Name: Fare Karaciğer Dokusunda Damarların Multifotoğraf Mikroskobik Gözlemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Keşfedin fare karaciğerindeki damar dinamiklerini çok fotonlu mikroskopi ile üç boyutlu görüntüleme yöntemini. Rhodamine B izotiyosiyanat-dextran boyama tekniği canlı dokularda yüksek çözünürlüklü vasküler analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81772133, 81902444), Guangdong Doğa Bilimleri Fonu (2020A1515010269, 2020A1515011367), Guangzhou Yurttaş Sağlık Bilim ve Teknoloji Araştırma Projesi (201803010034, 201903010072) ve Askeri Tıbbi İnovasyon Projesi (17CXZ008).

Tüm hayvan bakım ve prosedürleri, heath ve refah için Çin Nanfang Hastanesi politikalarına uygundu (uygulama No: NFYY-2019-73).
1. Fare hazırlığı
<ol><li>Fareyi uyuştur.<ol>
<li>Bir şırıngamda sodyum pentobarbital (50 mg/kg) hazırlayın.</li>
		<li>Fareyi (8 haftalık erkek C57BL/6) sol elle tutun, böylece karnı yukarı bakacak ve başı kuyruğundan daha düşük olacaktır. Karın derisini% 75 alkolle dezenfekte edin.</li>
		<li>Şırıngayı sağ elde tutarak, karın beyaz çizgisini iğne ile cildin sağ tarafına hafifçe 3-5 mm delin. Şırınga iğnesinin ve cildin 45° açıyla olduğundan emin olun, pentobarbital'ı yavaşça karın boşluğuna enjekte edin.  Tıraş olduktan sonra, farenin kesi bölgesinin etrafını% 75 alkol ve Klorheksidin çözeltisi ile dönüşümlü olarak 3 kez dezenfekte eder.</li>
		<li>Anestezinin sağ refleks eksikliği nedeniyle başarılı olup olmadığını kontrol edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaudal damara Rhodamine B izotiyosiyanat-dektran enjekte edin.<ol>
<li>Bir şırınna 100 μL 10 mg/mL Rhodamine B izotiyosiyanat-dektran hazırlayın.</li>
		<li>Farenin kuyruğunu% 75 alkolle silin.</li>
		<li>Kuyruğu sol elle tutun, şırıngayı damara paralel iğne ile sağ elinizde tutun ve 100 μL boyayı enjekte edin.</li>
		<li>Enjeksiyondan sonra pamuklu çubukla kanamayı durdurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Farenin karın kürkü steril su ile ıslatılmış gazlı bezle ıslatın ve farenin karnını bir jilet kullanarak tıraş edin, kürk yönünde vuruşlar yapın. Tıraş olduktan sonra, farenin kesi bölgesinin etrafını% 75 alkol ve Klorheksidin çözeltisi ile dönüşümlü olarak 3 kez dezenfekte eder.</li>
	<li>% 75 alkol içeren bir ısıtma yastığını sildikten sonra, ısıtma yastığını açın ve vücut sıcaklığını 37 ° C'de korumak için fareyi ısıtma yastığına sırt üzerine yerleştirin.</li>
</ol>2. Fare karaciğerini vücut organı görüntüleme çerçevesiyle sabitleme
NOT: Ticari organ görüntüleme çerçevesi henüz piyasaya sürülmemiştir.
<ol><li>Temiz bir vantuz sabit bir konuma yerleştirin.</li>
	<li>Bir organ görüntüleme fikstürü takın (Ek Şekil 1) ve ısıtma yastığını ve emme kabını% 75 alkolle silin.</li>
	<li>Emme kabını (5 mm çapında) vakum pompası hortumuna bağlayın ve vakum pompasını açın.</li>
	<li>% 75 alkol ile sterilize edilmiş steril bir masada, farenin kesi bölgesinin etrafını% 75 alkol ve Klorheksidin çözeltisi ile dönüşümlü olarak 3 kez dezenfekte eder, daha sonra% 75 alkol ve Klorheksidin çözeltisi ile farenin kesi bölgesinin etrafını 3 kez dezenfekte eder, ardından farenin alt sternal sınırından 2 cm deri kesmek ve karaciğeri ortaya çıkarmak için cerrahi makas kullanır.</li>
	<li>Fareyi tutucu tabanındaki ısıtma yastığı ile birlikte yerleştirin.</li>
	<li>Organ görüntüleme fikstürünü, emme kabı karaciğeri tutabilecek şekilde ayarlayın. Daha sonra emme için 30-35 kPa negatif basınç kullanın, böylece karaciğer emme kabına bağlanır(Ek Şekil 2).</li>
</ol>3. Multifotoğraf lazer tarama mikroskobu ayarlama
<ol><li>Çoktoğraf mikroskobu açın ve 60x/1.00 W hedefini seçin.</li>
	<li>Çerçeveyi ve fareyi objektif lensin altına sabitle.</li>
	<li>Emme kabının merkezi olan lensin tamamını kaplayabilen bir damla normal salin ekleyin ve objektif lensi normal saline dokunacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Lazer yazılımını açmak ve anahtarı açmak için bilgisayar simgesine çift tıklayın. Ardından güç düğmesini ve deklanşöre 3 sn basılı tutun.</li>
	<li>Dalga boylarını 800 nm olarak ayarlayın.</li>
	<li>Bilgisayarı kullanarak mikroskop işletim yazılımını başlatın.</li>
	<li>Edinme Ayarıiçin Lazer 800'ü ayarlayın.</li>
</ol>4. Multifotoğraf lazer tarama mikroskobu kullanılarak gözlem
<ol><li>Görüntü Alma Denetimiiçin Floresan anahtarını tıklatın.</li>
	<li>Oda ve ekipman ışıklarının kapalı olduğundan emin olun. Gürültü seviyelerini azaltmak için mikroskobu karanlık bir ortamda kullanın.</li>
	<li>Mikroskopta ışık yolu deklanşörini açın.</li>
	<li>Floresan filtresini dördüncü vitese döndürün ve optik anahtarın iki kolunu çekin.</li>
	<li>Göz merceğinden bakarak, odak uzaklığını ayarlamak için kaba ve ince odaklama kuasispirallerini kullanın ve hedef alanı bulmak için görüş alanını ayarlamak için X/Y eksenlerini kullanın.</li>
</ol>5. Multifotoğraf lazer tarama mikrografisi
<ol><li>Yazılımdaki floresan anahtarını kapatın, floresan filtreyi ikinci vitese geçirin (ikinci vites RXD1'dir) ve optik anahtarın iki kolunu itin.</li>
	<li>Hedef alanı önizlemek ve alım ayarını ve görüntü alma kontrol parametrelerini ayarlamak için Odak ×2'ye tıklayın (görüntü çözünürlüğü: 1024).</li>
	<li>Control + C tuşlarına basın ve yüksek voltajı, kazancı ve ofseti ayarlayın (gürültü seviyelerini azaltmak için).</li>
	<li>Önizlemeyi durdurmak için Durdur'a tıklayın, iki boyutta taramak için XY düğmesini tıklatın ve tamamlandıktan sonra kaydedin (Şekil 1).</li>
	<li>Bir bölge seçin, Derinlik'i tıklatın ve ardından Mikroskop ayarında bitiş kümesini ve başlangıç kümesini seçmek için Önizleme 'yi tıklatın (kan damarının gerekli kısmının tamamına bakın). 3D görüntüleri tarayın ve tamamlandıktan sonra kaydedin (Şekil 2).</li>
	<li>Bir bölge seçin, Zaman'a tıklayın ve diğer alım ayarını ve görüntü alma kontrol parametrelerini ayarlayın (Adım Boyutu: 1 μm; Dilimler: 10; Zaman Tarama Numarası: 40). Hareketli görüntüler elde etmek için farklı dilimleri tarayın ve tamamlandıktan sonra kaydedin (Video 1). NOT: Tarama sırasında birinin farelere bakması ve buna göre anestezi eklemesi gerekir.</li>
	<li>Fareyi boyun diseksiyonu ile kurban edin.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li>
<li>Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+mass-forming+cholangiocarcinoma+growing+in+a+giant+hepatic+hemangioma%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report.</a> Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410(2019).</li>
<li>Werkmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+for+blood+vessel+imaging%3A+new+non-invasive+tools+%28Spectral+SHG%2C+FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM).</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+optical+microangiography+provide+accurate+imaging+of+capillary+vessels%3F%3A+validation+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).</li>
<li>Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+vascular+imaging+techniques+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomed Research International. 2015, 783983(2015).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Vogt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+multiphoton+imaging+of+the+whole+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatic multiphoton imaging of the whole brain.</a> Nature Methods. 16 (6), 459(2019).</li>
<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+amyloid-%CE%B2+deposits+in+brains+of+living+mice+permits+direct+observation+of+clearance+of+plaques+with+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy.</a> Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).</li>
<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Deep-Brain+Structural+and+Hemodynamic+Multiphoton+Microscopy+Enabled+by+Quantum+Dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots.</a> Nano Letters. , (2019).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Shear, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peer+Reviewed%3A+Multiphoton-Excited+Fluorescence+in+Bioanalytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry.</a> Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+fully+human+anti-TEM1+scFv+in+models+of+solid+tumor+imaging+and+immunotoxin-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).</li>
<li>Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in biological research.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Belirli bir canlı dokuyu gözlemlemek, dokunun içindeki malzemenin değişikliklerini, lokalizasyonunu ve biyolojik etkilerini anlamanın etkili bir yoludur17. Bu deneyde, önemli adımlar karaciğeri solunum ve kalp atışlarına bağlı hareket eserleri sorununu çözebilen bir organ görüntüleme fikstürü ile sabitlemek ve gözlem için çoktoğraf mikroskobu kullanmaktır. Bu yöntem kullanılarak, karaciğer in vivo iç dokuları multifotoğraf mikroskop ile gözlenir ve kan damarları konumlarını ve üç boyutlu yapıların...

Kan damarları insan vücudunun çeşitli organ dokuları için besin sağlayabilir ve madde alışverişi yapabilir. Aynı zamanda, birçok sitokin, hormon, ilaç ve hücre de belirli yerlere damar nakli yoluyla çalışır. Karaciğer dokusundaki damar değişikliklerinin gözlemlenmesi, karaciğer dokusundaki kan akışının dağılımını ve maddelerin taşınmasını anlamaya yardımcı olabilir ve bazı damarla ilgili hastalıkların analizine yardımcı olabilir1,2.
Farelerde karaciğerin kan damarlarını gözlemlemenin birçok yolu vardır. Bunlar arasında optik mikroskopinin opak vasküler dokuyu gözlemlemede birçok sınırlaması vardır3. Multifotoğraf mikroskopisi, canlı karaciğerlerin kan damarlarını noninvaziv yüksek çözünürlüklü olarak görüntülemek için kullanılabilir4. Sadece kan damarlarının üç boyutlu görüntüleri elde etmekle kalmaz, aynı zamanda teknik, buradaki biyolojik etkileri gözlemlemek için dokuyu düzenlemeye yardımcı olmak için de kullanılabilir; ayrıca, bilgisayarlı tomografi ve manyetik rezonans görüntülemede olduğu gibi sadece mikrovesseller yerine tüm doku görüntülenebilir5.
Multifotoğraf mikroskopisi, derin canlı dokudaki dağınık floresan sinyallerini daha az fototoksikite ile etkili bir şekilde tespit etmek için kullanılabilir6. Bu nedenle, canlı dokunun aktivitesi sağlanabilir ve hasar miktarı azaltılabilir. Multifon mikroskopi, konfokal mikroskopiden daha iyi nüfuz gücüne sahiptir ve daha derin katmanların gözlenmesine izin verir7, benzersiz 3D görüntüleme sağlar. Multifotoğraf mikroskopisi artık kraniyal sinirlerin8 görüntülenmesinde sıklıkla kullanılmaktadır ve canlı farelerde nöronal dinamiklerin incelenmesine kadar genişletilmiştir9,10,11.
Bu deneyde fare kan damarlarının floresan etiketlenerek bir çerçeveye sabitlenmiş olması ve canlı karaciğer dokusundaki kan damarlarının dinamikleri multifotoğraf mikroskopisi kullanılarak görülebilir. Bu deney, belirli maddelerin nasıl işaretlenerek, doku içindeki bir konumu gözlemlemeye yardımcı olmak için multifotoğraf mikroskopisinin nasıl kullanılacağını, hücreler arası dokudaki hücresel olayları gözlemlemeyi, fotokimyasal ölçümlerin12 , 13,14ve canlı dokunun içindeki malzeme dinamiklerini gözlemlemeyi göstermektedir15. Örneğin, tümör endotel belirteci 1 (TEM1), birçok katı tümörde kan damarlarında ve stromada yukarı doğru sıralanmış, tek zincirli değişken parça (scFv) 78'i TEM1'e karşı işaretleyen yeni bir yüzey belirteci olarak tanımlanmıştır ve daha sonra fare hemanjiomunun yeri ve tümörlerin değerlendirilmesi için multifotoni mikroskopisi kullanılabilir16.

<table><tbody><tr><td>1 mL şırınga x 2</td><td>Hunan Pinan Tıbbi Cihazlar Teknolojisi</td><td>YA0551</td><td></td></tr><tr><td>5 W ısıtma yastığı</td><td>BiolinkOptics Teknolojisi</td><td>BL336</td><td></td></tr><tr><td>%75 mutlak etanol</td><td>Guangdong Guanghua Sci-Tech</td><td>1.17113.023</td><td></td></tr><tr><td>Emici pamuk topu</td><td>Sağlıklı Sanitasyon Krallığı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare cerrahi aleti</td><td>RWD Yaşam Bilimleri</td><td>SP0001-G</td><td>Makas ve cımbız dahil</td></tr><tr><td>Multifoton mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>Organ görüntüleme fikstürü</td><td>BiolinkOptics Teknolojisi</td><td>BL336</td><td>Vantuz, hortum, negatif basınç pompası ve braket dahil</td></tr><tr><td>Rhodamine B izotiyosiyanat&ndash; Dextran</td><td>Sigma</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş makinesi</td><td>Lei Wa</td><td>RE-3201</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum pentobarbital</td><td>Sigma</td><td>P3761-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

fare karaciğer dokusunda damarların multifotoğraf mikroskobik gözlemi

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

Fare karaciğer dokusunun intravasküler dinamiklerini gözlemlemek, fare karaciğerinin doku ile ilgili hastalıkları hakkında daha derinlemesine gözlemler ve çalışmalar yapmamızı sağlar. Bir fareye kan damarlarını lekeleyebilecek bir boya enjekte edilir. Fare karaciğerini in vivo olarak gözlemlemek için, bir çerçeveye maruz kalır ve sabitlenir. Karaciğer dokusundaki kan damarlarının iki ve üç boyutlu görüntüleri çoktoğraf mikroskop kullanılarak elde edilir. Seçilen yerlerdeki dokuların görüntüleri, uzun süreli değişiklikleri gözlemlemek için sürekli olarak elde edilir; karaciğer dokularındaki kan damarlarının dinamik değişimleri de gözlenir. Multifotoğraf mikroskopisi, derin doku bölümlerinde veya organlarda hücre ve hücre fonksiyonlarını gözlemlemek için kullanılan bir yöntemdir. Multifotoğraf mikroskopisi doku mikroyapısına duyarlıdır ve biyolojik dokuların yüksek mekansal çözünürlükte in vivo olarak görüntülenmesini sağlayarak kuruluşun biyokimyasal bilgilerini yakalama olanağı sağlar. Multifotoğraf mikroskopisi karaciğerin bir kısmını gözlemlemek için kullanılır, ancak görüntüyü daha kararlı hale getirmek için karaciğeri sabitlemek sorunludur. Bu deneyde, karaciğeri düzeltmek ve mikroskop altında karaciğerin daha istikrarlı bir görüntüsünü elde etmek için özel bir vakum emme kabı kullanılır. Ek olarak, bu yöntem, bu tür maddeleri boyalarla işaretleyerek karaciğerdeki belirli maddelerin dinamik değişikliklerini gözlemlemek için kullanılabilir.

Karaciğerdeki kan damarlarının dağılımı, multifotoğraf mikroskopisi kullanılarak elde edilen Şekil 1'degörülebilir. Kan damarı, bir gövdeden yayılan dalların çoğulluğuna ayrılır ve çevredeki alana dağıtılır. Kan damarının dış çevresi kırmızı, iç boşluğu karanlık ve içinde birçok şey var. Görüntü ne kadar netse, gözlem düzlemine o kadar yakın olur. Ayrıca etrafta bazı kırmızı lekeler vardır, muhtemelen boya diğer maddeleri lekelamak için çevredeki dokuya nüfuz ettiği için. Video 1</st...

Bu deneyde, kuyruk damarına kan damarlarını lekeleyebilen Rhodamine B izotiyosiyanat-dektran enjekte edilir. Karaciğer açığa çıktıktan ve sabitlendikten sonra multifotoğraf mikroskopisi kullanılarak canlı vücuttaki derin dokuyu gözlemlemek için karaciğerin belirli bir kısmı seçilebilir.

Fare Karaciğer Dokusunda Damarların Multifotoğraf Mikroskobik Gözlemi

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

Bu yöntem, karaciğerin dinamiklerinin evrimi boyunca fare karaciğeri içindeki kan damarlarının hareketlerini birden fazla boyutta görselleştirmemize yardımcı olabilir. Bu yöntemi kullanarak karaciğer içindeki kan damarlarının dinamiklerini üç boyutlu olarak görselleştirebiliriz. Damar boyası kullanımını gösterdik, ancak mikroskobik görselleştirmeden önce ilgi çekici maddenizle damar boyama işlemi yapabilirsiniz.Uyuşturulmış sekiz haftalık erkek C 57 siyah altı farede sağ refleks eksikliğini doğruladıktan sonra. Farenin kuyruğunu% 75 alkolle silin ve 30 kalibrelik bir iğne ile donatılmış bir mikrolitre şırınga kullanarak celaaudal kuyruk damarına 100 mikrolitre Rhodamine B Izotiyosiyanat-Dextran'da taze hazırlanmış Rhodamine B Izotiyosiyanat-Dextran mililitre başına 10 miligram enjekte edin. Tüm çözelti teslim edildiğinde, delinme bölgesine basınç uygulamak için pamuklu çubuk kullanın ve karın kürkünü ıslatmak için steril suyla ıslatılmış gazlı bez kullanın.Karnı tıraş etmek için bir jilet kullanın, kürk yönünde vuruşlar yapın ve fareyi 37 santigrat derecelik, alkolle dezenfekte edilmiş bir ısıtma yastığına yerleştirin. Fare karaciğerini bir vücut organı görüntüleme çerçevesiyle sabitlemek için, öncelikle sabit bir konuma beş milimetre çapında temiz bir emiş kabı yerleştirin ve ısıtma yastığını ve emme kabını% 75 alkolle silin. Emme kabını vakum pompası hortumuna bağlayın ve pompayı açın.% 75 alkol sterilize edilmiş bir masada, farenin alt sternal sınırından iki santimetre deri kesmek ve karaciğeri açığa çıkarmak için cerrahi makas kullanın. Fareyi ve ısıtma yastığını vücut çerçevesinin tutucu tabanına yerleştirin ve organ görüntüleme fikstürünü emme kabının karaciğeri tutabilmesi için ayarlayın. Daha sonra emme için 30 ila 35 kilopaskal negatif basınç kullanın, böylece karaciğer bardağa bağlanır.Multiphoton Lazer Tarama Mikroskobu'nun ayarını yapmak için Mikroskobu açın ve 60 X hedefini seçin. Çerçeveyi ve fareyi hedefin altına sabitleyin ve lensi kapatacak kadar büyük bardağa bir damla normal salin ekleyin. Objektifi, lens normal saline dokunup lazer yazılımını çalıştıracak şekilde ayarlayın.Lazeri açın ve güç düğmesini ve deklanşörü üç saniye basılı tutun. Ardından mikroskop işletim yazılımını başlatın ve lazeri 800 nanometreye ayarlayın. Görüntü alma denetimini ayarlamak için floresan anahtarı tıklatın ve oda ve ekipman ışıklarını kapatın.Mikroskopta ışık yolu deklanşörini açın ve floresan filtresini dördüncü vitese döndürün. Optik anahtarın iki kolunu çekin ve göz parçasından bakın, odak uzaklığı ayarlamak için parkuru ve ince odaklama yarı spirallerini kullanın. Ardından, hedef alanı bulmak üzere görüş alanını ayarlamak için X Y eksenlerini kullanın.Görüntüleme için, yazılımdaki floresan anahtarını kapatın ve floresan filtreyi ikinci vitese geçirin. Optik anahtarın iki kolunu itin ve hedef alanı önizlemek için odaklama sürelerini iki kez tıklayın, alma ayarlarını ve görüntü alma kontrol parametrelerini ayarlayın ve yüksek voltaj kazancını ve ofsetini ayarlamak için kontrol artı C tuşuna basın. Önizlemeyi durdurmak için Durdur'a tıklayın, iki boyutta taramak için X Y düğmesine tıklayın ve kaydet'e tıklayın.Mikroskop ayarlarında bitiş ve başlangıç kümelerini seçmek için bir bölge seçin ve derinlik ve önizlemeyi tıklatın. 3D görüntüleri tarayın ve kaydedin. Taradıktan sonra, bir bölge tıklama süresi seçin ve diğer edinme ayarlarını ve görüntü alma kontrollü parametreleri ayarlayın.Ardından farklı dilimleri tarayın ve elde edilen görüntü filmini elde etmek için kaydedin. Burada gösterildiği gibi multi foton mikroskopisi kullanılarak karaciğer içindeki kan damarlarının dağılımının görselleştirilmesi gözlenebilir. Bu kan damarı, bir gövdeden yayılan dalların çoğulluğuna ayrılır ve çevredeki alana dağıtılır.Kan damarının dış çevresi, iç boşluk karanlıkken kırmızı renkte gözlenebilir, videoda gözlemlendiği gibi damarlar içinde hareket eden kırmızı olmayan nesneler hücreler olabilir. Bu videoda gözlemlenen dokunun koyu olması muhtemelen karaciğerin zamanla iyi sabitlenmemesi nedeniyledir. Skarsız karaciğerin nasıl sabit olduğunu, görüntünün stabilitesini etkilediğini hatırlamak önemlidir.Bu metodoloji, dağılımın doğrudan gözlemlenmesi veya belirli işgücü yapılarındaki değişiklikler için karaciğer içindeki diğer yapıların konumuna da uygulanabilir.

multiphoton-microscopic-observation-of-vessels-in-mouse-liver-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bir optik sistem FITC-etiketli eritrosit ile karaciğer mikro görselleştirmek ve lazer yardımlı phosphorimetry ile kılcal oksijen kısmi basıncı ölçmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem, mikrovasküler yapısı, çapı, kan akış hızı, ve oksijen gerilimi analiz ederek fizyolojik ve patolojik mekanizmalar araştırılması için de kullanılabilir.

Akut Hepatit Model Uygulama: Görselleştirme ve Hepatik Mikrosirkülasyon Kan Akış ve Oksijen Tüketimi Analizi

Yakın kızılötesi floresans (NIRF) kullanarak en son geliştirilen görüntüleme teknikleri lenfatik sistem kanseri metastazı oynadığı rol, immün yanıt, yara onarımı ve diğer lenfatik ilişkili hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

Bu videoda, organın stabilizasyonunu takiben multifoton mikroskobu kullanarak bir fare karaciğer dokusunun intravasküler dinamiklerini gözlemlemek ve incelemek için bir görüntüleme prosedürü açıklanmaktadır. Multifoton mikroskobu, biyolojik dokunun in vivo olarak yüksek uzamsal çözünürlükte görüntülenmesini sağlar.

Multifoton Mikroskobu Tabanlı Vasküler Görselleştirme için Görüntüleme Fikstürü Destekli Fare Karaciğeri Evrelemesi: Fare Karaciğerinde Kan Damarlarının Çok Boyutlu Görüntülerini Elde Etmek İçin Stabilizasyon Cihazı Destekli Bir Görüntüleme Tekniği

Bu makale, görüntü elde etme ve analiz için özel bir metodoloji ile birlikte intravital mikroskopi görüntüleme kullanılarak fare karaciğer damar sisteminin tek tek kan damarları içindeki kan akış hızının dinamik ölçümü ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir yöntem hakkında ayrıntılı bir yöntem hakkında rapor vermektedir.

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Karaciğerdeki immün hücrelerin stabil intravital yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi zordur. Burada, yoğun bakım monitörizasyonu ile birlikte intravital multifoton lazer tarama mikroskobu ile fare karaciğerindeki bağışıklık hücrelerinin göçünü ve hücre-hücre etkileşimlerini uzun süreler boyunca (yaklaşık 6 saat) incelemek için oldukça hassas ve güvenilir bir yöntem sunuyoruz.

CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Bir roman cerrahi protokol İki fotonlu görüntüleme en az invaze olan canlı fare karaciğer için kurduk. Bu teknik ile karaciğer detaylı yapısını lipopolysaccharide kaynaklı endotoksemi sırasında tespit. Biz bu yöntemi hepatik lökosit göç için çeşitli reaktifler tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılması gereken tahmin.

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Burada, İzolektin B4'ün tek boyamasını kullanarak tüm farelerin akciğer dokusu için pulmoner mikrovasküler yoğunluğun tarafsız bir şekilde ölçülmesini sağlamak için basit ve ekonomik bir protokol açıklıyoruz.

Lobüller Boyunca Farelerde Pulmoner Mikrovasküler Yoğunluğun Ölçülmesi

Yüksek uzamsal çözünürlüğe (100 μm) ve duyarlılığa sahip ultra hızlı Doppler ultrason (UFUS), hepatik vaskülatür hakkında kapsamlı bir kalitatif genel bakış elde etmek için uygun bir noninvaziv görüntüleme modalitesini temsil eder. UFUS ayrıca vasküler hastalık mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı geliştirmeyi amaçlayan mikrovasküler sistemin kantitatif ölçümlerini de kolaylaştırır.

Ultrafast Doppler Ultrason Kullanılarak Farelerin Hepatik Vaskülatürünün Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Keşfedin fare karaciğerindeki damar dinamiklerini çok fotonlu mikroskopi ile üç boyutlu görüntüleme yöntemini. Rhodamine B izotiyosiyanat-dextran boyama tekniği canlı dokularda yüksek çözünürlüklü vasküler analiz sağlar.

Fare Karaciğer Dokusunda Damarların Multifotoğraf Mikroskobik Gözlemi

Daha fazla video keşfet