Name: İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Keşfedin, iPSC'ler kullanılarak kişiselleştirilmiş kan-beyin bariyeri chip üretimini. Bu mikroakışkan teknoloji, santral sinir sistemi ilaç geçirgenliğini tahmin etmeye ve nörolojik hastalıkları incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Soshana Svendsen'e eleştirel kurgu için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı hibe 1621/18, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST), İsrail 3-15647, Kaliforniya Rejeneratif Tıp hibe ID DISC1-08800, Sherman Aile Vakfı, NIH-NINDS hibe 1UG3NS105703 ve ALS Derneği hibe 18-SI-389 tarafından desteklenmiştir. AH, Wallenberg Vakfı tarafından finanse edilmiştir (hibe numarası 2015.0178).

1. IPSC kaynaklı nöral progenitor hücrelerinin (iNPCs) üretimi
<ol><li>Aşağıda açıklandığı gibi ve daha önce yayınlanan20,21,22iPSC kolonilerinden EZ-küreler üretin.<ol>
<li>Kültür iPSC kolonileri mTESR1 veya diğer ticari ortamda (bkz. Malzeme Tablosu)bodrum membran matris kaplı 6 kuyu plakaları (0.5 mg /plaka) üzerinde biraraya gelmek için).</li>
		<li>iPSC ortamını çıkarın ve 2 mL EZ-küre orta ile değiştirin [ESM; DMEM:F12 7:3 ile desteklenmiş 100 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 100 ng/mL epidermal büyüme faktörü, 5 g/mL heparin, ve %2 B27 takviyesi].</li>
		<li>Steril 1000 μL pipet ucu veya hücre kazıyıcının arka sıyla her bir konflufluentin altını iyice kazıyın.</li>
		<li>Serbest yüzen kürelerin kendiliğinden oluşmasını sağlamak için tüm hücreleri toplayın ve ultra düşük eki T25 şişesine yerleştirin. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Ortam sarıya döndüğünde küreleri her 2-3 günde bir taze ESM ile değiştirerek besleyin. Bu küreler için son derece büyüme ve bakım için önemlidir koşullu ortamda kalmasını sağlar.<ol>
<li>Şişeyi bir tüp rafına yaslayın ve kürelerin şişenin köşesine 1-2 dk kadar yer çekimiyle yerleşmesine izin verin.</li>
			<li>Yerleştikten sonra, 5 mL veya 10 mL serolojik pipet ile supernatant ın yarısını aspire edin ve taze, önceden ısıtılmış ESM ile değiştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Daha önce açıklandığı gibi200μm çapları küreler doğrama tarafından Passage EZ-küreler haftalık 23,20,21. EZ küreleri 25 ayete kadar korunabilir ve 8-25 pasajları arasında kullanıldığında idealdir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>iNPM'lerin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması:<ol>
<li>Nöral farklılaşmayı tetiklemek için EZ küresini tek hücrelere ayırın.</li>
		<li>Bir T75 şişesinden doğramadan 3-4 gün sonra küreleri toplayın ve 15 mL konik bir alana aktarın, sonra 2 dakika boyunca veya tüm küreler dibe yerleşene kadar bekletin.</li>
		<li>Yerleşmiş küreleri bozmadan 5 mL'lik pipetle ESM'yi yavaşça çıkarın. 1 mL ayrışma çözeltisi ekleyin (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Herhangi bir yerleşmiş küreler tedavi edilmesini sağlamak için kuluçka 5 dakika sonra dissociation çözüm ve küreler girdap.</li>
		<li>Ayrışma çözeltisini yavaşça çıkarın. 1 mL nöral farklılaşma ortamı ekleyin [NDM; DMEM: F12 ile 2% B27 eksi A vitamini, 1% N2 takviyesi, ve insan beyin kaynaklı nörotrofik faktör (hBDNF, 20 ng / mL)].</li>
		<li>1 mL pipet ve ardından 200 μL pipet kullanarak tüm küreler ayrışıncaya kadar küreleri tek bir hücreye ayırın. Triturasyon işlemi sırasında kabarcık oluşumundan kaçının.</li>
		<li>Hemositometre kullanarak ayrışmış hücreleri sayve hücreleri 1 x 106 hücre/mL'lik son yoğunluğa kadar seyreltin. Uygulamaya bağlı olarak yoğunluğu değiştirmek mümkündür. NOT: 3 güne kadar kısa süreli kültürler için daha yüksek yoğunluklar (6 x 106 hücre/mL) önerilir ve 3 haftaya kadar uzun süreli uygulamalar için daha düşük yoğunluklar önerilir. NOT: Hücreler artık çipin üst kanalına tohum atarak "beyin tarafını" oluşturmaya hazırdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. iPSC'lerin iBMEC'lere Farklılaşması
<ol><li>1:6 oranında 6 kuyulu bir plakanın tek bir confluent kuyusundan 6 kuyulu bir membran matris kaplı plakaya geçiş iPSC'leri. Hücrelerin 24 saat boyunca yapışmasını sağlar.</li>
	<li>Hücreleri her gün hemositometre kullanarak say.</li>
	<li>Hücreler 1.5-3.0 x 105 hücre/kuyu yoğunluğuna ulaştığında, iPSC ortamını bFGF olmadan 3 mL koşulsuz ortam [DMEM:F12 1:1, nakavt serum replasmanı (KOSR), %1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), %0,5 glutamin takviyesi(Malzeme Tablosu)ve 100 μM β mercaptoeol] ile değiştirin. Orta orta günlük 6 gün24değiştirin.</li>
	<li>6. günde orta ortamı endotel hücresi (EC) orta [insan endotel serumu serbest orta (hESFM) %1 trombosit-zayıf plazma türevi büyükbaş hayvan serumu, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM all-trans retinoik asit (RA)] ile değiştirin. Orta yı 2 gün bekletin.</li>
	<li>EC ortamını çıkarın ve kuyu başına 1 mL dissociation çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 35 dk kuluçkaya yatırın. </li><li> </li><li></li><li> </li></ol><ol><li></li></ol><ol><li><ol><li><li><li></li><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li> </li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li><li> </li><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li><li><ol><li></li><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li></li><li><li><li></li><li></li><li></ol><ol><li><li><li><li><ol><li><li></li><li></li><li><li><li><ol><li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li><li><li><li><li></li></ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60925/60925equ01.jpg"><ol start="8"><li></ol><ol><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li></ol>

<ol><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets%3A+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li>
<li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+blood-brain+barrier%3A+beyond+the+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li>
<li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15(2019).</li>
<li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Patent+Analyst%22%5BJournal%5D)">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li>
<li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li>
<li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+%28mct%29+8-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li>
<li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis%3A+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology+and+Neurosurgical+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li>
<li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965(2017).</li>
<li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507(2014).</li>
<li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256(2016).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release%22%5BJournal%5D)">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li>
<li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621(2019).</li>
<li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li>
<li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurements+of+human+epithelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell%E2%80%93derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZ+spheres%3A+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li>
<li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219(2014).</li>
<li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li>
<li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li>
<li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-enhanced%2C+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160(2014).</li>
<li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells%2C+astrocytes%2C+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li>
<li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li>
<li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783(2012).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679(2017).</li>
<li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li>
<li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23(2018).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135(2013).</li>
<li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
</ol>

Cedars-Sinai Emulate, çalışmanın mikroakışkan Organ yongaları üreten şirket bir azınlık hisse senedi hisse sahibi. Cedars-Sinai'nin bir subayı da Emulate'in Yönetim Kurulu'nda görev yapmaktadır. Taklit bu araştırma için hiçbir mali destek sağladı. Cedars-Sinai ve Emulate bu çalışma ile ilgili patent leri var.

NVU'daki organ-on-chip teknolojisi ve iPSC kaynaklı hücrelerin birleşimi, insan BBB'nin doğru bir şekilde modellemesi için umut vaat ediyor. Burada, son zamanlarda yayınlanan iPSC tabanlı BBB çip16basit ve sağlam uygulama için ayrıntılı bir protokol sağlar. Tohumlama paradigmasının genel bakışı ve zamanlaması Şekil 3'tegösterilmiştir. BBB modellemesi için uygun bariyer fonksiyonlarını elde etmek ve sürdürmek, homojen bir iBMEC monolayer oluşturmak ve bütünlüğünü korum...

BBB, CNS'yi dolaşan kandan ayıran son derece seçici bir bariyerdir. Aynı zamanda beyin homeostaz1 korumak için gerekli besin ve diğer metabolitlerin akını sağlarken potansiyel olarak yıkıcı maddeler, faktörler ve kksobiyotikler kritik beyin fonksiyonları korur1. BBB, perisitlerin, astrosit endfeet'in ve nöronal süreçlerin beyin mikrovasküler endotel hücrelerine (BMEC) doğrudan temas ettiği çok hücreli bir NVU'dur. Bu etkileşimler BMECs sıkı ve bağlı kavşaklar2,3tarafından desteklenen özel bariyer özellikleri oluşturmak için izin verir. Bu bariyerin oluşumu moleküllerin parasellüler geçişini sınırlar, ancak molekülleri cns'ye veya kageri taşımak için polarize taşıyıcılar içerir1. Bu benzersiz bariyer özellikleri nedeniyle, BBB beyne biyofarmasötik lerin teslimi için önemli bir engel oluşturmaktadır, ve fda onaylı küçük moleküllerin az% 5 CNS ulaşabilirsiniz tahmin edilmektedir4.
Hayvan modelleri yaygın BBB penetrance ve BBBgelişiminde yer moleküler mekanizmalar 5 çalışma için kullanılmıştır. Hayvan modelleri sadakatle in vivo ortamda karmaşık çok hücreli temsil ederken, ifade ve BBB taşıyıcıların aktivitesi farklılıkları yanı sıra türler arasında substrat özgüllüğü genellikle insanlar için hayvan verilerinin doğru ekstrapolasyon engel6. Bu nedenle, insan tabanlı modeller insan BBB çalışma ve CNS hedef tasarlanmış ilaçların geliştirilmesinde kullanılmak üzere önemlidir. Bu ihtiyaç, ilaç geliştirme alanında biyolojik, insana özgü ilaçların artan hakimiyeti ile daha da belirgin hale gelir. Kanıt birikmesi, tehlikeye bbb ciddi CNS bozuklukları bir dizi ile ilişkili olduğunu göstermektedir, beyin tümörleri ve nörolojik hastalıklar da dahil olmak üzere7,8,9. Bu hastalıkları sadakatle yansıtan insan modelleri hem 1) ilaç gelişimi için hedeflenebilir yeni yollar belirlemek ve 2) CNS penetrans tahmin, böylece klinik öncesi çalışmalarda zaman ve kaynakları azaltmak ve muhtemelen klinik çalışmalarda başarısızlık oranını azaltarak potansiyeline sahip.
In vitro modelleri yaygın BMECs ve NVU diğer hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek ve prospektif BBB geçirgen ilaçlar için ekranları yürütmek için uygulanmıştır10. İnsan BBB'nin temel yönlerini yeniden oluşturmak için, in vitro modeller fizyolojik olarak ilgili özellikleri (örn. düşük parasellüler geçirgenlik ve fizyolojik olarak ilgili transendotelelektrik direnci [TEER] endotel monotabakası boyunca göstermelidir. Buna ek olarak, bir in vitro sistemin moleküler profili temsili fonksiyonel taşıma sistemlerinin ifadesini içermelidir. Tipik olarak, in vitro modeller bbb özelliklerini geliştirmek için diğer NVU hücrelerinin kombinasyonları ile yarı geçirimli bir membran üzerinde birlikte kültürlenen endotel hücrelerinden oluşur11. Bu yaklaşım bariyer işlevselliği ve molekül geçirgenliğinin basit ve nispeten hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu tür hücre bazlı BBB modelleri, cerrahi eksizyonlardan veya ölümsüzleştirilmiş BMEC hatlarından izole edilmiş hücreler de dahil olmak üzere hayvan veya insan hücre kaynakları ile kurulabilir.
Son zamanlarda, protokoller BMECs içine insan pluripotent hücreleri ayırt etmek için in vitro insan BBB modelleri için cazip bir kaynak olarak tanıtıldı12,13. İndüklenen pluripotent kök hücre (iPSC)kaynaklı BMECs (iBMECs) yüksek ölçeklenebilir, insan BBB önemli morfolojik ve fonksiyonel özellikleri göstermek, ve hastanın genetik taşır. Kültürde, iBMEC'ler sıkı bağlantı işaretlerini ifade eden ve vivo benzeri sıkı bağlantı komplekslerini görüntüleyen bir monolayer oluşturur. Bu hücreler ayrıca BBB glikoz taşıyıcısı, glikoz taşıyıcısı 1 (GLUT1) dahil olmak üzere BBB belirteçlerini ifade eder. Daha da önemlisi, ve insan BMECs için diğer alternatif hücre kaynaklarının aksine, iBMECs bu vivo ölçülen kadar yüksek değerlere sahip bariyer özellikleri elde14, bazolateral eksen boyunca polarize, ve fonksiyonel efflux pompalar ifade. Ayrıca, çeşitli konulardan gelen iPSC'lerin kullanımı 1) BBB'nin yönlerini kişiselleştirilmiş bir tıp tarzında test etme fırsatını memnuniyetle karşılar ve 2) NVU'nun ek hücre tipleri oluşturmak için esnek bir kaynak sağlar. Kişiselleştirilmiş BBB yongaları oluşturmak için izojenik bir hücre kaynağından bu hücreleri üreten de ilaç yanıtları, klinik çalışmalarda gözlenen tedaviye direnç veya uzlaşmalı yanıt için önemli bir neden dir bireysel farklılıkların anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
iBMEC'lerin bir çanakta veya yarı geçirimli transwell eklentisinde monolayers olarak kullanılması BBB modellemeiçin güçlü bir yaklaşımı temsil eder. Bu sistemler sağlam, tekrarlanabilir ve uygun maliyetli olma eğilimindedir. Buna ek olarak, TEER ve geçirgenlik gibi fonksiyonel analizlerin gerçekleşmesi nispeten kolaydır. Ancak, iki boyutlu (2D) sistemler in vivo dokunun 3Boyutlu doğasını özetleyemedi ve kan ve kan hücrelerinin dolaşımı tarafından sağlanan fizyolojik kesme stres kuvvetlerinden yoksundur. Bu, bu modellerde vasküler endotel yeteneğini geliştirmek ve içsel BBB özellikleri ve fonksiyonları korumak için sınırlar.
Canlı hücreler tarafından sıralanmış mikro mühendislik sistemleri, organ-on-chips adı verilen bir kavram içinde çeşitli organ işlevlerini modellemek için uygulanmıştır. İnvivo benzeri çok hücreli mimari, doku-doku arayüzleri, fizikokimyasal mikroortamlar ve vasküler perfüzyonu yeniden oluşturarak, bu mikromühendislik platformları doku ve organ işlevselliği mümkün olmayan düzeylerde geleneksel 2D kültür sistemleri. Ayrıca in vivo doku ve organ bağlamında canlı hücrelere benzer biyokimyasal, genetik ve metabolik profillerin yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görüntüleme ve analizini sağlarlar. Ancak, organ-on-chip belirli bir sorun, tasarım, imalat ve bu mikromühendislik yongaları uygulama genellikle biyolojik odaklı akademik laboratuvarlarda eksik özel mühendislik uzmanlık gerektirir.
Biz son zamanlarda kişiselleştirilmiş bir BBB çip modeli oluşturmak için iPSC ve organ-on-chip teknolojileri kombine ettik15,16. Açıklanan teknolojik zorlukların üstesinden gelmek için, ticari olarak kullanılabilen Chip-S1, çiplerin bakımını basit ve sağlam bir şekilde otomatikleştirmek için tasarlanmış bir araç olan kültür modülüyle birlikte kullanılmaktadır (Öykünme A.Ş.). BBB çipi nöral ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri yeniden oluşturur ve entegre altın elektrotlar17ile özel yapım organ yongaları ile ölçülen fizyolojik olarak ilgili TEER değerleri elde eder. Ayrıca, BBB çip düşük parasellüler geçirgenlik görüntüler, organ düzeyinde inflamatuar ipuçları yanıt, aktif efflux pompalar ifade, ve çözünür biyobelirteçleri ve biyofarmasötiklerin öngörülü taşıma sergiler. Özellikle, BBB yongaları birkaç kişiden oluşturulan sağlıklı bireyler ve nörolojik hastalıkları olan hastalar arasında beklenen fonksiyonel farklılıklar yakalar15.
Aşağıda açıklanan protokol, dinamik akış koşullarında insan iPSC tabanlı BBB yongalarının üretimi için güvenilir, verimli ve tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamaktadır. Doğrudan BBB çipinde veya numune alma atıklarından yapilebilen tahlil ve uç nokta analizlerinin türünde rehberlik sağlanır. Böylece protokol, biyolojik ve fonksiyonel özelliklerin ve tepkilerin insanla ilgili bir modelde değerlendirilmesi için uygulanabilecek teknik lerin spektrumlarını göstermektedir.
burada iPSC tabanlı BBB çipin kısa bir açıklaması verilmiştir. İnsan iPSCs başlangıçta farklılaşmış ve nöral progenitors serbest yüzen agregalar olarak doku kültürü şişeleri yayılır, EZ-küreler denir. Chip-S116üst kanal,18,19, hücrelerin nöral ata hücreleri (iNPCs), iAstrocytes ve iNeurons karışık bir kültür içine 7 gün içinde ayırt olarak, çipin "beyin tarafı" oluşturan ayrıştırılmış EZ-küreler ile tohumlu olduğunu. İnsan iPSC'leri de doku kültürü plakalarında iBMEC'lere ayrılır. Çipin alt kanalı iBM'lerle tohumlanır ve endotel tüpü oluşturmak için gelişirken "kan tarafını" oluştururlar (Şekil 1). Üst ve alt kanalları ayıran gözenekli hücre dışı matriks (ECM) kaplı membran, kanallar ve 2 arasındaki hücre-hücre etkileşimlerinin oluşmasına izin verir) kullanıcının geleneksel Bir ışık mikroskobu kullanarak her iki kanalda da geçirgenlik tahlilleri ve görüntü hücrelerini çalıştırmasına olanak tanır.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SCR005</td><td>Ayrışma çözümü</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Bfgf</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Chip-S1</td><td>Emulate Inc</td><td>Chip-S1</td><td>Organ-Chip</td></tr><tr><td>Kollajen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran-FITC</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>DMEM: F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>Eşek serumu</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Öykünme Reaktif 1 (ER-1)</td> <td>Öykünme Inc</td><td>ER-1</td><td></td></tr><tr><td>Öykünme Reaktif 2 (ER-2)</td> <td>Öykünme Inc</td><td>ER-2</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Glial Fibriler Asidik Protein (GFAP)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>GLUT-1</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-11315</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Glutamin takviyesi</td></tr><tr><td>hBDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Bodrum membran matrisi</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri, Inc.</td><td>85851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Biyolojik endüstriler</td><td>01-340-1B</td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td></td></tr><tr><td>NutriStem</td><td>Biyolojik endüstriler</td><td>05-100-1A</td><td>Alternatif ortam</td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10333</td><td></td></tr><tr><td>Trombositten fakir plazma türevli sığır serumu (PPP)</td><td>Biyomedikal Teknolojiler</td><td>J64483AB</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik asit (RA)</td> <td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>S100 ve beta;</td><td>Abcam</td><td>ab6602</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Steril Santrifüj Tüpü Üst Filtre Ünitesi</td><td>Millipore SCGP00525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Monoklonal Antikor</td><td>İnvitrojen</td><td>33-9100</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; III-tübülin (Tuj1&alfa;)</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan ipsc tabanlı kan-beyin bariyer chip Üretimi

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Kan beyin bariyeri (BBB) nörovasküler birimler tarafından oluşur (NUS) bu kalkan merkezi sinir sistemi (CNS) hassas beyin fonksiyonlarını bozabilir kanda bulunan bir dizi faktörden. Bu nedenle, BBB CNS terapötik teslim için önemli bir engeldir. Kanıt birikmesi BBB başlangıç ve nörolojik hastalıkların ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu nedenle, CNS hedefli ilaçların penetrasyon tahmin yanı sıra sağlık ve hastalık BBB rolünü açıklığa kavuşturabilir bir BBB modeli için büyük bir ihtiyaç vardır.
Yakın zamanda, insanlar için tamamen kişiselleştirilmiş bir BBB çipi üretmek için çip üzerine organ ve indüklenen pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojilerini birleştirdik. Bu yeni platform insan BBB genelinde ilaç ve molekül taşıma tahmin için uygun hücresel, moleküler ve fizyolojik özellikleri görüntüler. Ayrıca, hastaya özel BBB çipleri kullanarak, nörolojik hastalık modelleri oluşturduk ve kişiselleştirilmiş prediktif tıp uygulamaları için potansiyel gösterdi. Burada iPSC kaynaklı BBB yongalarının nasıl üretiliş gösterilmiş olduğunu gösteren ayrıntılı bir protokol, iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (iBT'ler) farklılaşmasıyla başlayan ve nöral atalar içeren karışık sinir kültürleriyle sonuçlanan, farklılaştırılmış nöronlar ve astrositler. Ayrıca, hücreleri organ çipine tohumlama ve BBB yongalarının kontrollü laminar akışı altında birliğe dönüştürme prosedürü de açıklanmıştır. Son olarak, ilaç ve molekül geçirgenliğinin değerlendirilmesi için parasellüler geçirgenlik tahlilleri ve çip içindeki hücre tiplerinin bileşimini belirlemek için immünositokimyasal yöntemler de dahil olmak üzere BBB çip analizlerinin ayrıntılı açıklamaları sağlanmaktadır.

Şekil 6A,B,C "beyin tarafı" üst kanal üzerinde EZ-küreler ve "kan tarafı"" alt kanal üzerinde iBMECs ile tohumlu bir BBB çip temsil eder. iBMECs ilk tohumlu ve bir gecede eklemek için izin verildi, sonra EZ-küreler tohumlu edildi. Cips daha sonra yedi gün boyunca günlük medya değişimi ile statik koşullar altında kültürlü edildi. BBB çipi daha sonra RT'de %4 PFA kullanılarak 10 dakika boyunca sabitlendi ve 3x DPBS ile yıkandı. İmmünositokimya BBB çipinde 1) nöral progenitör h...

Kan-beyin bariyeri (BBB) sıkı beyin homeostazı düzenleyen bir çok hücreli nörovasküler birimdir. İnsan iPSC'leri ve çip üzerine organ teknolojilerini birleştirerek, hastalık modellemesi ve CNS ilaç penetrite tahminleri için uygun kişiselleştirilmiş bir BBB çipi ürettik. BBB çipinin üretimi ve işletimi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Bu protokol, merkezi sinir sistemi ilaç geçirgenliğini tahmin etmek ve nörolojik bozuklukları incelemek için kullanılabilecek tamamen insan, kişiselleştirilmiş, mikroakışkan kan-beyin bariyeri oluşturmak için bir organ-on-chip üzerinde farklılaştırılmış pluripotent kök hücrelerin tohumlanmış nasıl gösterecektir. Ticari olarak kullanılabilen bir organ-on-chip kullanarak, herhangi bir biyolojik odaklı laboratuvar kişiselleştirilmiş, mikroakışkan kan-beyin bariyer-on-chip oluşturmak için bu teknolojiyi nasıl kullanabileceğini gösterecektir. Biriken kanıtlar BBB'nin genetik nörolojik hastalığı olan bireylerin iPSC'lerinden elde edilen kişiselleştirilmiş BBB yongaları üreterek nörolojik hastalıklarda rol oynadığını göstermektedir.BBB'nin sağlık ve hastalıktaki rolünü incelemek mümkün olacaktır. Bu yöntem aynı zamanda ilaç şirketleri için yararlı olabilir, hangi insan beynine aday nörolojik ilaçların penetrability için ekran için bu insan BBB platformu kullanabilirsiniz. Organ-on-chip teknolojilerinin uygulanması genellikle özel mühendislik becerileri gerektirir.Ticari olarak kullanılabilen platformların kullanılması, bu teknolojinin biyolojik olarak yönlendirilen herhangi bir laboratuvarda uygulanmasını sağlar. Başlamak için, biyogüvenlik kabine hazırlanan cips içeren çanak getirmek. P200 pipetkullanarak, girişe 200 mikrolitre nöral farklılaşma ortamı ekleyerek ve sıvıyı prizden çekerek her iki kanalı da nazikçe yıkayın.Bağlantı noktalarıyla temastan kaçınarak, talaş yüzeyinden fazla ortam damlacıklarını dikkatlice aspire edin. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre süspansiyonuna hafifçe çalkalayın. beyin tarafını oluşturmak için iPSC kaynaklı nöral progenitor hücrelerini üst kanala tohumlamak için, bir kere 10 ila altı hücre nin konsantrasyonunda 30 ila 100 mikrolitre hücre süspansiyonu içeren bir P200 ucu ekleyin ve ucunu pipetten yavaşça bırakın.Boş bir P200 pipetalın, pistonun tuşuna basın, üst kanal prizine takın ve tek hücreli süspansiyonu dikkatlice uçtan çekin. Üst kanaldaki hücrelerin tohumlama yoğunluğunu ve homojen dağılımını kontrol etmek için çipi mikroskoba aktarın. Hücre yoğunluğunu %20 oranında doğruladıktan sonra, çipleri hemen 37 santigrat derecede iki saat boyunca kuvöze yerleştirin.Bundan sonra, girişe taze nöral farklılaşma ortamı ekleyerek ve pipet yoluyla prizden sıvıçekerek bağlanmayan hücreleri yıkayın. Günlük nöral farklılaşma orta değiştirme ile 37 santigrat derece statik koşullar altında hücreleri tutun. INPC'ler bağlandıktan sonra veya tohumlamadan sonraki bir gün, hazırlanan talaşları içeren kabı biyogüvenlik kabinine getirin.Alt kanalı 200 mikrolitre endotel hücreli ortamla hafifçe yıkayın. Bağlantı noktalarıile temastan kaçınarak, talaş yüzeyinden aşırı endotel hücreli ortama ait damlacıkları dikkatlice aspire ederek her iki kanalda da orta noktayı terk etmenizi sağlar. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre süspansiyonuna hafifçe çalkalayın.P200 pipetkullanarak, mililitre başına altı hücreye 14 ila 20 kat konsantrasyonda iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücresi süspansiyonunun 30 ila 100 mikrolitresini çekin ve ucu alt kanal girişine yerleştirin. Fonksiyonel bariyer özellikleri elde etmek için en kritik adım beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin tohumlama olduğunu. Organ çipi içinde homojen dağılımı doğrulamak için kabarcık oluşumunu önlemek için uygun yoğunlukta tohum hücreleri için çok önemlidir.Boş bir uçla P200 pipetindeki pistonu bastırın, alt kanal prizine yerleştirin ve tek hücreli süspansiyonu alt kanaldan dikkatlice çekmek için pipet pistonunu yavaşça bırakın. Çipin yüzeyinden fazla hücre süspansiyonu aspire edin. Kanallardan hücre süspansiyonu çıkmadığından emin olmak için giriş ve çıkış bağlantı noktalarıyla doğrudan temastan kaçının.Tohumlama yoğunluğunu kontrol etmek için çipi mikroskoba aktarın. Alt kanal arasında gözlemlenebilir boşluklar olan hücrelerle doldurulur. Doğru hücre yoğunluğunu doğruladıktan sonra, kalan talaşlarda hücreleri tohum.Hücreleri alt kanalın üst kısmında bulunan gözenekli zara takmak için, her bir çipi ters çevirin ve bir yonga beşiğinde dinlenmelerine izin verin. Hücrelere nem sağlamak için 150 milimetrelik kabın içine steril DPBS içeren küçük bir rezervuar yerleştirin. Talaşları yaklaşık üç saat veya alt kanaldaki hücreler bağlanana kadar 37 derecede kuluçkaya yatırın.IPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücreleri bağlandıktan sonra, alt kanalın alt kısmına hücre ekine izin vermek için talaşları dik konuma geri çevirin. 48 saat sonra iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin tohumlama, bir saat boyunca 37 derece santigrat derece su banyosunda ısınma tarafından endotel hücre ortamının sıcaklığını dengeleyin. Daha sonra, 15 dakika boyunca vakum lu filtrasyon sistemi altında kuluçka ile orta degas.Daha sonra, taşınabilir modül ambalajı ve tepsilerin dış kısmını %70 etanol ile temizleyin, silin ve biyogüvenlik kabinine aktarın. Paketi açın ve modülleri tepsinin arkasına doğru rezervuarlarla yönlendirin. Pipet her giriş rezervuar için önceden dengeli, sıcak medya üç mililitre.Alt kanalın giriş haznesine endotel hücre kültürü ortamı nı ve üst kanalın üst kanal giriş haznesine nöral farklılaşma ortamını ekleyin. Daha sonra, pipet 300 mikrolitre önceden dengelendirilmiş, sıcak ortam her çıkış rezervuar, doğrudan her çıkış noktası üzerinde. Her tepsiye en fazla altı taşınabilir modül yerleştirin.Tepsileri kuvöze getirin ve tepsi tutamacı dışa bakacak şekilde kültür modülüne tamamen kaydırın. Kültür modülündeki asal döngüyü seçin ve çalıştırın. Kuluçka makinesi nin kapağını kapatın ve kültür modülünün taşınabilir modülleri yaklaşık bir dakika boyunca astarlamasını bekleyin.Durum çubuğu hazır olduğunda astar döngüsü tamamlanır. Tepsiyi kültür modülünden çıkarın ve biyogüvenlik kabinine getirin. Taşınabilir modüllerin başarıyla astarlandığını doğrulamak için biyogüvenlik kabinindeki her taşınabilir modülün alt tarafını inceleyin.Dört bağlantı noktasında da küçük damlacıkların varlığını arayın. Herhangi bir taşınabilir modül damlacıkları göstermiyorsa, bu modüller üzerindeki asal döngüyü yeniden çalıştırın. Çıkış bağlantı noktalarında daha sık oluşan tepsiye damlayan ortamvarsa, tepsiyi %70 etanol ile temizleyin.Daha sonra, kanaldaki olası kabarcıkları gidermek için her çipin her iki kanalını da sıcak, eşit hücreye özgü kültür ortamıyla yıkayın ve her giriş ve çıkış bağlantı noktasının üstüne küçük ortam damlacıkları yerleştirin. Taşıyıcılarla yongaları taşınabilir modüllere yerleştirin ve her tepsiye altı ya kadar yerleştirin. Tepsileri kültür modülüne takın.Akış hızı ve esneme gibi uygun organ çipi kültür koşullarını kültür modülüüzerinde programla. Düzenleme döngüsü tamamlanır tamamlanmaz, yaklaşık iki saat sürer, programlanmış koşullar başlar. Bundan sonra, kültür modülü önceden ayarlanmış organ çipkültür koşullarında akış başlar.IPSC tabanlı kan-beyin bariyer çipimmünositokimya yedi gün post-tohumlama EZ küreler üst beyin yan kanal karışık bir nöral hücre popülasyonu içine farklılaşmış gösterir, S100 beta-pozitif astrositler de dahil olmak üzere, Nestin-pozitif nöral progenitor hücreleri, yanı sıra GFAP-pozitif astrositler, ve beta III tubulin-pozitif nöronlar. IPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücreleri alt kan yan kanal da tohumlu GLUT-1 ve PECAM-1 ifade. Kan-beyin bariyerçipi geçirgenliğinin değerlendirilmesi, iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücreleri ve EZ küreleri ile tohumlanan organ yongasının, sadece iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücreleri ile tohumlanmış organ yongalarına göre sıkı bir bariyere sahip olduğunu göstermektedir.Sadece EZ küreleri ile tohumlanmış organ yongaları herhangi bir bariyer özellikleri sergilemedi. Kanalın ilk yüzey işlemlerinden her gün orta anahtarlama ya da kanalda kabarcık oluşumunu önleyebilirsiniz. Yüzey aktivasyon reaktifi, hücre dışı matriks veya hücre içeren ortamın kanallar dan eklenmesi gereken protokoldeki adım boyunca, kabarcık bulunmadığını dikkatlice doğrulamak son derece önemlidir.Geçirgenlik tsureri aday ilaçların insan beyninin penetrite edilebilirliğini değerlendirmek için yapılabilir. Bu yaklaşım potansiyel terapötik test için hizmet verebilir. iPSC tabanlı BBB çipin uygulanması, BBB'nin çeşitli nörolojik hastalıklardaki rolünün incelenmesini sağlar.Gelecekte, bu tür bir platform tahmin, kişiselleştirilmiş tıp uygulamaları için yararlı olabilir.

generation-of-a-human-ipsc-based-blood-brain-barrier-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Bu video, iPSC'den türetilmiş öncü hücreleri kullanarak bir kan-beyin bariyeri çipi oluşturmayı gösteriyor. Nöral progenitör hücrelerin ve beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin gözenekli bir zar ile ayrı kanallarda tohumlanmasını içerir. Farklılaşma ortamını akıtarak, endotel hücreleri kan damarlarına benzeyen sıkı bağlantılar oluşturur ve nöral hücreler, çip üzerinde işlevsel bir kan-beyin bariyeri oluşturarak çeşitli beyin hücresi tiplerine olgunlaşır.

iPSC'den türetilmiş öncü hücreleri kullanarak bir kan-beyin bariyeri çipi oluşturma

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Yeniden programlanmış periferik kan hücrelerinden nöronal fenotip içeren hücreler elde etmek için genetiği değiştirilmiş (GM içermeyen) bir yöntem sunuyoruz. Yeni insan GPI bağlantılı proteine bağlı bir sinyal yolunun aktivasyonu, insan pluripotent kök hücrelerini elde etmek için verimli bir GM içermeyen yöntem ortaya koymaktadır.

Kan Türevi Nöronal Hücrelerin GM'den Arındırılmış Üretimi

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden farklılaşan genetik olarak eşleşen epitel ve vasküler endotel hücrelerini entegre ederek böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısını ve işlevini özetleyen kişiselleştirilmiş bir çip üzerinde organ sistemi tasarlamak için bir protokol sunulmaktadır. Bu biyomühendislik sistemi, böbrek hassas tıbbını ve ilgili uygulamaları ilerletebilir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

Bu rapor, kan-beyin bariyeri modellerinin oluşturulması için μSiM platformunda montaj, hücre kültürü ve tahliller için protokoller sağlar.

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Kan-beyin bariyeri (BBB), istikrarlı ve sağlıklı bir beyin ortamının sürdürülmesinde çok önemli bir role sahiptir. BBB disfonksiyonu birçok nörolojik hastalıkla ilişkilidir. Serebrovasküler patolojiyi, BBB bütünlüğünü ve BBB'nin genetik ve hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini araştırmak için BBB'nin 3 boyutlu, kök hücre türevli bir modelini geliştirdik.

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Bu çalışma, beyin iltihabının dolaylı olarak değerlendirilmesini sağlayan insan monosit türevli mikroglia benzeri (iMG) hücrelerin kurulması için yeni bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Bu, beynin potansiyel iltihabına ve ilişkili nöropsikiyatrik bozukluklara odaklanan araştırmalar için faydalı olabilecek bir hücresel model sunar.

Ters Translasyonel Beyin Araştırmaları için İnsan Kanı Kaynaklı Mikroglia Benzeri Hücrelerin Mühendisliği

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi hematopoietik progenitör hücreleri (HPC'ler) organoid gelişimine dahil ederek yerleşik mikroglialı bir insan beyni organoidi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

Keşfedin, iPSC'ler kullanılarak kişiselleştirilmiş kan-beyin bariyeri chip üretimini. Bu mikroakışkan teknoloji, santral sinir sistemi ilaç geçirgenliğini tahmin etmeye ve nörolojik hastalıkları incelemeye olanak tanır.

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

Daha fazla video keşfet