Nitel ve Nicel Histolojik Yöntemlerle Fare Embriyolarında Konjenital Kalp Defektlerinin Analizi

Bu protokol, konjenital kalp defektlerini de inceleyen diğer gruplar tarafından daha yaygın olarak kullanılabilmesi için yeni doku analizi tekniklerini standartlaştırarak, yeni doku analizi tekniklerini standartlaştırarak, yeni doku analiz tekniklerini standartlaştırabilir. Hem nitel hem de nicel analiz tekniklerinin artıları ve eksileri olduğundan, bu metodoloji hem en geniş deneysel soru yelpazesini ele almak için hem de kullanır. Bu teknikler kardiyoloji tanı yöntemleri üzerinde olumlu bir etkiye sahip olabilir.

Örneğin, patologlar biyopsi örneklerinden insan kalp hastalığı tanısı doğru mikroskobik kardiyak doku analizi teknikleri uygulayabilirsiniz. Bu protokol gelişimsel kardiyoloji veya genel kardiyoloji araştırmaları için kullanılabilir. Ancak, bu yöntemler de herhangi bir doku analizi doğru uygulanabilir çeşitli yararlı teknikler sağlar.

Embriyonik gün 15 ila 15,5 kalpleri toplamak için, hamile bir baraj ın uzuvları güvenli ve göğüs kadar üretra etrafında başlayan, dikkatle gövde boyunca bir I şeklinde kesi yapmak. Bir kepçe hareket forseps kullanarak, yavaşça karın boşluğundan rahim dışarı kaldırma karın boşluğundan çıkarma yardımcı olmak için ince forseps ile gerekli olarak rahim yüzeysel dokuları kavrayarak. Karın rahim serbest bırakmak için makas kullanın.

Buz gibi PBS rahim ıslatma sonra, bir diseksiyon çanak içine organ pin. Makas kullanarak, ayrı bir embriyo içeren ayrı bölümler halinde rahim kesti. İnce forceps iki çift kullanarak, yavaşça rahim dokusundan embriyolar soyma ve dört derece Santigrat PBS-EDTA içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin.

Kalpleri toplamak için, bir diseksiyon mikroskobu altında çanak yerleştirin ve supine konumuna embriyo konumlandırmak için ince forceps iki çift kullanın. Göğüs erişimini stabilize ettikten sonra, göbek köprücük kemiği arasında uzanan embriyo nun göğüs kemiği boyunca bir kesi yapmak için ikinci bir çift ince çillerin keskin noktasını kullanın. Yavaş yavaş göğüs boşluğunun içine doğru çalışırken çok ince ve yüzeysel kesiler yapma, embriyonun karın açın.

Kalp sadece görünür hale geldiğinde, kaburga ları soymak için göğüs kafesi biraz şımartılmış gövde sıkmak için forceps bir çift kullanın. Bir çift forceps'un kenarlarını kullanarak, dokuyu ayırmadan pulmoner kan damarlarını hafifçe tutun ve kalbi boşluktan çekin. 45-60 dakika boyunca 4% Paraformaldehit doku sabitleme önce taze PBS-EDTA 1-2 dakika için kalp temizleyin.

Daha sonra, glisin ile desteklenen PBS yıkama başına 5 ila 10 dakika için kalbi üç kez yıkayın. Kalpleri PBS'de dört santigrat derecede saklamadan önce. Kalbi kriyoditasyona hazırlamak için, örnekleri 24 ila 40 saat boyunca 4 derece santigrat derecede %30 sakaroz ve PBS tüpüne yerleştirin.

Kalpler tüpün dibine battığında, her kalbi bir parça tüysüz mendille dikkatlice aktarmak için değiştirilmiş uçlu bir Pasteur Pipet kullanın. Kısa bir hava kurutulma dan sonra, her numuneyi ayrı ayrı optimum kesme sıcaklığı kalıplarına, kesit için istenilen oryantasyonlarda yerleştirin. Kabarcıklar olmadan optimum kesme sıcaklığında dokuları batırın.

Daha sonra, kriyokesit ten önce en az 24 saat boyunca 80 santigrat derecede dokuları dondurma önce birkaç gün için 20 derece santigrat kadar kalıpları saklayın. Örneklerin kriyostat bölümlerini elde etmek için, kriyostat'ın fırlatıcısına ilgi doku bloğunu takmak için taze optimum sıcaklık kesme ortamını kullanın ve ortamın opak beyaz olana kadar donmasını bekleyin. Yeni bir bıçak takın ve bölümlerin elde edilmesine izin verecek şekilde doku bloğu ile bıçak arasındaki mesafeyi ayarlayın.

İlgi noktasına ulaşılına kadar bloğu 10 mikrometre dilimhalinde kırpın. Doku gözlemlenebildiği zaman, sürekli kesme hareketiyle dilimi standa doğru hafifçe çekmek için küçük düz bir fırça kullanın. Doku tamamen kesildikten sonra, parçayı sahneye doğru düz bir şekilde okşamak için detay fırçasını kullanın.

Ayrıntılı fırçayı çıkarıp dilimi bitirmeden önce bölümü yaklaşık 20 ila 30 saniye yerinde tutun. Herhangi bir yuvarlanmayı önleyen ve doku bölümünü sahneye karşı tutan dilimi kademeye karşı hafifçe düzleştirmek için her iki fırçayı da kullanın. 20 ila 30 saniye sonra, bölümü çevirin ve dilimin çekilebilecek kadar yakına elektrostatik yüklü bir slayt yerleştirmeden önce tekrar sahneye doğru düzleştirmek ve slayta dokunmak zorunda kalmadan slayta yapışın.

Ortak kalp kusurları varlığı için kalp dokusu bölümlerini değerlendirmek için, bir kamera ile donatılmış bir mikroskop kullanarak, 5 ila 10X ve 40X büyütme görüntüleri elde. Kardiyak kas sıkıştırma analizi için, uygun bir görüntü analizi yazılım programında ilgi bir doku açın ve 8-bit görüntü ayarlayın. Görüntünün eşiğini ayarlamak için Görüntü, Ayarla ve Eşik'i tıklatın ve yalnızca arka plan pikselleri seçilene kadar eşiği ayarlamak için üst çubuğu nu taşıyın.

Ardından, dokunun etrafına ilgi alanı çizmek için çokgen seçim aracını kullanın ve ardından Analiz Et, Ölçümleri, Alanı ve Eşiğe Sınırı'nı tıklatın. Negatif alanın alanını elde etmek için vurgulanan piksellerin alanını ölçmek için Çözümle ve Ölçü'ye tıklayın. Tüm ilgi alanının alanını ölçmek için Çözümle, Ölçümleri Ayarla'yı tıklatın ve eşiğe Sınır'ı seçin.

Ardından, seçilen ilgi alanının tüm alanını ölçmek için Analiz et ve Ölçü'ü seçin. Kas dokusu alanını hesaplamak için, Negatif Alan Alanını İlgi Bölgesi'nden çıkarın. Daha sonra kas sıkıştırma ve X.The hasat embriyonik kalplerden doku dilimleri boyama hesaplamak için İlgi Bölgesi tarafından kas dokusu alanı bölmek, doku kenarları yapmak için yeterli kontrast sağlar, ama hücre özellikleri ayırt edilemez hale getirmek için çok karanlık değildir.

Bu temsili analizde, deneysel olmayan koşullar altında gelişen embriyolara göre deneysel kalplerde kas sıkıştırmasının önemli ölçüde azaldığı gözlenmiştir. Bu örnekler değerlidir ve oluşturmak için uzun bir zaman gerektirir. Nekropsiler ve özellikle kriyostat kesitleri sırasında, yaptığınız her eylem hakkında kasıtlı olduğundan emin olun.

Paraformaldehit dokuların korunması, morfoloji değerlendirmesi sırasında bulunan patolojik nedenleri belirlemeye yardımcı aminofloresesin boyama gibi testler için kullanılmak üzere örnekler izin antijen aktivitesi korur. Laboratuarımızda, farklı tedavilerin numunelerimizi ne derece etkilediğini belirlememize yardımcı olabilecek deneysel tedavilerin nicel temsilini elde ettik. Paraformaldehit dokunduğu her dokuyu düzeltebilir.

Açıkta kalan cildi en aza indirmek için her zaman eldiven giymeye ve bu kimyasalla çalışırken film kaputunda çalışmaya özen.