Name: Greft Kalite Değerlendirmesi için Kimyasal Biyopsi Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: Keşfedin böbrek greft kalite değerlendirmesi için kimyasal biyopsi yöntemini. SPME probu ile metabolomik ve lipidomik analizler yaparak düşük invaziv izleme sağlayan bu protokol, organ nakli öncesi hızlı tanı koymayı mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, Ulusal Bilim Merkezi'nden Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar MilliporeSigma, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya SPME cihazları sağlamak için bir iş kabul etmek istiyorum. Merck'in yaşam bilimi işi ABD ve Kanada'da MilliporeSigma olarak faaliyet göstermektedir. Ayrıca, yazarlar Q-Exactive Focus orbitrap kütle spektrometresi erişim için Thermo Fisher Bilimsel teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Dr Aleksandra Woderska-Jasińska ve Transplantoloji ve Bydgoszcz Genel Cerrahi Bölümü personeli projede kendi tür yardım için teşekkür etmek istiyorum. BB, Waterloo Üniversitesi'nde kaldığı süre boyunca Toronto General Hospital'da numune toplama fırsatı verdiği için Prof. Janusz Pawliszyn'e teşekkür etmek istiyor.

Tüm hayvanlar, Ulusal Tıbbi Araştırma Derneği tarafından formüle edilen ''Laboratuvar Hayvan Bakımı İlkeleri'' ve Kanada'daki Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından yayınlanan ''Laboratuvar HayvanlarıNın Bakımı Kılavuzu'' uyarınca insancıl bakım almıştır. Toronto Genel Araştırma Enstitüsü Hayvan Bakım Komitesi tüm çalışmaları onayladı. Araştırma insan denekler torun Bydgoszcz Nicolaus Copernicus Üniversitesi'nde Collegium Medicum Biyoetik Komitesi tarafından onaylandı dahil.
NOT: Uygun etik kurullardan onay alın. Her zaman güvenlik eldiveni giymeyi unutmayın. SPME problarının çıkarma aşamasına dokunmayın. Lipidomik analizler için devre dışı cam şişelerin kullanılması önerilir.
1. Probların hazırlanması
<ol><li>7 mm karışım modu sorbent ile kaplanmış titanyum-nikel alaşım probları (40 mm uzunluk; 0,2 mm çapında) hazırlayın. Probların sayısı, tüm yordam sırasında hedeflenen zaman noktalarına ve çoğaltma sayısına bağlıdır (zaman başına 3 önerilir). NOT: Çıkarma aşamasının uzunluğu ve türü çalışma şekline, metabolitlerin polaritesine ve örnek matrisine göre ayarlanabilir.</li>
	<li>2:1 kloroform:metanol (v/v) oluşan bir temizlik karışımı hazırlayın. Her 2,0 mL cam şişeye çözeltinin 1,0 mL'lik pipet'i ve her şişeye daha önce kapağı delmiş bir probu yerleştirin. NOT: Kullanmadan önce, kontamine partikülleri temizlemek için tüm probları temizleyin.</li>
	<li>Şişeleri ajitatöre koy ve ajitasyon hızını 1200 rpm olarak ayarla. 45 dakika sonra cihazı durdurun ve kaplamaları LC-MS sınıfı suyla durulayın.</li>
	<li>Kaplamalar onları etkinleştirmek için bir ön koşullandırma adımı geçmesi gerekir gibi, 1:1 metanol oluşan bir önkoşullandırma karışımı hazırlamak: su (v / v). Her 2,0 mL cam şişeye çözeltinin 1,0 mL'lik pipet'i ve her şişeye daha önce kapağı delmiş bir probu yerleştirin.</li>
	<li>Şişeleri girdap ajitatöre koyun ve ajitasyon hızını 1200 rpm olarak ayarlayın.</li>
	<li>60 dakika sonra ajitörü durdurun ve kaplamaları LC-MS sınıfı suyla durulayın.</li>
	<li>Probları standart cerrahi ekipman sterilizasyon protokolüne göre sterilize edin.</li>
</ol>2. Çıkarma
<ol><li>Steril bir ortam sağlamak için örneklemeden hemen önce steril paketi açın.</li>
	<li>Her zaman noktasında 10 dakika boyunca doğrudan böbrek korteksine iki prob yerleştirin. Kaplamanın tüm uzunluğu doku matrisi ile kaplanmalıdır; belirli bir açı gereklidir, ancak ca. 90 deg genellikle kullanılır. NOT: Tüm tıbbi prosedür, belirli bir kurumdaki standart protokolleri izler. SPME örneklemesi ile ilgili hiçbir değişiklik dikkate alınmaz. Yordam aşağıdaki altı örnekleme zaman noktasını içerir: a) böbrek rezeksiyonu öncesi, donörden in vivo; b)-e) 1 saat, 3 h, 5 h, böbrek perfüzyonu 7 h sonra, organ odasında ex vivo; f) reperfüzyon sonra, alıcıdan in vivo.</li>
	<li>Sondaları dokudan çekerek geri çekin ve kaplama yüzeyinden kalan kanı temizlemek için lc-MS sınıfı su ile durulayın. Cerrahi bölgeden uzaklaşın ve sondaların çıkarılmasından hemen sonra.</li>
</ol>3. Taşıma ve depolama
<ol><li>Probları ayrı şişelere yerleştirin ve kapatın.</li>
	<li>Şişeleri kuru buzla dolu bir strafor kutusuna veya taşınması için sıvı nitrojene yerleştirin.</li>
	<li>Numuneleri bir dondurucuda (-80 °C) saklayın veya hemen desorption adımına başlayın.</li>
</ol>4. Desorption
<ol><li>Metabolomik analiz için 80:20 asetonitile:su (v/v) ve lipidomik analiz için 1:1 izopropanol:metanol (v/v) oluşan desorpsiyon çözeltilerini hazırlayın.</li>
	<li>2,0 mL etiketli şişelere yerleştirilen çözeltinin 100°L'lik pipet'i ve daha önce kapağıdelinmiş bir probu her şişeye yerleştirin.</li>
	<li>Girdap ajitatör üzerinde şişeleri koyun ve 120 dakika için 1.200 rpm ajitasyon hızı ayarlayın.</li>
	<li>Şişelerden sondaları çıkarın. Elde edilen özler artık enstrümantal analiz için hazırdır.</li>
</ol>5. LC-MS analizi
<ol><li>LC-MS sisteminin otoörnekleyicisinde ekstreler içeren şişeleri yerleştirin. NOT: Bu çalışmada yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve orbitrap kütle analizörü ile birleşen sıvı kromatografisi (RP, HILIC) kullanılmıştır. Metabolomik analiz parametreleri için adım 5.2'ye gidin. Lipidomik analiz parametreleri için adım 5.6'ya gidin.</li>
	<li>Ters faz ayırma için pentaflorofenil (PFP) kolonu (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) kullanın.<ol>
<li>Akış hızını sırasıyla 300 μL/dk'ya, otomatik numune ve kolon sıcaklıklarını ise 4 °C ve 25 °C'ye ayarlayın.</li>
		<li>Mobil fazları aşağıdaki oranlar doğrultusunda hazırlayın: mobil faz A: su:formik asit (99.9:0.1, v/v) ve mobil faz B: asetonitile:formik asit (99.9:0.1, v/v). Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: mobil faz akışının başlatılması (0-3 dk): %100 A'ya doğrusal bir degrade ve ardından %10 A (3-25 dk) kadar doğrusal bir degrade, %10 A izokratik akışla 34 dakikaya kadar, ardından 6 dakika sütun tekrar denge süresi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HILIC ayırma için hilic kolonu (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A) kullanın. Akış hızını 400 μL/dk olarak ayarlayın.<ol>
<li>Mobil fazları aşağıdaki oranlar doğrultusunda hazırlayın: mobil faz A: asetonitile:amonyum asetat tampon (9:1, v/v, etkili tuz konsantrasyonu 20 mM), mobil faz B: asetonitrile:amonyum asetat tamponu (1:1, v/v, etkili tuz konsantrasyonu 20 mM).</li>
		<li>Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: mobil faz akışını (0-3 dk) %100 A'da başlatmak, 3,0 dk tutun ve 5 dk içinde %100 B'ye rampa. 12 dakika kadar% 100 B ile tutun, sütun yeniden denge süresi 8 dakika takip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tbmktürün aralığını 85-1000 m/z olarak ayarlayın. Pozitif iyonizasyon modunda HESI iyon kaynağı parametrelerini ayarlayın: püskürtme gerilimi 1.500 V, kılcal sıcaklık 300 °C, kılıf gazı 40 a.u., aux gaz akış hızı 15 a.u., probu ısıtıcı sıcaklığı 300 °C, S-Lens RF seviyesi %55.</li>
	<li>Cihaz performansını izlemek için analiz edilen her numuneden (düzenli olarak her 10-12 örnek) oluşan QC numunelerini çalıştırın.</li>
	<li>Ters faz ayırma için C18 kolonu (2,1 mm x 75 mm, 3,5 m) kullanın.<ol>
<li>Akış hızını sırasıyla 200 μL/dk'ya, otomatik numune ve kolon sıcaklıklarını ise 4 °C ve 55 °C'ye ayarlayın. Mobil fazları aşağıdaki oranlar doğrultusunda hazırlayın: mobil faz A: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM amonyum asetat ve 1 mM asetik asit; mobil faz B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM amonyum asetat ve 1 mM asetik asit.</li>
		<li>Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: 0-1 dk (%20 B), 1-1,5 dk (%20-50 B), 1,5-7,5 dk (%50-70 B), 7,5-- 13 dk (70-95% B), 13-17 dk (%95 B), 17-17.1 dk (95-20% B), 17.1-23 dk (%20).</li>
	</ol>
</li>
	<li>HILIC ayırma için hilic kolonu (100 x 2,1 mm, 3 μm) kullanın.<ol>
<li>Akış hızını sırasıyla 400 μL/dk'ya, otomatik numune ve kolon sıcaklıklarını ise 4 °C ve 40 °C'ye ayarlayın.</li>
		<li>Mobil aşamaları aşağıdaki oranlar doğrultusunda hazırlayın: mobil faz A: ACN; mobil faz B: Suda 5 mM amonyum asetat. Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: 0-2 dk (%96 B), 2-15 dk (%96-80 B), 15-15,1 dk (80-96% B), 15,1-21 dk (%96 B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pozitif iyonizasyon modunda HESI iyon kaynağı parametrelerini pozitif iyonizasyon modunda ayarlayın gerilim 3.500 V, kılcal sıcaklık 275 °C, kılıf gazı 20 a.u., aux gaz akış hızı 10 a.u., prob ısıtıcı sıcaklığı 300 °C, S-Lens RF seviyesi %55.</li>
	<li>Cihaz performansını izlemek için analiz edilen her numuneden (her 10-12 örnekte bir) 10 μL'lik QC numuneleri çalıştırın.</li>
	<li>Cihazla uyumlu yazılımlarda veri toplama gerçekleştirin.</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>Hedeflenmemiş metabolomik ve lipidomik analizlere adanmış yazılımkullanımı ile veri işleme, putatif tanımlama ve istatistiksel analiz yapın. NOT: Veri yapısını görselleştirmek için temel bileşenler analizi (PCA) ve kutu bıyık çizimleri elde edilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>U.S. Department of Health & Human Services. Organ Procurement and Transplantation Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://optn.transplant.hrsa.gov">https://optn.transplant.hrsa.gov</a> (2019).</li>
<li>Branger, P., Undine, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBranger%2C+P+%22Annual+Report+2018%2FEurotransplant+International+Foundation%22">Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation</a>. , Eurotransplant Foundation. Leiden. (2018).</li>
<li>Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preoperative+assessment+of+the+deceased-donor+kidney%3A+From+macroscopic+appearance+to+molecular+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers.</a> Transplantation. 97, 797-807 (2014).</li>
<li>Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+kidney+organ+quality+and+prediction+of+outcome+at+time+of+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation.</a> Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+comparing+DCD+and+DBD+liver+allografts+uncovers+lysophospholipids+elevated+in+recipients+undergoing+early+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction.</a> Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).</li>
<li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lipid+changes+in+acute+kidney+injury+using+SWATH+lipidomics+coupled+with+MALDI+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+The+principles+and+potential+applications+to+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).</li>
<li>Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+metabolomics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Understanding metabolomics in biomedical research.</a> Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).</li>
<li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+microextraction+fills+the+gap+in+tissue+sampling+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols.</a> Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).</li>
<li>Filipiak, W., Bojko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPME+in+clinical%2C+pharmaceutical%2C+and+biotechnological+research+-+How+far+are+we+from+daily+practice%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+-+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).</li>
<li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+invasive+in+vivo+tissue+sampling+for+monitoring+biomarkers+and+drugs+during+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery.</a> Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).</li>
<li>Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+of+the+transplanted+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Interventional+Radiology%22%5BJournal%5D)">Biopsy of the transplanted kidney.</a> Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).</li>
<li>Plattner, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+and+adequacy+of+transplant+kidney+biopsies%3A+A+comparison+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Access%22%5BJournal%5D)">Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques.</a> Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).</li>
<li>Tapia-Canelas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+associated+with+renal+graft+biopsy+in+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nefrologia%22%5BJournal%5D)">Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients.</a> Nefrologia. 34, 115-119 (2014).</li>
<li>Afshinnia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+and+Biomarker+Discovery+in+Kidney+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease.</a> Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).</li>
<li>Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+New+insight+into+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: New insight into kidney disease.</a> Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).</li>
<li>Kaminski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+Consumption+by+Warm+Ischemia-Injured+Porcine+Kidneys+in+Hypothermic+Static+and+Machine+Preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation.</a> Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).</li>
<li>Wijermars, L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+postreperfusion+metabolic+recovery+directly+associates+with+incident+delayed+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function.</a> Kidney International. 90, 181-191 (2016).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteo-metabolomics+reveals+compensation+between+ischemic+and+non-injured+contralateral+kidneys+after+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion.</a> Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).</li>
<li>Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+phosphatidylcholines+are+produced+in+renal+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury.</a> PLoS One. 13, 1-24 (2018).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+monitoring+kidney+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in monitoring kidney transplants.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).</li>
<li>Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+approaches+for+the+diagnosis+and+understanding+of+kidney+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases.</a> Metabolites. 9, (2019).</li>
<li>Zhang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+insights+into+chronic+kidney+disease+and+modulatory+effect+of+rhubarb+against+tubulointerstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis.</a> Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).</li>
<li>Looby, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+microextraction+coupled+to+mass+spectrometry%3A+Via+a+microfluidic+open+interface+for+rapid+therapeutic+drug+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring.</a> Analyst. 144, 3721-3728 (2019).</li>
<li>Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+blade+spray%3A+Shifting+the+paradigm+of+direct+sample+introduction+to+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS.</a> Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar Q-Exactive Focus Orbitrap kütle spektrometresi erişim için SPME cihazları ve Thermo Fisher Bilimsel sağlamak için MilliporeSigma (Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) kabul etmek istiyorum.

Organ kalitesinin değerlendirilmesi, belirli bir organın organ nakli için uygun olup olmadığı veya atılması gerekip gerekmediği konusunda hızlı bilgi lendirilmiş kararlar alması gereken hekimler için büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Donör yaşı, iskemi süresi, enfeksiyonlar ve inflamatuar süreçler gibi birden fazla faktör uzun süreli greft sonucunu etkileyebilir. Böbrek allogreft fonksiyonunu teşhis etmek için bugüne kadar çeşitli yöntemler geliştirilmiş olsa da, histopatolojik muayene bu konuda altın standart olmaya devam etmektedir3,4,12. Biyopsi prosedürü önceden var olan donör hastalığı ve damar değişiklikleri ile ilgili önemli bilgiler verebilse de, kusurları ücretsiz değildir. Gözlemciler arası değişkenlik ile ilişkili örnekleme hataları ve organ fonksiyonu ile ilgili kapsamlı bilgi için yetersiz glomerülin örneklemesi bu konuda tipik kaygılar olmaya devam etmektedir. Ayrıca, numune hazırlama dondurulmuş kesitler durumunda greft eksik bir değerlendirme gibi bazı konular getiriyor, ve parafin kesit için işlem süresinin uzatılması. Ancak, mikroskobik veya brüt hematüri olarak akut görünebilir kanama riski, biyopsi prosedürü ile ilişkili en önemli hayatı tehdit eden komplikasyondur. Bu nedenle, izin verilebilen biyopsi sayısı kesinlikle transplantasyon prosedürleri sınırlıdır, bu yöntem ile dinamik değişiklikler ve zaman serisi analizleri yakalama engelleyen bir faktör12,13,14. Histolojik analizin yararları metodolojiile ilişkili risklere karşı tartılmalıdır. Histolojik bulguların değeri tartışılmazdır, ancak sapmaların moleküler mekanizmalarını açıklamaz.
Metabolomik ve lipidomik "-omics" bilimsel ailenin en genç etki alanlarıdır. Metabolik ağ içinde birbirine bağlı düşük moleküler (<1.200 Da) insan metabolitleri ve lipitlerinin tamamı insan metabolomu olarak tanımlanır. Genom ömrü boyunca nispeten sabit kalır, mutasyonların neden olduğu hafif değişiklikler seyrek olarak meydana gelir. Metabolom, tüm biyolojik süreçlerdeki değişikliklere ve çevresel faktörlere karşı son derece hassas olan gen ekspresyonunun bir ürünüdür. Metabolitlerin ve lipidlerin dinamik doğası onları mevcut organ durumu7,8,,15,16mükemmel göstergeler yapar. Yukarıda belirtilen protokolde önerilen SPME yöntemi, organın korunması sırasında organın vücuttan alınmasından alıcının vücudundan revaskülarleşmeye kadar olan değişikliklerin tespit edilmesini sağlar. Probun küçük çapı (~200 μm) minimal invazivlik sağlar ve dokuya herhangi bir zarar vermeden aynı organdan çeşitli numuneler sağlar. En sık nakledilen organ olan böbrek kullanılarak yapılan çalışmalar, greftlerin kalitesini ve işlevini düşürmekten sorumlu metabolik yolların daha iyi anlaşılmasını ve daha fazla karakterizasyonuna olanak sağlar. Zaman içinde modifikasyonların izlenme olasılığı, biyopsi gibi konvansiyonel invaziv yöntemlere kıyasla tekniğin önemli bir avantajıdır. Şu anda sunulan analiz, özellikle esansiyel amino asitler, pürinler, pürin nükleozitler ve glikofosfolipidler olmak üzere çeşitli lipid ve metabolit gruplarının değiştirilmiş konsantrasyonlarını saptamaktadır. Bu sonuçlar önceki doku analiz raporları ile tutarlı5,6,17,18,19,20. Bugüne kadar, transplantasyon veya iskemi / reperfüzyon yaralanması (IRI) fenomenleri sonrası komplikasyonlarin indükleyen süreçleri açıklamak için metabolomik veya lipidomik kullanan bilimsel raporların çoğunluğu biyoakış2121,22,23analizi ile sınırlı olmuştur.
Her klinik uygulama, analitik yöntemin performansının beklenen kriterleri karşılamasını sağlamak için örnekleme protokolünün optimizasyonunu gerektirir. Bu bağlamda, SPME'den yararlanmanın yararı, çeşitli deneysel tasarımlar için koşulları ayarlama imkanıdır. Erişilebilir ekstraksiyon aşamalarının çeşitliliği, çeşitli polaritelere sahip ekstrakte edilmiş metabolitlerin geniş bir spektrumunu sağlar. Aynı zamanda, her sorbent belirli özelliklere doğru seçicilik sağlar ve örnek matris mevcut tüm bileşikleri ayıklamak değil gerçeği nedeniyle bu yöntemin bir sınırlama olarak kabul edilebilir. Bu SPME kaplamalar sadece serbest moleküller üzerinden ayıklamak unutulmamalıdır, ve sadece analit bağlı bir kısmı ile etkileşime girmez. Kaplamaların biyouyumluluğu dokuya toksisite getirmezken proteinler gibi büyük moleküllerin çıkarılmasını kısıtlamaz; sonuç olarak, enzimatik süreçler numune toplama aşamasında zaten inhibe edilir ve eserlerin varlığı en aza indirgenmiş, bu da alternatif örnekleme yöntemlerine göre büyük bir avantajdır. Kaplamanın uzunluğu ekstraksiyon verimliliğini etkiler (yani, kaplamanın uzunluğu yüzey alanını ve ekstraksiyon faz hacmini belirler); böylece, daha uzun kaplamalar daha yüksek geri kazanımlar verir. Diğer taraftan, daha kısa kaplamalar daha yüksek uzamsal çözünürlük sağlar. Güvenilir sonuçlar için, sondayı böbrek korteksinin aynı derinliğine batırmak çok önemlidir. Çok derin yerleştirme böbrek medulla girme riskine neden olur. Çıkarma süresi de çıkarma verimliliği ile orantılıdır. Bu nedenle, optimum çıkarma süresi seçimi SPME yöntemi geliştirmenin en kritik adımlarından biridir. Zaman ölçümünün doğruluğu en yüksek tekrarlanabilirliği sağlar. Tartışılan gibi biyolojik uygulamalarda, analitik protokolün duyarlılığı ve tekrarlanabilirliği ile tıbbi prosedürün kısıtlamaları arasında her zaman bir uzlaşma vardır. Denge ekstraksiyonu en yüksek hassasiyeti sağlarken, güvenlik nedenlerinden dolayı, ekstraksiyon süresi ameliyatın toplam süresini etkilememesi gerektiğinden, bu tür uygulamalarda ön denge koşulları genellikle kullanılır. Desorpsiyon verimliliği proses in zaman ve kromatografikayırma9 ,10,,11için kullanılan mobil faz ile uyumlu olmalıdır desorpsiyon çözücü, bileşimi tarafından belirlenir.
Cerrahi içi değerlendirmelerde kullanılan tanısal aletin en önemli gereksinimlerinden biri analiz zamanıdır. Mevcut girişimleri in vivo SPME ekstraksiyon mikroakışkan açık arayüzü (MOI)24 veya kaplamalı bıçak spreyi (CBS)25ile bir kütle spektrometre doğrudan birleştiğinde için hızlı bir araç geliştirmek için yapılmaktadır. Bu tür yaklaşımlar, analitik sonuçların gerçek zamanlı veya gerçek zamanlıya yakın bir şekilde açıklanmasına olanak sağlayacaktır. Metabolik ve lipidomik profillerin müdahale öncesi analizleri için bu yöntemlerin kullanılması, organ nakli işlemleri sırasında karar verme sürecini geliştirerek organ yetmezliği durumunda mümkün olan en iyi kişiselleştirilmiş yaklaşımı ve hızlı yanıtı sağlayabilir.
Özetle, önerilen protokolün böbrek greftlerinin tam metabolik ve lipidomik profillerine ulaşmasını sağlayacağı ve bunun da organ kalitesinin kapsamlı bir değerlendirmesini ve iskemi-reperfüzyon yaralanmasından sorumlu süreçlerin karakterizasyonunu sağlayacağı varsayımında dır. Projenin yenilik katı faz mikroekstraksiyon (SPME), metabolomik ve lipidomics analizi (örneğin, Orbitrap yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi) için mevcut en yenilikçi teknolojilerden biri ile birlikte, yaşam sistemlerinin düşük invaziv örnekleme sunan kullanımını içerir. SPME, metabolitlerin numune toplama, ayıklama ve söndürmesini tek bir adımda birleştirerek hızlı analiz için mükemmel bir araç haline getirir. Bu protokolün, böbreklerin organ nakli öncesi koşullarının hangi lerinin organ fonksiyonlarının gecikmeli olması veya organ nakli sonrası işlev bozukluklarından sorumlu olduğu ve greft koruma protokolünün organın biyokimyasını nasıl etkilediği ile ilgili soruların yanıtlanılmasına yardımcı olması beklenmektedir. Bu tür bilgiler sadece transplantasyona bağlı olası komplikasyonların önlenmesinde önemli bir etkiye sahip olmakla kalmamış, aynı zamanda mevcut greft koruma protokollerinin iyileştirilmesine, canlı organ nakli dokusunun ve can kaybının en aza indirilmesine yardımcı olabilir. Önerilen çözüm, belirli potansiyel biyobelirteçlerin doğrulanması ve transplantolojide terapötik sonuçların iyileştirilmesi de dahil olmak üzere bu alanda daha fazla araştırmanın önünü açacaktır.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/60946/using-a-chemical-biopsy-for-graft-quality-assessment">Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment</a>. One of the affiliations was&#160;updated.
The third affiliation was&#160;updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun&#34;
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/60946/using-a-chemical-biopsy-for-graft-quality-assessment">Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment</a>. One of the affiliations was&#160;updated.

Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

ABD Organ Tedarik ve Transplantasyon Ağı'na göre, 2019 yılında ABD'de böbrek nakli bekleyen 94.756 hasta vardı; 2018 yılında Avrupa'da ise bu sayı 10.791 idi. Her on dakikada bir, birisi ABD'de ulusal organ nakli bekleme listesine eklenir, ve 20 kişi her gün bir organ nakli 1 bekliyor ölmek tahmin edilmektedir1,2. Böbrek nakli, dünya çapında son dönem böbrek fonksiyon bozukluğu yaşayan çok sayıda insan için hayat kurtarıcı bir tedaviyöntemidir. Prosedür konvansiyonel diyaliz ile karşılaştırıldığında artan sağkalım oranı ve daha yüksek yaşam kalitesi ile ilişkilidir.
Ancak organ nakli, organ yetersizliği veya organ kalitesinin değerlendirilmesi için etkili araçların olmaması gibi pek çok ciddi sorunla karşı karşıyadır. Standart protokoller, greftin kalitesi hakkında kapsamlı bilgi vermeyen makroskopik görünüm muayenesi veya invaziv doku biyopsisi ile sınırlıdır. Görsel bir değerlendirme göz de görülebilen tümörlerin belirlenmesine, anatomik anormalliklere veya greftlere büyük hasara olanak sağlarken, bu yaklaşım çok özneldir ve gözlemcilerin deneyimlerine göre etkinliğine göre değişiklik gösterir. Biyopsi ise önceden var olan böbrek hastalıkları ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilir ve bu nedenle greft sonuçlarının belirlenmesinde objektif ve kanıtlanmış bir değer yöntemi olarak kabul edilir. Ancak, biyopsi prosedürü kusurları ücretsiz değildir; kanama gibi potansiyel komplikasyonlar riski vardır ve soğuk iskemik süreyi önemli ölçüde uzatan 4-5 saatlik ek numune hazırlama gereklidir. Bu nedenle, özellikle Avrupa'da, doğrudan doku analizi kullanımı genişletilmiş kriterler donörler (ECD) ve3donörler dolaşım ölüm (DCD) 3,4sonra sınırlıdır.
Metabolomik ve lipidomik son zamanlarda organ korunması sırasında meydana gelen biyokimyasal yollar değişiklikleri daha iyi anlaşılması için umut verici yaklaşımlar olarak kabul edilmiştir. Metabolomik ve lipidomik profilleme sonraki sonuçları ile organ kaldırma ile ilgili ani çevresel değişikliklere sistemin acil tepkilerin izlenmesini sağlar: iskemi, oksidatif stres, veya inflamatuar yanıtlar5,6,7,8. Böbrek büyük ölçüde metabolik süreçler ile ilişkili bir organdır, böylece metabolitler ve lipid konsantrasyonları ölçümleri potansiyel organ kalitesi biyobelirteçleri belirlenmesine izin verebilir ve greft sonucu daha iyi tahminler sağlar.
Mevcut organ kalite değerlendirme yöntemleri ile ilişkili yukarıdaki komplikasyonlar ve sınırlamalar göz önüne alındığında, hızlı ve karmaşık organ kalite değerlendirmesi için daha az invaziv tanısal çözüm gereklidir. Solid faz mikroekstraksiyonu (SPME), geniş bir metabolit ve lipid spektrumunun kapsamasını sağlayan minimal invaziv bir analitik yöntem olarak bu gerekliliklere uygundur. Teknik ince (~ 200 μm), biyouyumlu, titanyum-nikel alaşım probu ince organ içine kısa bir süre için seçici bir ekstraksiyon fazı ile kaplı ekleme dayanmaktadır. SPME'nin protein ekstraksiyonunu önlediği ve bu nedenle alternatif yöntemlere göre önemli bir avantaj olan numune toplama aşamasında metabolizma inhibisyonunu sağladığı vurgulanmalıdır. Ayrıca,,cihazın minyatürleştirilmesi organ9,10,11birkaç yapıların tekrarlayan ve eşzamanlı analizlerin yürütülmesi için izin verir.11

<table><tbody><tr><td>Asetik asit</td><td>Merck</td><td>5330010050</td><td>Mobil faz katkı maddesi</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Alchem</td><td>696-34967-4X2.5L</td><td>HPLC çözücü</td></tr><tr><td>Amonyum asetat</td><td>Merck</td><td>5330040050</td><td>Mobil faz katkı maddesi</td></tr><tr><td>BENCHMIXER XL ÇOK TÜPLÜ VORTEKSER</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1010</td><td>Vorteks karıştırıcı</td></tr><tr><td>Kapaklar</td><td>Perlan Teknolojileri</td><td>5183-2076</td><td>Mavi scrw tp, önceden yarık PTFE / Si spta, 100PK</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Merck</td><td>1024441000</td><td></td></tr><tr><td>Discovery HS F5 Supelguard Kartuşu, 3 & mu; m, L ve kez; İç Çap 2 cm ve kez; 2,1 mm</td><td>Merck</td><td>567570-U</td><td>HPLC koruma kolonu</td></tr><tr><td>Discovery HS F5, 2,1 mm x 100 mm, 3 & m</td><td>Merck</td><td>567502-U</td><td>HPLC kolonu</td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Alchem</td><td>497-94318-50ML</td><td>Mobil faz katkı maddesi</td></tr><tr><td>Cam şişeler</td><td>Perlan Technologies</td><td>5182-0714</td><td></td></tr><tr><td>HILIC Luna 3 & mu; m, 200A, 100 x 2.0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-00D-4449-B0</td><td>HPLC sütunu</td></tr><tr><td>HILIC SecurityGuard Kartuşu, 3 &mu; m, 4 x 2.0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-AJ0-8328</td><td>HPLC koruma kolonu</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Alchem</td><td>231-AL03262500</td><td>HPLC çözücü</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Alchem</td><td>696-34966-4X2.5L</td><td>HPLC çözücü</td></tr><tr><td>Nano-saf su</td><td>Merck</td><td>1037281002</td><td>HPLC çözücü</td></tr><tr><td>Q Eksaktif Odak hibrit dört kutuplu-Orbitrap MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Ekzit Odak Kütlesi</td><td> Spektrometre</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-cHILIC 3 ve mikro; m, 100 ve yükselen; 100 x 2,1 mm</td><td>Merck</td><td>1506570001</td><td>HPLC sütunu</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-HILIC Koruma Kiti 20 x 2,1 mm</td><td>Merck</td><td>1504360001</td><td>HPLC koruma sütunu</td></tr><tr><td>SPME LC fiber problar, karışık modlu</td><td>Supelco</td><td>prototip elyaflar</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC sistemleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>UltiMate 3000</td><td>HPLC sistemi</td></tr><tr><td>Flakon ekleri (devre dışı)</td><td>Perlan Technologies</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 3.5&mu; m 2.1x75mm</td><td>Sular</td><td>186005644</td><td>HPLC sütunu</td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 VanGuard Kartuşu 3.5&mu; m, 2.1x5mm</td><td>Sular</td><td>186007811</td><td>HPLC koruma sütunu</td></tr></tbody></table>

greft kalite değerlendirmesi için kimyasal biyopsi kullanımı

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Böbrek nakli, dünya çapında son dönem böbrek fonksiyon bozukluğu olan çok sayıda insan için hayat kurtarıcı bir tedaviyöntemidir. Prosedür konvansiyonel diyaliz ile karşılaştırıldığında artan sağkalım oranı ve hastanın yaşam kalitesinin daha yüksek ile ilişkilidir. Ne yazık ki, transplantoloji organ kalitesi değerlendirmesi için güvenilir yöntemlerin eksikliği muzdarip. Standart tanı teknikleri, greft hakkında kapsamlı bilgi vermeyen makroskopik görünüm muayenesi veya invaziv doku biyopsisi ile sınırlıdır. Önerilen protokol, transplantasyon için ayrılan böbreklerde bulunan tüm düşük moleküler bileşiklerin kapsamlı metabolomik ve lipidomik analizi için ideal bir analitik yöntem olarak katı faz mikroekstraksiyonunun (SPME) tanıtılmayı amaçlamaktadır. SPME sondasının küçük boyutu, metabolitlerin herhangi bir doku toplama olmadan doğrudan organdan çıkarılmasını sağlayan kimyasal biyopsi yapılmasını sağlar. Yöntemin minimum invazivliği zaman içinde birden fazla analizin gerçekleştirildirilmesine izin verir: organ hasadı ndan hemen sonra, korunması sırasında ve alıcının vücudunda revaskülarizasyondan hemen sonra. Bu yeni örnekleme yönteminin yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleşimi, greft kalitesinin biyolojik belirteçleri ve organ disfonksiyonunun olası gelişiminin göstergeleri olarak hizmet verebilecek bir dizi karakteristik bileşiğin ayrımcılığa izin verdiği varsayımında bulunmaktadır.

Numune toplama, yukarıda açıklanan SPME yöntemine göre, 7 mm karışık mod çıkarma aşaması ile kaplanmış problar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Örnekleme doğrudan greft dokusundan (transplantasyon öncesi in vivo), böbrek odasında 1 saat, 3 saat, 5 saat ve 7 saat perfüzyon sonrası ekstremite ve alıcıda revaskülarizasyon sonrası in vivo yapıldı. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi (RP, HILIC) kullanımı ile hedeflenmemiş metabolomik ve lipidomik analizler gerçekleştirildi ve kütle analizörü pozitif iyonizasyon modunda ayarlandı. Veri kalitesini değerlendirmek ve sonuçlarla ilgili genel öngörülere ulaşmak için veriler temel bileşen analizine (PCA) tabi tutulmuştu. Şekil 1'degösterildiği gibi, QC örnekleri sıkı bir küme oluşturarak analizlerin kalitesini doğrular. İncelenen gruplar, transplantasyon öncesi ve sonrası metabolik ve lipidomik profillerde ve organ perfüzyonu sırasında ki farklılıkların görüntülenmesiiçin nispeten iyi bir ayrım sergilerler(Şekil 2). SPME örneklemesi zaman içinde organın metabolik profilinin alınmasına izin verir. Seçilen metabolitlerin kutu bıyık çizimleri deney boyunca metabolit düzeylerindeki değişikliklere örnek teşkil eder(Şekil 3). Rp ve HILIC sütunlarında ayrılmış çıkarılan özelliklerin geniş spektrumu Şekil 4'tegösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig01.jpg"> Şekil 1: Metabolomik ters faz (A), HILIC (B) ve lipidomik ters faz (C), HILIC (D) analizleri için kalite kontrol örneklerinin kümelemesini gösteren temel bileşen analizi. Araçsal istikrarsızlık tarafından indüklenen olası değişiklikleri izlemek için hedefsiz analizde kalite kontrol gereklidir. Sıkı QC örnekleri kümesi, gözlenen tüm değişikliklerin biyolojik kökenli olmasını sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig02.jpg"> Şekil 2: Belirli örnekleme noktaları arasındaki metabolomik (A) ve lipidomik (B) farklarını gösteren temel bileşen analizi. SPME-LC-HRMS ile böbreğin hedeflenmemiş profillemesi, organların korunmasının sonraki adımlarında organlardaki biyokimyasal farklılıkları gözlemlemesini sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig03.jpg"> Şekil 3: Peritransplant döneminde metabolitlerde (A, B) ve lipidlerde (C, D) değişiklikler gösteren seçilmiş bileşiklerin kutu bıyık çizimleri. Ayrımcı bileşiklerin seçilmesi ve tanımlanmasından sonra kutu bıyık plotları protokolün sonraki adımlarında bu bileşiklerin düzeylerindeki değişiklikleri izlemek ve farklı koruma protokollerine tabi organlardaki metabolit düzeylerini karşılaştırmak sağlar veya kalp atışı donörleri veya donörler kalp ölümü sonrası farklı donörlerden hasat edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig04.jpg"> Şekil 4: (A) ters faz ve (B) HILIC ayırma ile LC-MS analizi ile elde edilen özelliklerin iyon haritası (m/z karşı bekletme süresi). Çizim, önerilen protokolle elde edilen toplam özellik sayısını (çıkarmadan algılamaya) tahmin etmeyi ve polarite dayalı analiz kapsamını değerlendirmeyi sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Protokol, transplantasyon için ayrılan böbrek greftlerinin kalite değerlendirmesi için kapsamlı metabolomik ve lipidomik analizler ile kimyasal biyopsi yaklaşımının kullanımını göstermektedir.

Greft Kalite Değerlendirmesi için Kimyasal Biyopsi Kullanımı

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

Kimyasal biyopsi, organ naklinde hızlı ve karmaşık greft kalite değerlendirmesi için yeni bir tanısal çözümdür. Şu anda, bu tür bir analiz sağlayan başka düşük invaziv yöntemler mevcut değildir. Bu tekniğin en büyük avantajı, SPME problarının basitliği ve düşük invazivliği nedeniyle greft doku modifikasyonlarının koruma süresi içinde izlenme olasılığıdır.Probun küçük çapı ve çok çeşitli biyouyumlu kaplamalar bu yöntemi nakledilen organların analizi için uygun hale getirir ve tümör analizi gibi tıbbi araştırmalarda uygulanabilir hale getirir. Küçük hatalar sonuçları büyük ölçüde etkileyebilir, çünkü ilk kez bu tekniği çalışırken ayrıntıları ve belirli adımların zamanlaması dikkat edin. Protokol basittir, ancak görsel gösteriden sonra anlamak ve gerçekleştirmek daha kolaydır.Bire bir metanol ve su oluşan bir önkoşullama karışımı hazırlayarak başlayın. Pipet her iki mililitre cam şişe içine çözelti bir mililitre ve her şişe bir prob yerleştirin. 1200 RPM'de bir girdap ajitatöründeki şişeleri bir saat boyunca çalkala.Daha sonra probları LCMS sınıfı su ile durulayın ve standart cerrahi sterilizasyon protokolüne veya steril işleme bölümüne göre sterilize edin. Numuneyi almaya hazır olduğunuzda, steril ambalajı açın ve iki prob'u doğrudan böbrek korteksine 10 dakika boyunca takın, kaplamanın tüm uzunluğunun doku matrisi tarafından karşılandıklarından emin olun. Her sonda için örnekleme süresini takip etmeyi unutmayın.Sondayı dokudan çekerek geri çekin ve kalan kanı çıkarmak için kaplamayı hemen LCMS sınıfı suyla durulayın ve cerrahi bölgeden durulayın. Sondaları taşımak için, ayrı şişelere yerleştirin ve kapatın. Sonra kuru buz veya sıvı nitrojen dolu bir kutu içinde şişeleri yerleştirin.Numuneleri negatif 80 santigrat derecede saklayın veya hemen desorpsiyona devam edin. Metabolomik analiz için asetonitrril ve sudan oluşan bir desorpsiyon çözeltisi ve lipidomik analiz için isopropanol ve metanolden oluşan bir desorpsiyon çözeltisi hazırlayın. İki mililitre etiketli şişelere çözelti eklemek için çözeltinin 100 mikrolitresini ekleyin ve her şişeye bir prob yerleştirin 1200 RPM'de şişeleri iki saat boyunca çalkalayın ve probları şişelerden çıkarın ve LCMS analizine devam edin.Hedeflenmemiş metabolomik ve lipidomik analizler için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanıldı. Veriler, kaliteyi değerlendirmek için sonuçlarla ilgili genel öngörüleri değerlendirmek için temel bileşen analizine tabi tutulmuştu. Kalite kontrol örnekleri analizkalitesini doğrulayan sıkı bir küme oluşturdu.İncelenen gruplar, transplantasyon öncesi ve sonrası ve organ perfüzyonu sırasında metabolik ve lipidomik profilfarklılıklarının görüntülenmesi için nispeten iyi bir ayrım sergilediler. Hem ters faz hem de sıvı kromatografi sütunlarında geniş bir özlenmiş özellik spektrumu ayrılmıştır. Deney boyunca değişiklikler ve metabolit düzeyleri seçilen metabolitlerin kutu bıyık çizimleriyle gösterilmiştir.Bu işlemi gerçekleştirirken, organların heterojenliğini aklınızda bulundurun. Prob'u istenilen konuma yerleştirin örnekleme süresini her zaman aynı tutun ve örneklemeden sonra fiberi düzgün bir şekilde sabitleyin. SPME ile keşfedilen biyobelirteçler, MSMS, LCMS veya diğer analitik enstrümantasyonla birleşen bu ekstraksiyon yöntemi kullanılarak ölçülebilir.Ayrıca numune tüketilmediğinden biyopsi gibi rutin analizler de yapılabilmektedir. Bu yöntem, numune ön tedavisi için gerek kalmadan diğer doku metabolomikleri ve lipidomik analizleri için uyarlanabilir. Belirli metabolitler için.Diğer kaplamalar kompozisyon seçicilik ve duyarlılığı artırmak için kullanılabilir.

using-a-chemical-biopsy-for-graft-quality-assessment

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, endobronşiyal biyopsilerden dendritik hücreleri tanımlamak için immünohistokimyasal boyama tekniği açıklanmaktadır.

İmmünohistokimyasal Boyama: İnce Doku Kesitlerinden Mekansal Bilgi Elde Etmeye Yönelik Bir Yöntem

Bu videoda, önceden hasat edilmiş bir donör böbrekten metabolitlerin SPME probu tabanlı ekstraksiyonunu gösteriyoruz. Ekstrakte edilen metabolitler, transplantasyon için organ kalitesini değerlendirmek amacıyla metabolomik ve lipidomik analiz yapmak için kullanılabilir.

Katı Faz Mikroekstraksiyon Örneklemesi: Greft Dokularından Örnek Ekstraksiyonu için Prob Tabanlı Bir Teknik

Yağ grefti, yumuşak doku açıklarının yeniden yapılandırılması için önemli bir tekniktir. Bununla birlikte, değişken greft sağkalımı ile karakterize öngörülemeyen bir prosedür olmaya devam etmektedir.  Amacımız, farklı yağ grefti hazırlama ve uygulama teknikleri arasındaki hacim tutulmasını karşılaştırmak için yeni bir görüntüleme yöntemi kullanan bir fare modeli tasarlamaktı.

Mikro-Bilgisayarlı Tomografi ile Çıplak Fareler içine İnsan Yağ Enjeksiyonu Canlılığına Değerlendirilmesi

Bugüne kadar, kalın doku defektleri tipik olarak otolog doku flepleri veya mühendislik dokuları uygulanarak yeniden yapılandırılır. Bu protokolde, otolog fleplerin yerine geçecek şekilde otolog pediküllü vaskülarize doku flebi mühendisliği için yeni bir yöntem sunuyoruz.

Engineered Vaskülarize Muscle Flap

protokol yeni bir yöntem, insan doku ayrıştırmak ve kollajen sünger ile birlikte, deri lezyonlarının tedavisinde kullanıma hazır insan biyo-kompleksleri doğuran otolog mikro greft oluşturmak açıklar. Bundan başka, bu sistem, mekanik ayrıştırma sonra farklı zamanlarda mikro greft hücre canlılığı korur.

Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

İnsanlardaki dendritik hücreler (DC'ler) dahil olmak üzere akciğerde yerleşik bağışıklık hücreleri, solunan patojenlere ve alerjenlere karşı savunma için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, insan akciğer dokusunun kıtlığı nedeniyle, çalışmalar sınırlıdır. Bu çalışma, immünohistokimya ve akış sitometrisi kullanarak akciğer DC'lerini incelemek için insan mukozal endobronşiyal biyopsilerini işlemek için protokoller sunmaktadır.

İmünohistokimya ve Akım Sitometri Kullanımı Endobronşiyal Biyopsilerinde Mekansal Dağılımı ve Fenotipik Kimlik: İnsan Akciğer dendritik hücrelerin

Tam alan optik koherens mikroskopisinin kornea donör stromasının yüksek kalitede değerlendirilmesi için bir yöntem olarak kullanımını tanımladık. Bu protokol, sağlık veya hastalığın göstergesi olan özellikleri tanımlamak için kullanılabilir ve donör dokuların taranmasını ve seçimini ve dolayısıyla keratoplasti sonuçlarını iyileştirmeyi amaçlar.

Kornea Greftlerinde Stromal Özelliklerin Histoloji Benzeri Analizi için Tam Alan Optik Koherens Mikroskopisi

Bu yöntem, radikal prostatektomi sonrası biyobankacılık dokusunda örnekleme prosedürlerini yönlendirmek amacıyla prostat kanseri hastaları için klinik tanı salk›r›m verilerinin kullan›m›n› kapsamaktadır. Bu, daha geniş bir akış aşağı uygulama yelpazesi için taze dokunun verimliliği ve kullanılabilirliği etrafında daha önce yayınlanmış yöntemlerle ilgili sorunların üstesinden gelir.

Prostat Kanseri Biyobankacılık Için Örnekleme Prosedürleri Kılavuzu manyetik rezonans görüntüleme ve biyopsi verilerinin kullanımı

Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli kaynaklı tümörlerde in vivo embriyonik öldürücü olan gen nakavtlarını gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz ve daha sonra nakavtın tümör büyümesi, proliferasyon, sağkalım, göç, invazyon ve transkriptom in vitro ve in vivo üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması

Bu protokol, radikal prostatektomi örneklerinden örneklerin toplanmasını kolaylaştırmak için bir yöntemi tanımlar. Amaç, örneklerden alınan doku örneklerini bir Biyobankada saklamadan önce anatomopatolojik kriterlere dayalı olarak haritalamak, karakterize etmek ve mikro-makro diseksiyon yapmaktır.

Geliştirilmiş Örnekleme Tekniği ve Histolojik Karakterizasyon ile Prostat Tümörü Biyobankacılık Güvenilirliğinin Artırılması

Keşfedin böbrek greft kalite değerlendirmesi için kimyasal biyopsi yöntemini. SPME probu ile metabolomik ve lipidomik analizler yaparak düşük invaziv izleme sağlayan bu protokol, organ nakli öncesi hızlı tanı koymayı mümkün kılar.

Greft Kalite Değerlendirmesi için Kimyasal Biyopsi Kullanımı

Daha fazla video keşfet