İmmünsitokimya ve Ploidi Analizi için Sabit Kalplerden Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Bu protokol, herhangi bir kardiyak dokudan çubuk şeklindekardiyomiyositlerin izole edilmesi için bir yöntem sağlar, bu yöntem daha sonra manuel analiz olmadan bu kardiyomiyositlerin ploidi ve nükleasyon durumunu ölçmek için kullanılabilir. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, protokolümüz daha tutarlı hücre verimleri ve hücre morfolojisi sağlar ve akış sitometrisinin aksine, kardiyomiyositlerin nükleasyon unu ve ploidi durumunu görsel olarak doğrulayabiliyoruz. Kalp dokusu bölünmesi ve ilişkisi takdir etmek daha kolay olduğu için bu yöntemin görsel gösteri önemlidir.

Ötenazili fareyi bir supine pozisyonuna yerleştirerek ve uzatılmış uzuvları aşağı iterek başlayın. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs ten kesmek için künt başlı makas kullanın. Sonra alçalan aort ve inferial vena kava kesti.

Sol ventrikül yoluyla potasyum klorür PBS çözeltisi üç mililitre enjekte ederek kalp perfüzyon için bir 23 gauge kelebek iğne ile bir infüzyon seti bağlı bir peristaltik pompa kullanın. Septumu delmemeye devam edin. Daha sonra dakikada bir mililitre hızında 10 dakika boyunca %4 PFA çözeltisi enjekte edin.

Tüm kalbi çıkarmak için makas kullanın. Ve istenirse, belirli bir bölgeyi izole edin. Bir mililitre %4 PFA çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne dokuyu yerleştirin.

Bir saat boyunca bir rocker üzerinde kuluçkaya yatırın. Kalbi PBS çözeltisi ile petri kabına yerleştirin. Ventriküllerde kalan pfa'dan kurtulmak için sıkın ve PBS'de yıkayın.

Yeni bir 1.5 mililitrelik tüp kolaj çözeltisi içeren sabit kalp koyun. Sonra bir gecede 37 derecede bir rockçının kalbini kuluçkaya yatır. Ertesi gün, kolaj çözeltisi içeren 35 milimetrelik Petri kabına kalbi koyun ve forseps veya makasile bir milimetrelik parçalara ayırın.

Daha sonra iki dakika için ayrık doku triturate için bir transfer pipet kullanın. Doku parçacıkları hala kalırsa, daha dar bir ucu olan bir pipet kullanın ve dokunun çoğunluğu parçalanınana kadar triturasyona devam edin. 15 milimetrelik bir santimetrelik bir tüpün üzerine 200 ila 600 mikrometrelik naylon örgü yerleştirin.

Ayrıştırılan hücrelere beş mililitre PBS ekleyin ve naylon kafesten filtreleyin. Naylon örgüsü dört mililitre PBS geçirerek yıkayın. Daha sonra filtrelenmiş çözeltiyi 10 ila 100 kez G'de bir dakika santrifüj edin.

Supernatant atın ve boyama önce PBS 10 mililitre pelet resuspend. Görüntü J'nin Fiji dağıtımını indirdikten sonra Fiji'yi açın ve yardıma tıklayın, güncelleme sitelerini güncelleyin ve yönetin. Biomed grubunu ve IFPB eklentilerini kontrol edin.

Bağımlılıklar eklentileri indirmek için, elips split ve morpho lib J.Then'i tıklatın ve değişiklikleri uygulayın. Sonra, RStudio indirin ve açın. Metin el yazmasından kodu RConsole'un komut satırına kopyalayın ve enter tuşuna basın.

sonra tüm bağımlılıklarımızı yüklemek için tüm istemlere yanıt olarak Y yazın. Görüntü nicelemi gerçekleştirmek için Fiji'yi açın ve analiznucleasyonu sürükleyin. durum çubuğuna py.

Komut dosyası düzenleme penceresi açıldığında, sol alt köşede çalıştır'ı tıklatın. Çıktı veri dizininin konumunu soran bir iletişim kutusu açılır. Yazılım tarafından kullanılan tüm analiz verilerinin, şekillerin ve diğer verilerin depolandığı klasörü seçin.

Analiz parametrelerinde, analiz edilecek görüntülerin konumunu seçin ve normal ifadeleri kullanarak görüntü dosyası adı biçimini girin. İstenilen ayarları seçtikten sonra Tamam'ı tıklatın. Analiz ardışık noktanın farklı aşamalarından görüntüler ekranda göründüğünden, eşik ve segmentasyonun düzgün bir şekilde gerçekleştiğinden emin olmak için bunları inceleyin. Açık analizmultinucleatedserver.

Rstudio içinde r. Ardından, son adımda seçilen çıktı veri klasörüne son eğik çizgi olmadan dosya yolunu adlandırılmış klasör adına yazın. Komut dosyası düzenleme penceresinin sol üst köşesindeki çalıştır uygulamasını tıklatın.

Minimum geçerli nükleer ortalama yoğunluk eşiği, minimum geçerli nükleer alan eşiği ve kardiyomiyositler için maksimum geçerli minimum gelincik çapı için eşikleri ayarlamak için kaydırıcıları kullanın. Aşağı kaydırın ve seçili eşikleri uygulayın sonra çizim yoğunluğu dağılımını tıklatın, bu da tüm numunenin çekirdek yoğunluğu dağılımının bir çiziminin yanı sıra her gruplandırma değişkeni için ayrı alt çizimleri işleyecek. Örnek içi varyasyonu hesaba katmak için aşağı kaydırın ve gruba göre ayrı ayrı normale döndürün ve ploidi hesapla'yı tıklatın ve tahmini ploidi dağılımını çizin.

Normalleştirilmiş tüm örnek grafiği göründükten sonra, iki tepe deseninin görünür olması gerekir. Diploid ve tetraploid zirveleri birbirinden ve aykırılardan ayırmak için kaydırıcıları kullanın ve eşikleri seçin. Sonra aşağı kaydırın ve ploidy ve çekirdekleşme hesaplamak tıklayın.

Son olarak, düğme çizimini tıklatın ve sonuçlar klasörüne kaydedin. Bu yöntem hücreleri kirletmeden nispeten saf olan tekil kardiyomiyositleri izole etmek için kullanılabilir. Uygulanması kolaydır ve farklı izolasyonlardan tutarlı kardiyomiyosit verimi ve kalite sağlar.

Bu protokol ile izole edilen kardiyomiyositler antikorlar ve florokrom konjuge azideler kullanılarak boyanabilir. Sarcomeres karakteristik Z çizgi boyama deseni göstermek için, hücreler alfa aktin tanıyan antikorlar ile boyandı. Ayrı bir deneyde, EdU sabit kardiyomiyositleri yalıtmadan önce farelere uygulandı.

İzolasyon dan sonra S-fazı geçiren mononükleli, binükleli ve trinükleatlı kardiyomiyositler saptandı. Tek tek çekirdekleri tanımlamak için, orijinal DNA lekeli görüntü yoğunluğuna göre eşikli oldu. Elipsler nükleer maskelere uygundu, tek tek çekirdekleri segmente ediyorlardı.

Daha sonra, görüntünün pikselleri en proksimal oldukları elipse dayalı bölgelere bölündü ve bu bölgelerin sınırları nükleer kümeler aracılığıyla çizgiler çizmek için kullanıldı. Benzer bir segmentasyon işlemi kardiyomiyositleri saptamak için kullanıldı. Bu segmentasyon stratejisi, yeni doğan farelerden gelen kardiyomiyositlerin çoğunun mononükleoz olduğunu göstermiştir.

Mononükleli kardiyomiyositlerin sıklığı iki haftalık farelerde çok daha düşüktür ve toplam kardiyomiyosit popülasyonunun yaklaşık %25'ini oluşturmaktadırlar. Kardiyomiyositler içindeki tek tek çekirdeklerin ploidi durumu ölçüldüğünde, genç farelerde tetraploid çekirdeklerin daha yüksek bir sıklığı saptandı. Kardiyomiyositleri izole ederken, tüm hücre kümelerinin triturasyonlarından ayrıldığını doğrulamak önemlidir.