Homojen Hücre Dağılımı için Üç Boyutlu Biyobaskıda Çok Katmanlı Hidrojel Bioink'in Kullanılması

Protokolümüzü kullanarak, sıvı benzeri biyoink seyreltmelerinin çok katmanlı olması sadece kapsüllenmiş hücrelerin homojen dağılımını teşvik etmekle kalmıyor, aynı zamanda hücreye uygun bir biyoink ortamını da korumasağlıyor. Biyoink rezervuarı içindeki kapsüllenmiş hücrelerin sedimantasyonunu durdurmak için interfacial gerilimi kullanırız, ekstrüzyon baskı sırasında hücrelere yüksek kesme gerilim yükünden kaçınArak. Bu teknolojiyi kullanarak, homojen hücre dağılımı ile 3D doku yapıları üretebilir, ilaç tarama ve rejenerasyon tıbbı çalışmalarında kullanılmak üzere fonksiyonel bir in vitro doku kalıbı sağlayan.

Bioink hazırlanırken, bu faktörler mürekbe kalitesini etkileyebilir gibi, deneysel sıcaklık ve higrogel yükleme prosedürü dikkat etmek önemlidir. Hazırlık başlamadan önce, tüm malzemeleri sterilize etmek için 0,22 mikrometreşırış filtre üniteleri kullanın ve biyolojik bir güvenlik kabininde 50 derece-Celsius-Santigrat PBS'de jelatini %10 nihai konsantrasyona eritin. 50 santigrat derecede en az bir saat yavaş karıştırma ile 0,6 ila bir ağırlık oranı jelatin çözeltisine metakrilik anhidrit ekleyin.

Kuluçka sonunda, karışık çözeltiyi steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve çözeltiyi santrifüj ile katmanlara ayırın. Üst GelMA tabakasıtoplamak ve 40 ila 50 derece-Celsius deiyonize su iki cilt ile toplanan çözelti seyreltmek. GelMA çözeltisini, 12 ila 14 kiloda moleküler ağırlık kesme diyaliz membranı ile 40 ila 50 santigrat derecede beş ila yedi gün boyunca deiyonize suya karşı diyaliz emzvesi ile diyalize getirin ve suyu günde iki kez değiştirin.

Diyaliz sonunda, eksi 80 santigrat derece bir gecede GelMA çözeltisi dondurmak. Daha sonra Eksi 45 santigrat derece ve 0,2 milibar basınç bir dondurucu kurutucu üç ila beş gün boyunca GelMA çözeltisi lyophilize. Daha sonra PBS'de %10 fetal sığır serumu, 25 milimoler HEPES ve %0.5 fotobaşlatıcı ile takviye edilen lyophilized GelMA'yı eritin.

İpek fibroin GelMA bioinks elde etmek için, tabloda önerildiği gibi ilk ipek fibroin çözeltisi farklı hacimlerde ve PBS farklı hacimlerde GelMA çözeltisi karıştırın. Tüm bioinks hazırlandığında, 10 ila 20 dakika için çözüm sonicate. Mürekkepler sonicating iken, biyoink çözeltisi başına bir 15 mililitrekonik tüp içine% 80 uyumlu NIH/3T3 hücre kültüründen hücreleri toplamak ve santrifüj ile hücreleri pelet.

Daha sonra dikkatle supernatants aspire ve biyoink çözeltisi konsantrasyonu mililitre başına altı hücre bir kez 10 biyoink iki mililitre ile her tüp hücreleri resuspend. Baskı için bioink yüklemek için, iki mililitreşyon şırınga alt tabakasına hücre yüklü ipek fibroin 0.5 GelMA aspire 400 mikrolitre ekleyin. Sınır ısınır güçlükte, alt tabakabioink' i bir jel durumuna düşürmek için şığı beşdakika sAntigrat derecelik bir buz su banyosuna yerleşimdirerek, 400 mikrolitre hücre yüklü ipek fibroin mikrobüsünü ipek fibroin 0,5 GelMA' nın katmasının üzerinde nüfuzlu bir jel durumuna düşürür

Sonra beş dakika boyunca buz banyosu için şırınga dönmek, aynı şekilde şırınga hücre yüklü bioink her ek konsantrasyon eklemeye devam. Farklı katmanlarda farklı konsantrasyonlarda ipek fibroin içeren çok katmanlı bir biyoink sistemi elde edildiğinde, bioink 37 derecelik bir inkübatörde 30 dakika ısıtın. Kuluçka sonunda, şırınga üzerine 27-gauge baskı başlığı yükleyin ve akış hızını dakikada 50 mikrolitreye, nozulun hareketli hızını saniyede iki mililitreye, nozulun yüksekliğini ise bir milimetreye ayarlayın.

Sonraki oda sıcaklığında özel yapım biyoyazıcı kullanarak bir ekstrüzyon şekilde doku yapısı baskı ve 800 miliwatt 40 saniye boyunca ultraviyole ışık 365 nanometre ile biyobasılan doku yapısı çapraz bağlantı. Daha sonra dmem çapraz bağlı doku yapısı% 10 fetal sığır serum ve% 1 penisilin-streptomisin bir hücre kültürü kuluçka ile takviye, ilk iki gün boyunca her sekiz saatte bir orta değişen ve her iki veya üç gün sonra. Bu temsili analizde, biyobaskı prosedürü ilerledikçe, hedef kuyularda hücrelerin yoğunluğu tüm gruplarda azalmıştır.

İpek fibroin sıfır GelMA grubunda hücrelerin yaklaşık %70'i alt tabakada birikti. Bir GelMA grubunda ipek fibroin, hücrelerin yaklaşık %40'ı alt tabakada, yaklaşık %5'i ise üst tabakada birikti. İpek fibroin çok katmanlı GelMA grubunda kapsüllü hücrelerin birikimi kontrol gruplarından daha homojendi.

Bu protokolün en kritik parçası SF-GelMA bioink çok katmanlı yükleme. Bu protokol, sıvı benzeri biyoinks kullanan diğer ekstrüzyon biyobaskı analizlerine uygulanabilir.