Name: Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristemin Mikromekanik Manipülasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis sürgün apikal meristeminde mikrotübül sitoiskeletinin canlı hücre görüntülemesi ve mikromekanik manipülasyon yöntemini. Bu protokol, bitki gelişiminde mekanik kuvvetlere yanıtı nicel olarak analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Bitki büyümesi
<ol><li>Ekek Arabidopsis tohumları toprakta yeşil floresan protein (MBD-GFP)10 ile erimiş mikrotübül bağlayıcı etki alanı ifade ve çimlenme için 1 hafta boyunca uzun gün (16 h gün / 8 saat gece), 20 °C/6 °C koşullarda tutmak.</li>
	<li>Çimlenme den sonra, sağlam bitkisel büyüme sağlamak için yeterli büyüme alanı ile yeni tencere için fide transferi. Bitkileri kısa bir gün (8 saat gün /16 saat gece), 20 °C/16 °C koşullarda 3-5 hafta bekletin.</li>
	<li>Uzun güne (16 saat gün /8 saat gece), 20 °C/16 °C koşullara aktarın ve bitkiler cıvata (2-3 hafta) kadar tutun. Çiçeklenme 2-5 cm uzunluğunda büyümeye izin verin.</li>
</ol>2. Orta hazırlık
<ol><li>Küçük Petri kaplarını (yaklaşık 5,5 cm genişliğinde, 1,5 cm derinliğinde) yaklaşık %2 agarose ile derinliğinin yarısına doldurarak diseksiyon tabaklarını hazırlayın. Diseksiyon tabakları da tek saat noktası görüntüleme için kullanılabilir.</li>
	<li>Büyüme ortamını hazırlayın.<ol>
<li>5 g miyo-inositol, 0,05 g nikotinik asit, 0,05 g piridoksin hidroklorür, 0,5 g tiamin hidroklorür ve 0,1 g glisin içeren 1.000 x vitamin stok çözeltisinin 50 mL'sini hazırlayın.</li>
		<li>1/2 Murashige ve Skoog ortamı, %1 sakaroz, %1,6 agar, 1x vitaminler, pH = 5,8'den oluşan büyüme ortamını hazırlayın. Otoklav ve soğumasını bekleyin.</li>
		<li>Steril, temiz bir tezgahta, menteşeli plastik kutuları (yaklaşık 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) 15 dakika boyunca %70 etanol içine daldırarak sterilize edin.</li>
		<li>Steril, temiz bir tezgahta, orta katlanılabilir sıcaklıkta olduğunda, 200 nM son konsantrasyonuna N6-benzyladenin ekleyin ve 1/1.000 PPM (bitki koruyucu karışımı) ve iyice karıştırın. Steril kutuları yaklaşık yarısına kadar derinliğini orta ile doldurun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SAM diseksiyon
<ol><li>Çiçeklenme kesin ve çıplak gözle görmek zor olana kadar peduncles tabanında çiçek soyma tarafından keskin büşre ile eski çiçek tomurcukları kaldırın.</li>
	<li>Forceps ile diseksiyon çanak agarose bir yarık oluşturun ve kalın agar içine çiçeklenme tabanı bitki. Bu SAM ortaya çıkarmak için genç çiçekler daha ince diseksiyon için iyi sağlam destek verir.</li>
	<li>Sam görünür olana kadar bir diseksiyon mikroskop altında genç aşamalarına ilerleyen ve sırayla ilerleyen en eski ve sırayla ile başlayan bütüller ile aşağı iterek kalan çiçek tomurcukları çıkarın. SAM genellikle 6-7. aşamaya kadar olan eski çiçekler çıkarıldığında ortaya çıkar. SAM maruz kaldığında, bir sonraki adıma hızlı bir şekilde hareket ederek numunenin susuzluktan kaçının.</li>
</ol>4. Kültürlü SAM'ların transferi ve büyümesi
<ol><li>Bölüm 1'de ayrıntılı olarak belirtildiği gibi taze olarak parçalanmış numuneyi, sam'in orta yüzeyin üzerinde açıkta olduğu dikdörtgen plastik menteşeli kültür kutusundaki büyüme ortamına yerleştirin. Kültür kutularının kenarlarına birkaç damla steril deiyonize su ekleyin ve kutunun içindeki nemi korumak için kapağı kapatın. Eklenen suyun SAM'i kapsamadığından emin olun.</li>
	<li>Kapağıkapatın ve mikropore bant ile kutuyu sarın. Büyüme kutusunu 22 °C'de uzun gün veya sürekli gün koşullarında yerleştirin ve SAM'in diseksiyon prosedüründen kurtulması ve kültür koşullarına uyum sağlaması için 12-24 saat büyüyün.</li>
</ol>5. SAM'in Görüntülenmesi
<ol><li>Örneği kapsayacak şekilde SAM içeren kültür kutusunu steril deiyonize suyla doldurun. Diseksiyon mikroskobualtında kontrol edin ve numuneye 1 mL pipetle güçlü bir şekilde püskürterek hava kabarcıklarını çıkarın.</li>
	<li>Kültür kutusunu dik bir konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin. Kültür kutusunun mikroskop hedeflerine temas etmediğine dikkat edin. Bir kapak camı olmadan görüntüleme için en uygun sayısal diyafram 0.8-1 uzun mesafe 40x veya 60x su daldırma lens kullanın.</li>
	<li>Amacı suya indirin ve hedefin ön merceği üzerinde oluşan hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Sahne yi düşürerek ve optik bir doku ile lensi hafifçe silerek ve suya yeniden daldırmadan önce pasteur pipetiyle hedefin ön merceğine az miktarda su ekleyerek kabarcıkları çıkarın.</li>
	<li>Confocal mikroskobun GFP filtresi ni ve epi-aydınlatma modülünü kullanarak, xy denetleyicisini numunenin yerini saptamak için ayarlayın. Oküler konumunu ayarlama, apex bulunana kadar Doğrudan ışık kaynağı nın altına SAM koymak ve Z ekseni boyunca odak. NOT: Doğrudan ultraviyole ışığa bakmayın.</li>
	<li>Örnek bulunduktan sonra, heyecan verici GFP (yani, 488 nm veya 496 nm lazer kaynağı) yeteneğine sahip bir lazer kullanarak aydınlatın. Mikroskobun optik yakınlaştırmasını tüm SAM ve sahne 1 çiçek primordia'sının görüş alanında olması için ayarlayın. Optimum sinyal-gürültü oranını sağlamak için lazer çıkışının gücünü ve kazanç ayarlarını daha da ayarlayın. NOT: Lazerin yüksek yoğunluğu numunenin fotoğraf beyazlatMa ile sonuçlanacaktır. Az ve aşırı pozlama paleti, bu ayarların daha iyi ayarını sağlamaya yardımcı olur.</li>
	<li>Numunenin 2-5 dk yerleşmesine izin verin. Yaklaşık 0,3 μm piksel boyutunda 0,25 μm-0,5 m Z dilim aralıklarında numunenin konfokal Z yığınlarını elde edin. Bir numune için Z yığınlarının elde edilmesi için gereken toplam görüntüleme süresinin, numunenin satın alma nın tamamlanmasına kadar suya daldırıldığı andan itibaren 10 dakikayı geçmediğinden emin olun.</li>
	<li>Hemen suyu çıkarın ve kültür kutusunu büyüme odasına geri aktarın. Numunelerin uzun süre su altında tutulması hücrelerin ozmotik durumunu etkileyecektir.</li>
</ol>6. SAM mikromekanik pertürbasyon
<ol><li>Bölüm 5'te açıklandığı gibi görüntüleme koşullarını ayarlayın ve kortikal mikrotübül organizasyonunun preablasyon görüntü yığınlarını edinin.</li>
	<li>Suyu kültür çanasında decant. Ablasyon'u temiz bir şırınga iğnesi (0,4 mm x 20 mm) ile gerçekleştirin.<ol>
<li>Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, iğneyi dikkatlice tutun ve yavaşça SAM'e yaklaşın. NOT: İğneyi rahat bir kavrama ile tutan ve tutan nefes titremeyi önlemeye yardımcı olur.</li>
		<li>Ablasyonun yapıldığını doğrulamak için iğne ucuyla SAM kubbesine kısaca başvurun. Tercihen sam, davranış görselleştirme ve kubbenin orta bölgesinde organize olmayan kortikal mikrotübüllerin geçiş sağlayan çevre üzerinde ablasyon gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür yemeğini steril deiyonize suyla doldurun ve propidium idodide (10 μg/mL) ekleyin. GFP kortikal mikrotübül sinyalini izlemenin yanı sıra, propidium iyodürünün ayrı bir kanal kullanılarak görselleştirilmesi, ablated hücrelerinin bölgelerini açıkça işaretleyebilir. Propidium iyodür 600-650 nm arasında kaydedilen emisyon ile 561 nm veya başka uygun lazer kullanılarak aydınlatılır.</li>
	<li>Ablasyondan hemen sonra görüntü yığınları edinin (bkz. bölüm 6) ve 6 saat boyunca her 2 saat edinme işlemini tekrarlayın. Her zaman noktasından sonra örnekle birlikte kültür yemeğini kuluçka odasına geri verin. Kültür medyasında biraz su kaldığından emin olun ve kurumasını önlemek için kültür çanalığını mikropore bantla sarın.</li>
</ol>7. Veri görselleştirme ve niceleme
<ol><li>MORPHOGRAPHX11,FIJI12veya makro SurfCut13gibi serbest çesitli yazılımlar kullanarak yüzey projeksiyonlari oluşturun.</li>
	<li>FIJI'de FibrilTool14 makrosu kullanarak kortikal mikrotübül aisotropi ekstraksiyonu gerçekleştirin. NOT: Yazılım kullanımına yönelik ayrıntılı protokoller ilgili alıntılardan elde edilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
<li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li>
<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mekanik sinyal transdüksiyon olaylarının değerlendirilmesi, mekano-algılama ve transdüksiyon yollarında yer alan moleküler düzenleyicileri belirlemek için çok önemlidir. Burada açıklanan protokol Arabidopsis SAM böyle bir süreç için bir okuma olarak kortikal mikrotübül yanıtı kullanarak bu tür olayların nicel bir görünüm sağlar. Burada açıklanan prosedür rutin çeşitli doku tipleri çeşitli çalışmalarda kullanılır16,17,18...

Bitki hücreleri, mekanik özelliklerini dinamik olarak değiştirebilen fiber takviyeli kompozit malzemeye mekanik olarak benzeyen polisakkaritler ve glikoproteinlerin hücre dışı bir matrisi ile çevrilidir1. Bitki hücrelerindeki büyüme, hücreiçine su alımı ile kaynaklanır, bu da hücre duvarında eşlik eden çekme kuvvetlerinin birikmesine neden olur. Bu tür kuvvetlere yanıt olarak, hücre duvarının fiziksel durumuna değişiklikler hücre genişlemesi için izin verir. Birincil duvarları olan hücreler, esas olarak içindeki polisakkaritlerin kimyasal bileşimindeki farklılıklar nedeniyle hücreleri içeren ikincil hücre duvarına göre hızlı büyüme yeteneğine sahiptir. Birincil duvar hücreleri glikoproteinlere ek olarak selüloz, hemiselüloz ve pektin oluşur, ve lignin eksikliği, ikincil hücre duvarı mevcut bir bileşeni2. Selüloz, β-1,4 bağları ile birbirine bağlı bir glikoz polimer, hücre duvarlarının ana bileşenidir. Hücre büyümesi sırasında yaşanan yüksek çekme kuvvetlerine dalabilen fibriller yapılar halinde organize edilir3. Çekme kuvvetlerine dayanmanın yanı sıra, tercihli yönde mekanik takviye selüloz mikrofibril net yönünü dik bir eksen boyunca turgor tahrikli genişleme ile sonuçlanır. Selüloz mikrofibrillerin organizasyonu kortikal mikrotübül sitoiskeletinden etkilenir, çünkü plazma zarında bulunan selüloz sentezleyici komplekslerin yön hareketini yönlendirirler4. Bu nedenle, bir floresan molekül ile erimiş bir mikrotübül ilişkili protein veya tubulin kullanarak kortikal mikrotübül organizasyonu izleme bitki hücrelerinde selüloz örten desenlerin gözlem için bir proxy olarak hizmet vermektedir.
Kortikal mikrotübül sitoiskeletinin desenlemi hücre ve doku morfolojisi kaynaklı mekanik kuvvetlerin kontrolü altındadır. Kortikal mikrotübül organizasyonu SAM'in tepesinde bulunan hücrelerde zaman içinde herhangi bir tercihli organizasyona sahip değildir, oysa SAM ve gelişmekte olan organ arasındaki çevre ve sınırdaki hücreler kortikalmikrotübüllerin kararlı, son derece organize suprasellüler dizilimine sahiptir 5 . Hücrelerin mekanik durumunu fiziksel olarak rahatsız etmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Ozmotik durum değişiklikleri, hücre duvarının sertliğini etkileyen farmakolojik ve enzimatik bileşikler ile tedavi hücre tarafından deneyimli çekme kuvvetlerinde sonraki değişikliklere neden olabilir6,7. Dokuların yaşadığı kompresif kuvvetlerde kademeli artışa olanak sağlayan mekanizmaların kullanımı başka bir alternatif8. Santrifüj kuvvetlerinin uygulanması da hücreleri ile herhangi bir fiziksel temas olmadan mekanik kuvvetleri etkilemek için gösterilmiştir9. Ancak, bir grup hücrede yön kuvvetlerini değiştirmenin en yaygın olarak kullanılan araçları, tüm epidermal hücrelerin gerilim altında olduğu ve hücrelerin fiziksel ablasyonunun yerel olarak turgor basıncını ortadan kaldıracağı ve hücreden hücreye yapışmasını bozacağı ve komşu hücrelerin yaşadığı çekme kuvvetlerini değiştireceği gerçeğinden yararlanır. Bu ya yüksek güçlü darbeli ultraviyole lazer hedefleyerek ya da ince bir iğne ile gerçekleştirilir.
Burada, SAM'de mekanik pertürbasyon için kortikal mikrotübül davranışının görüntülenmesi ve değerlendirilmesi süreci hakkında ayrıntılı bilgi ve regülasyon.

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. et al., Nat Yöntemleri. 2012</td></tr><tr><td>glisin</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. et al., Bitki Hücresi 1998</td></tr><tr><td>mikro gözenekli bant</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. et al., Yöntemler Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-benziladenin</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>nikotinik asit</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>plastik menteşeli kutu</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM (Bitki Koruyucu Karışımı)</td><td>Bitki Hücre Teknolojisi</td><td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>piridoksin hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>tiamin hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td></td> Serisi</tr></tbody></table>

mikrotübül sitoiskeletinin canlı hücre görüntülemesi ve arabidopsis shoot apikal meristem'in mikromekanik manipülasyonu

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Büyüme ve morfogenezin hücre ve doku düzeyinde ki düzenlenmesini anlamak uzun yıllardır biyolojik araştırmaların ön saflarında yer almaktadır. Moleküler ve görüntüleme teknolojilerinde ki gelişmeler, biyokimyasal sinyallerin morfogenetik olayları nasıl etkilediğine dair bilgi edinmemizi sağladı. Ancak, biyokimyasal sinyaller dışında, mekanik ipuçları da hücre ve doku büyüme çeşitli yönlerini etkilediği giderek daha belirgindir. Arabidopsis shoot apikal meristem (SAM), tüm yer üstü organlarının oluşumundan sorumlu kubbe şeklinde bir yapıdır. Bitki hücrelerinde apoplastik selüloz birikimine aracılık eden kortikal mikrotübül sitoiskeletinin organizasyonu mekansal olarak farklıdır. Selüloz bitki hücre duvarının en sert bileşeni olduğu için, kortikal mikrotübüllerin desenlerinin görselleştirilmesi ve kantitatif değerlendirilmesi SAM'deki hücrelerin biyofiziksel doğasını anlamak için gereklidir. Kortikal mikrotübül organizasyonunun basmakalıp formu da SAM'de var olan doku çapındaki fiziksel güçlerin bir sonucudur. Bu fiziksel güçlerin pertürbasyonu ve kortikal mikrotübül organizasyonunun daha sonra izlenmesi, mekano algısı ve transdüksiyona aracılık eden aday proteinlerin belirlenmesine olanak sağlar. Burada, bu tür işlemlerin araştırılmasına yardımcı olan bir protokol açıklıyoruz.

Şekil 1, kubbenin merkezinde dağınık kortikal mikrotübüller içeren hücrelerle MBD-GFP çizgilerinden elde edilen tipik projeksiyon görüntülerini ve çevredeki hücreler(Şekil 1A,B),sınır etki alanı hücrelerinde ise hücrenin uzun eksenine paralel olarak hizalanmış kortikal mikrotübüller içerir. Bu gözlemler, KORTİKAL mikrotübüllerin SAM'in farklı etki alanlarındaki mekansal dağılımında farklılıklar göstermektedir. Za...

Burada, ateş apikal meristem'deki kortikal mikrotübül sitoiskeletinin canlı hücre görüntülemesi ve fiziksel kuvvetlerdeki değişikliklere tepkisini izleme protokolünü anlatıyoruz.

Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Bu protokol, mikrotübüle Sitoiskelet davranışının bitkilerde nasıl oluştuğunu anlamamıza yardımcı olur. Aynı zamanda, hücre ve organ şeklini etkileyen bu yapısal bileşenlerin mekanik kuvvetlerdeki değişikliklere nasıl tepki verdiğini anlamamıza da yardımcı olur. Her ne kadar, bu yöntem çok az gelişmişlik gerektirir, sağlam, nicel okuma-sonra, farklı genotipler ve koşullar arasındaki mekanik yanıt farklılıkları sağlar.Bir hafta boyunca uzun gün koşullarında 20 ve 6 santigrat derece, toprakta yeşil floresan protein ile erimiş mikrotübül bağlayıcı etki gösteren arabidopsis tohumları büyüyen ile başlayın. Çimlenme den sonra, sağlam bitkisel büyüme sağlamak için yeterli büyüme alanı ile yeni tencere içine fide transfer ve kısa gün koşullarında 20 ve 16 derece santigrat bitkiler yerleştirin. Üç ila beş hafta sonra, bitkiler inişinceye kadar bitkileri aynı sıcaklıkta uzun gün koşullarına geri aktarın, çiçeklenmenin 2 ila 5 santimetre uzunluğunu aşmasını sağlar.Shoot Apikal Meristem diseksiyonu için, çiçeklenme koymak ve yaşlı çiçek tomurcukları kaldırmak için çıplak gözle peduncles görmek zor olana kadar, peduncles tabanında çiçek soymak için keskin forseps kullanın. Bir diseksiyon çanak içinde agros bir yarık oluşturmak için forceps kullanın ve kalın Augur içine çiçeklenme tabanı bitki. Bir kesme mikroskobu altında çanak yerleştirin.En eski çiçek tonucu ile başlayarak, bitki çiçek tomurcuk kaldırmak için forceps ile itin. Ateş apikal meristem genellikle sahne altı ila yedi kadar eski çiçekler kaldırıldığında maruz kalır. Ve çekim apikal meristem görünür olana kadar her çiçek tomurcuk aşağı itmek için forseps kullanın.En kısa sürede ateş apikal meristem maruz kalmaktadır, sadece orta yüzeyin üzerinde maruz ateş apikal meristem ile bir etanol sterilize dikdörtgen plastik menteşeli kültür kutusunda büyüme orta taze diseksiyon örnek sağlar. Kültür kutusunun kenarlarına birkaç damla steril deiyonize su ekleyin ve kutunun içindeki nemi korumak için kapağı kapatın. Mikropore bandı ile kutuyu sarın ve büyüme kutusunu 12 ila 24 saat boyunca 22 santigrat derecede uzun veya sürekli gün koşullarında yerleştirin.Bitki diseksiyon prosedüründen kurtulduğunda, numuneyi steril deiyonize suyla kaplayın ve diseksiyon mikroskobu altında hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Kültür kutusunu dik bir konfokal mikroskop aşamasına aktarın ve 40 veya 60X su daldırma lensini seçin. Suya amacı düşürün ve nesnenin ön lens üzerinde hava kabarcıkları kontrol edin.Kabarcıkları çıkarmak için, sahneyi düşürün ve optik bir doku ile merceği nazikçe silin. Daha sonra pasteur pipetini kullanarak objektifi suya yeniden batırmadan önce hedefin ön merceğine küçük bir hacim su ekleyin. Ardından, örneği bulmak için XY denetleyicisini ayarlamak için konfokal mikroskobun GFP filtresini ve epi-aydınlatma modülünü kullanın.Okülerin konumunu ayarlayın, ateş apikal meristem'i doğrudan ışık kaynağının altına yerleştirin ve apeks bulunana kadar Z ekseni boyunca odaklanın. Örneği aydınlatmak için heyecan verici GFP özelliğine sahip bir lazer kullanın ve mikroskobun optik zumuna uyum, böylece tüm çekim apikal meristem ve sahne bir çiçek primordia görüş alanında bulunmaktadır. Ardından, gürültü oranına en uygun sinyali almak için lazer çıkışının gücünü ve kazanç ayarlarını ayarlayın.Numunenin iki ila beş dakika yada yerleşmesine izin vererek, yaklaşık 0,3 mikro metre piksel boyutu çözünürlüğü ekleyerek, numunenin 0,25 ila 0,5 mikrometre Z dilim aralıklarında konfokal Z yığınlarını elde edin. Satın alma sonunda, hemen su kaldırmak ve büyüme odasına geri kültür kutusu aktarın. Mikromekanik Shoot Apikal Meristem Perturbation için, kortikal mikrotübül organizasyonunun ablasyon öncesi görüntü yığınlarını az önce gösterildiği gibi edinin ve kültür kutusundan suyu bir kültür yemeğine dönüştürün.Bir diseksiyon mikroskobu altında ateş apikal meristem aktarın ve yavaş yavaş temiz bir 0.4 tarafından 20 milimetre şırınga iğne ile ateş apikal meristem yaklaştı. Ablasyonun tamamlandığını doğrulamak için çekim apical meristem'in kubbesinin çevresine iğne ucu ile kısaca başvurun. Ve steril deiyonize su ile kültür çanak doldurun.Sonra çanak propidium iyodür mililitre başına 10 mikrogram ekleyin ve hemen altı saat boyunca her iki saatte bir gösterildiği gibi görüntü yığınları elde, her zaman noktası arasında kuluçka için kültür çanak dönen. Veri analizi için, uygun bir görüntü analizi yazılım programı kullanarak görüntü yığınlarının yüzey projeksiyonlarını oluşturun ve Fiji'deki Fibril Tool Macro'yu kullanarak kortikal mikrotübül anizotropisinin çıkarılmasını gerçekleştirin. Burada, dağınık kortikal mikrotübüller içeren kubbenin merkezindeki hücrelerle mikrotübül bağlama etki alanı GFP çizgileri, çevredeki hücreler, hücrenin uzun eksenine paralel hizalanmış kortikal mikrotübüller içeren çevresel dağılım ve sınır etki alanı hücreleri ile elde edilen tipik projeksiyon görüntüleri gözlemlenebilir.Hızlandırılmış görüntüleme, kortikal mikrotübül hizalamanın çok düzensiz bir diziden ablasyondan sonraki altı saat içinde daha organize bir diziye değiştiğini gösteriyor. Tensörler kortikal mikrotübül görüntüleriüzerine üst üste bindirilebilir ve çıkarılan bilgiler zaman içinde ortalama anizotropi çizilerek temsil edilebilir. Lazer çıkış gücü ve kazanç ayarlarını ayarlarken, filamentlerin net bir şekilde gözlemlendiğinden emin olmalı ve aşırı maruz kalmaktan kaçınmaya çalışmalıyız, çünkü doymuş sinyaller insaedilen sinyaller daha sonraki analizlerde çekme yönünü saptırabilir.Atomik kuvvet mikroskobu da mekanik kuvvetlerdeki değişikliklerin hücre duvarının fiziksel durumunu nasıl etkilediğini değerlendirmek için de yapılabilir.

live-cell-imaging-microtubule-cytoskeleton-micromechanical

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Bu makalede, ana kök ve kök tüyleri tek bir optik uçağı için confines bir iki katlı mikrosıvısal platformda Arabidopsis thaliana fidan kültür gösterilmiştir. Bu platform iyi kök morfolojisi de yüksek çözünürlüklü görüntüleme gelince gerçek zamanlı optik görüntüleme için başka araçlar tarafından kullanılabilir.

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Floresan canlı görüntüleme Arabidopsis thaliana yaprakların uzun bir zaman aralığı içinde gerçekleştirmek için basit ve çok yönlü bir yöntemi bildirin. Biz bir transgenik Arabidopsis bitki bitki bağışıklık yanıtı kronolojik zamanmekansal anlayış kazanıyor için bir örnek olarak bir bağışıklık ile ilgili düzenleyici denetimi altındaki bir floresan muhabir gen ifade kullanın.

Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

Bu protokolü nasıl görüntü yaşamak ve sürgün apikal sürgen confocal mikroskobu tarama lazer kullanarak farklı bitki türü üzerinden analiz sunuyor.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

Burada, biz üretimi tarif ve transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi uygulama etkinleştirme indüklenebilir, doku özel ifade üç ana sürgen, sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium satırları.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Burada, Arabidopsis thaliana'da polen tüpü rehberliğini ve alımını gözlemlemek için ovüllerin alıcılığını artıran yarı in vitro (SIV) yöntemin geliştirilmesini açıklıyoruz. Yüksek verimli SIV cum septum yöntemi, dinamik döllenme sürecini izlemek için gametofit işaretleyici çizgileri ve genetik olarak kodlanmış biyosensörlerle birleştirilebilir.

Arabidopsis Polen Tüpü Alımı ve Çift Döllenmenin Semi-In Vitro Cum Septum Yöntemi Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Mayoz fazı sırasında kromozom hareketi, spor oluşumu için temel olan, yeterince anlaşılmamış bir olgudur. Bu protokol, Arabidopsis thaliana erkek mayositlerinde mayotik faz sırasında sentromer hareketlerini elde etmek, analiz etmek ve ölçmek için bir yöntemi açıklar.

Arabidopsis thaliana'da Erkek Mayoz Fazı Sırasında Sentromer Hareketlerinin Canlı Görüntüleme Karakterizasyonu

Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.

Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Öğrenin, Arabidopsis sürgün apikal meristeminde mikrotübül sitoiskeletinin canlı hücre görüntülemesi ve mikromekanik manipülasyon yöntemini. Bu protokol, bitki gelişiminde mekanik kuvvetlere yanıtı nicel olarak analiz etmeyi sağlar.

Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Daha fazla video keşfet