B Lenfosit Aktivasyonunu Incelemek Için Çekiş Kuvveti Mikroskobu

Bu yöntem, b hücreleri tarafından immün sinapsta uygulanan kuvvetlerin mekansal zamansal dağılımını ölçmeyi ve bunları spesifik proteinlerin işe alınmasıyla ilişkilendirmelerini mümkün kılar. Poliakrilamid jelleri kullanarak çekiş kuvveti mikroskobu uygulamak kolaydır. Bu protokol, birçok B hücresinin mekanik yeteneklerinin ölçümünü hızlı bir şekilde ayarlamak için kullanılabilir.

Bu yöntem esnektir ve integrinler gibi diğer ligandları grafiğe veya T hücreleri veya sinirli fagosittoz gibi diğer immün sinapsları incelemek için uyarlanabilir. Bu deneyin gerektirdiği jellerin fiziksel ve kimyasal özellikleri nedeniyle klasik çekiş kuvveti mikroskobu yöntemlerinin B hücrelerine uyarlanması zor olabilir. Jel desteğini salinize ederek başlayın.

Coverslip veya cam alt Petri kabını uv lambasıyla iki dakika çalıştırın, ardından 200 mikrolitre APTMS ile beş dakika sallayın. Bu jel kovalent bağlanması için destek hazırlayacaktır. Coverslip veya cam alt kabı ultra saf su yla iyice yıkayın ve vakum aspirasyon kullanarak kurulayın.

Jeldüzite için kapakları hazırlamak için, seramik bir kapak tutucu içine koymak, küçük bir kabın içine tutucu koymak, ve tamamen kapsayacak şekilde kapaklar üzerinde silikonreaktif dökün. Alüminyum folyo ile kaplayın ve üç dakika oda sıcaklığında bırakın. Bu arada, ultra saf su ile büyük bir beher doldurun.

Silikonlu reaktifte üç dakika kuluçkadan sonra, kapaklı kapak tutucuyu su ile kabına aktarın. Coverlips'i ultra saf suyla iyice durulayın. İyi kurulayın ve kağıt mendillerüzerine yerleştirin.

En iyi sonuçlar için, hemen jel polimerizasyonu ile devam edin. El yazması talimatlara göre 500 Pascal jel ön karışımı hazırlayın, ardından 1,67 mikrolitre boncuk ile 167 mikrolitre ön karışımı birleştirin. Girdap ve beş dakika boyunca bir banyo sonicator karışımı sonicate.

Karışımı alüminyum folyo ile ışıktan koruyun. Polimerizasyonu sermayelendirmek için jel karışımına %10 amonyum persülfat 1.67 mikrolitre ekleyin, ardından 0,2 mikrolitre TEMED ekleyerek ve jeli pipetle karıştırarak polimerizasyonu başlatın. Jel döküm için, pipet jel karışımı dokuz mikrolitre her tuzlu coverslip veya cam alt çanak üzerine.

Hemen silikonlu coverslip ile jel düzleştirmek, jel coverslip tüm alana yayılır ve bazı dışarı sızar sağlamak için forseps ile bastırarak. Coverslip veya cam alt kabı büyük bir Petri kabına ters çevirin ve boncukları jel yüzeyine doğru zorlamak için tezgaha dokunun. Isledilmiş bir oda oluşturmak için çanak üzerine nemlendirilmiş bir doku yerleştirin.

Alüminyum folyo ile kaplayın ve bir saat kuluçka. Kuluçkadan sonra, numuneye PBS ekleyerek coverslip salınımını kolaylaştırın. Dikkatlice bir iğne ile coverslip çıkarın, hafifçe çanak eğilerek ama jel PBS batık olduğundan emin olun.

Silikonlaştırıcı ajan, akrilamid, baz akrilamid ve TEMED inhalasyon ile toksik olabilir. Standart kişisel koruyucu ekipman giyin ve bu ürünleri kimyasal bir başlık altında manipüle edin. PBS'yi jellerden aspire edin ve oda sıcaklığında 150 mikrolitre Sulfo-SANPAH ekleyin.

Jeli uv tedavisine iki dakika maruz bırakın, sonra jeli PBS ile üç kez yıkayın. Sulfo-SANPAH ve PBS yıkayımı ile tedaviyi tekrarlayın, sonra jel için tavuk yumurtası lysozyme veya HEL 250 mikrolitre ekleyin ve dört derece santigrat folyo alüminyum kaplı bir nem odasında gece boyunca kuluçka. Kuluçkadan sonra HEL antijenini çıkarın ve jeli üç kez PBS ile yıkayın.

Son olarak, B hücre kültürü medya 500 mikrolitre ile jel kapağı ve oda sıcaklığında bırakın. Görüntüleme için termal ve karbondioksit kontrolü ile bir konfokal mikroskop kullanın. Yaklaşık 200 mikrolitre bırakarak, jel medya aspire.

Jeli mikroskoba yerleştirin. Jelin alt ve üst kısmında iki ana kat boncuk görünecektir. Jel düzlemine odaklanın ve görüntü için eşit bir alan bulun.

Görüntüleme alanını dikkatle seçin ve odakta kaldığından emin olun. Uygun bir boncuk yoğunluğu ve çift yüzey sağlam ve güvenilir kuvvet ölçümleri elde etmek için anahtardır. MD4 farelerden jeliçin birincil B lenfositlerin 80 mikrolitre ekleyin, odak korumak için jel dokunmaktan kaçınarak.

Odak hala doğru olduğundan emin olun ve hücrelerin bölgede azalan görülebilir. Hücreler jel ulaşmadan önce edinimi başlatın. Filmi ImageJ'de bir görüntü yığını olarak açın, ardından makro cropandsave.ijm'i çalıştırın.

Bir çıktı dizini seçin ve öznitelik kanalı ayarlarını yapılandırın. Dikdörtgen aracıyla ilgi çekici bölgeleri seçin ve T tuşunu kullanarak YG listesine ekleyin. Bittiğinde Tamam'ı tıklatın. Makro hücrenin bir maskesi önerdiğinde, tatmin ediciyse Tamam'ı tıklatın.

Tatmin edici değilse, Tamam'ı tıklatın ve ardından herhangi bir seçim aracıyla kapalı bir bölgeyi el ile seçin ve ardından devam et'i tıklatın. MATLAB'ı açın ve tfmv1.m çalıştırın. Gerekli parametreleri girdi.

Özellikle, piksel boyutu ve edinme zaman aralığı ve Young modül E ve Poisson oranı gibi jel özellikleri gibi görüntü özelliklerini kontrol edin. Tamamlandığında, yazılımın çıktılarını özgün dosyayla aynı dizinde bulun. Doğru boncuk görüntüleri yıldızlı gökyüzüne benzer parlak noktalar bir üniforma ve rasgele dağılımı gibi görünüyor.

Boncuk sayısı çok düşük olduğunda veya görüntü odak dışında olduğunda veri ve analiz güvenilir değildir. Hücrenin substratile ilk temasından önceki bir referans çerçevesi kullanarak boncukların gözle hareketini gözlemlemek mümkündür. Tek parçacık takibinden yaklaşık sonuçlar elde edilebilir.

Analiz, referans görüntüsündeki boncukların denetim olarak bölümlenmesini sağlar. Yazılım kullanarak, her piksel ve her zaman noktasında yerel stres vektörü olan deplasman ve stres alanı elde etmek de mümkündür. Hücre nin alanına entegre edilmiş yer değiştirme ve kuvvet alanlarının skaler ürünü, hücrenin substrat üzerinde uyguladığı toplam çalışmayı sağlar.

İki biyolojik koşul karşılaştırıldığında, ortalama bir eğri veya enerjinin bir platoya ulaştığı son zaman noktalarına göre ortalama bir değer hesaplanabilir. Kuvvetlerin mekansal bilgileri ilgili olduğunda, her koşulun tek zaman noktalarını karşılaştırmak da mümkündür. Floresan antijen ekstraksiyon zaman atlamalı bir örnek burada gösterilmiştir.

Sinapstaki floresan sinyallerin ilerleyici görünümü, jelden antijen kopma gösterir. Floresan verileri ortalama bir çıkarma eğrisi oluşturmak için kullanılabilir. Protokoldeki en hassas adım, jelin örtü altında polimerizasyonudur.

Bu adım nispeten hızlı ve dikkatli bir şekilde jel coverslip altında düzgün sıkılır sağlanması yapılmalıdır. Bu prosedürü takiben, B lenfositleri ifade eden floresan protein hücre içi yapıların lokalizasyonunu ve kuvvet desenlerini eş zamanlı olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik, hücre kontraktilite ve antijen alımı belirli proteinlerin rolünü değerlendirmek için genetik veya kimyasal pertürbasyonlar ile kombine edilebilir.