Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Bu protokol, mikrotübüle Sitoiskelet davranışının bitkilerde nasıl oluştuğunu anlamamıza yardımcı olur. Aynı zamanda, hücre ve organ şeklini etkileyen bu yapısal bileşenlerin mekanik kuvvetlerdeki değişikliklere nasıl tepki verdiğini anlamamıza da yardımcı olur. Her ne kadar, bu yöntem çok az gelişmişlik gerektirir, sağlam, nicel okuma-sonra, farklı genotipler ve koşullar arasındaki mekanik yanıt farklılıkları sağlar.

Bir hafta boyunca uzun gün koşullarında 20 ve 6 santigrat derece, toprakta yeşil floresan protein ile erimiş mikrotübül bağlayıcı etki gösteren arabidopsis tohumları büyüyen ile başlayın. Çimlenme den sonra, sağlam bitkisel büyüme sağlamak için yeterli büyüme alanı ile yeni tencere içine fide transfer ve kısa gün koşullarında 20 ve 16 derece santigrat bitkiler yerleştirin. Üç ila beş hafta sonra, bitkiler inişinceye kadar bitkileri aynı sıcaklıkta uzun gün koşullarına geri aktarın, çiçeklenmenin 2 ila 5 santimetre uzunluğunu aşmasını sağlar.

Shoot Apikal Meristem diseksiyonu için, çiçeklenme koymak ve yaşlı çiçek tomurcukları kaldırmak için çıplak gözle peduncles görmek zor olana kadar, peduncles tabanında çiçek soymak için keskin forseps kullanın. Bir diseksiyon çanak içinde agros bir yarık oluşturmak için forceps kullanın ve kalın Augur içine çiçeklenme tabanı bitki. Bir kesme mikroskobu altında çanak yerleştirin.

En eski çiçek tonucu ile başlayarak, bitki çiçek tomurcuk kaldırmak için forceps ile itin. Ateş apikal meristem genellikle sahne altı ila yedi kadar eski çiçekler kaldırıldığında maruz kalır. Ve çekim apikal meristem görünür olana kadar her çiçek tomurcuk aşağı itmek için forseps kullanın.

En kısa sürede ateş apikal meristem maruz kalmaktadır, sadece orta yüzeyin üzerinde maruz ateş apikal meristem ile bir etanol sterilize dikdörtgen plastik menteşeli kültür kutusunda büyüme orta taze diseksiyon örnek sağlar. Kültür kutusunun kenarlarına birkaç damla steril deiyonize su ekleyin ve kutunun içindeki nemi korumak için kapağı kapatın. Mikropore bandı ile kutuyu sarın ve büyüme kutusunu 12 ila 24 saat boyunca 22 santigrat derecede uzun veya sürekli gün koşullarında yerleştirin.

Bitki diseksiyon prosedüründen kurtulduğunda, numuneyi steril deiyonize suyla kaplayın ve diseksiyon mikroskobu altında hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Kültür kutusunu dik bir konfokal mikroskop aşamasına aktarın ve 40 veya 60X su daldırma lensini seçin. Suya amacı düşürün ve nesnenin ön lens üzerinde hava kabarcıkları kontrol edin.

Kabarcıkları çıkarmak için, sahneyi düşürün ve optik bir doku ile merceği nazikçe silin. Daha sonra pasteur pipetini kullanarak objektifi suya yeniden batırmadan önce hedefin ön merceğine küçük bir hacim su ekleyin. Ardından, örneği bulmak için XY denetleyicisini ayarlamak için konfokal mikroskobun GFP filtresini ve epi-aydınlatma modülünü kullanın.

Okülerin konumunu ayarlayın, ateş apikal meristem'i doğrudan ışık kaynağının altına yerleştirin ve apeks bulunana kadar Z ekseni boyunca odaklanın. Örneği aydınlatmak için heyecan verici GFP özelliğine sahip bir lazer kullanın ve mikroskobun optik zumuna uyum, böylece tüm çekim apikal meristem ve sahne bir çiçek primordia görüş alanında bulunmaktadır. Ardından, gürültü oranına en uygun sinyali almak için lazer çıkışının gücünü ve kazanç ayarlarını ayarlayın.

Numunenin iki ila beş dakika yada yerleşmesine izin vererek, yaklaşık 0,3 mikro metre piksel boyutu çözünürlüğü ekleyerek, numunenin 0,25 ila 0,5 mikrometre Z dilim aralıklarında konfokal Z yığınlarını elde edin. Satın alma sonunda, hemen su kaldırmak ve büyüme odasına geri kültür kutusu aktarın. Mikromekanik Shoot Apikal Meristem Perturbation için, kortikal mikrotübül organizasyonunun ablasyon öncesi görüntü yığınlarını az önce gösterildiği gibi edinin ve kültür kutusundan suyu bir kültür yemeğine dönüştürün.

Bir diseksiyon mikroskobu altında ateş apikal meristem aktarın ve yavaş yavaş temiz bir 0.4 tarafından 20 milimetre şırınga iğne ile ateş apikal meristem yaklaştı. Ablasyonun tamamlandığını doğrulamak için çekim apical meristem'in kubbesinin çevresine iğne ucu ile kısaca başvurun. Ve steril deiyonize su ile kültür çanak doldurun.

Sonra çanak propidium iyodür mililitre başına 10 mikrogram ekleyin ve hemen altı saat boyunca her iki saatte bir gösterildiği gibi görüntü yığınları elde, her zaman noktası arasında kuluçka için kültür çanak dönen. Veri analizi için, uygun bir görüntü analizi yazılım programı kullanarak görüntü yığınlarının yüzey projeksiyonlarını oluşturun ve Fiji'deki Fibril Tool Macro'yu kullanarak kortikal mikrotübül anizotropisinin çıkarılmasını gerçekleştirin. Burada, dağınık kortikal mikrotübüller içeren kubbenin merkezindeki hücrelerle mikrotübül bağlama etki alanı GFP çizgileri, çevredeki hücreler, hücrenin uzun eksenine paralel hizalanmış kortikal mikrotübüller içeren çevresel dağılım ve sınır etki alanı hücreleri ile elde edilen tipik projeksiyon görüntüleri gözlemlenebilir.

Hızlandırılmış görüntüleme, kortikal mikrotübül hizalamanın çok düzensiz bir diziden ablasyondan sonraki altı saat içinde daha organize bir diziye değiştiğini gösteriyor. Tensörler kortikal mikrotübül görüntüleriüzerine üst üste bindirilebilir ve çıkarılan bilgiler zaman içinde ortalama anizotropi çizilerek temsil edilebilir. Lazer çıkış gücü ve kazanç ayarlarını ayarlarken, filamentlerin net bir şekilde gözlemlendiğinden emin olmalı ve aşırı maruz kalmaktan kaçınmaya çalışmalıyız, çünkü doymuş sinyaller insaedilen sinyaller daha sonraki analizlerde çekme yönünü saptırabilir.

Atomik kuvvet mikroskobu da mekanik kuvvetlerdeki değişikliklerin hücre duvarının fiziksel durumunu nasıl etkilediğini değerlendirmek için de yapılabilir.