 santigrat derece de bir gecede örnek sallayarak sonra, şişe de supernatant ağırlıklı olarak oligodendrosit soy hücreleri içeren hasat, ama aynı zamanda, bazı mikroglial hücreler, ve kaplamasız 100 milimetre Petri yemekleri plaka.

Petri yemeklerini 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bu, mikroglial hücrelerin bulaşık yüzeyindeki diferansiyel hızlı yapışma yoluyla uzaklaştırılmasına olanak sağlar. Bu arada, her T-150 şişesini 25 mililitre sıcak, taze hazırlanmış kültür ortamı yla doldurun ve 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksit insantisinde ikinci titrene kadar kuluçkaya yatırın.

Daha sonra, petri kapsallarından süpernatantı, artık mikroglial hücrelerin yapışmasını sağlamak için kaplamasız 100 milimetrelik yeni Petri kaplarına aktarın. Petri yemeklerini %5 karbondioksit in altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. Yapışık olmayan oligodendrosit soy hücreleri içeren her iki Petri kabından süpernatantı çıkarın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Mikroglia ile kaplanmış Petri tabaklarını atın. Tüpleri 423 kez 5 dakika santrifüj edin. Dikkatle supernatant çıkarın ve Bottenstein-Sato orta bir mililitre ile hücre pelet resuspend.

Ortak bir 50 mililitrelik tüp tüm pelet havuz ve Bottenstein-Sato orta ile hücre yoğunluğuna bağlı olarak 20 veya 30 mililitre hacmi ayarlayın. İki veya üç önceden kaplanmış 100 milimetrelik Petri kapını ve 10 mililitre hücre süspansiyonu. %5 karbondioksit altında 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka.

İki saat sonra, Bottenstein-Sato ortamının tamamını yenileyerek Petri tabaklarından enkazı temizleyin. %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde iki gün boyunca kuluçkaya yatırın. İki gün sonra, bir mikroskop altında kültürü inceleyin.

Bir laminar akış kaputunda, steril koşullar altında, sıcak MPB-27 düşük orta 10 mililitre ile kültür ortamı yenilemek. %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde iki gün kuluçkaya yatırın. OCM hasat için, oligodendrocytes salgılanan faktörler içeren supernatant toplamak.

Filtre 0,22 mikron filtre kullanarak OCM sterilize. Bu protokolde, oligodendrosit soy hücreleri göksitler ve mikroglia kapalı sallayarak glial kültürlerden arındırılır. Farklı belirteçlerin ekspresyonunun analizi, oligodendrosit kültürlerinin çoğunlukla O4 pozitif hücrelerin in 90 artı veya eksi %4'ü ile oligodendrosit öncesi, %85 artı veya eksi %7 NG2 pozitif hücreler ve PLP pozitif hücrelerinin 4,7 artı veya eksi %2,1'i ile gfap pozitif astrositi olduğunu göstermiştir.

Bu tür kültürlerden üretilen OCM saflaştırılmış hipokampal nöron kültürleri için vitro üç gün eklendi. Bu tedavi notal proteinlerin kümelemesi teşvik eder. Hipokampal nöronların miyelinasyonu 14 gün in vitro oligodendroctyes eklenmesi ile çalışıldı.

20 ila 24 gün in vitro, miyelin temel protein gibi miyelin belirteçlerinin immün boyanması, miyelin segmentlerinin ve Ranvier düğümlerinin görüntülenmesine olanak sağladı. Core PBS menenjlerin çıkarılması için önemlidir. Tempolu takas oligodendroctyes canlılığı ve pipet ile uygulanan akış güçlü fark için önemlidir.

Oligodendrocyte-conditioned orta nöronal fizyolojisi üzerinde oligodendroctyes salgılanan faktörlerin etkisi içine fikir kazanmak için nöronal kültürlere eklenebilir. Nöronlar ile oligodendroctyes co-kültürler de miyelinasyon sürecini incelemek için yapılabilir.