B Lenfosit Aktivasyonunu Incelemek Için Çekiş Kuvveti Mikroskobu
23 Temmuz 2020
Burada B hücreleri üzerinde çekiş kuvveti mikroskobu deneyleri yapmak için kullanılan bir protokol salıyoruz. Yumuşak poliakrilamid jellerin hazırlanmasını ve işlevselleştirilmesinin yanı sıra mikroskopta veri toplama ve veri analizinin bir özetini anlatıyoruz.
Bu yöntem, b hücreleri tarafından immün sinapsta uygulanan kuvvetlerin mekansal zamansal dağılımını ölçmeyi ve bunları spesifik proteinlerin işe alınmasıyla ilişkilendirmelerini mümkün kılar. Poliakrilamid jelleri kullanarak çekiş kuvveti mikroskobu uygulamak kolaydır. Bu protokol, birçok B hücresinin mekanik yeteneklerinin ölçümünü hızlı bir şekilde ayarlamak için kullanılabilir.
Bu yöntem esnektir ve integrinler gibi diğer ligandları grafiğe veya T hücreleri veya sinirli fagosittoz gibi diğer immün sinapsları incelemek için uyarlanabilir. Bu deneyin gerektirdiği jellerin fiziksel ve kimyasal özellikleri nedeniyle klasik çekiş kuvveti mikroskobu yöntemlerinin B hücrelerine uyarlanması zor olabilir. Jel desteğini salinize ederek başlayın.
Coverslip veya cam alt Petri kabını uv lambasıyla iki dakika çalıştırın, ardından 200 mikrolitre APTMS ile beş dakika sallayın. Bu jel kovalent bağlanması için destek hazırlayacaktır. Coverslip veya cam alt kabı ultra saf su yla iyice yıkayın ve vakum aspirasyon kullanarak kurulayın.
Jeldüzite için kapakları hazırlamak için, seramik bir kapak tutucu içine koymak, küçük bir kabın içine tutucu koymak, ve tamamen kapsayacak şekilde kapaklar üzerinde silikonreaktif dökün. Alüminyum folyo ile kaplayın ve üç dakika oda sıcaklığında bırakın. Bu arada, ultra saf su ile büyük bir beher doldurun.
Silikonlu reaktifte üç dakika kuluçkadan sonra, kapaklı kapak tutucuyu su ile kabına aktarın. Coverlips'i ultra saf suyla iyice durulayın. İyi kurulayın ve kağıt mendillerüzerine yerleştirin.
En iyi sonuçlar için, hemen jel polimerizasyonu ile devam edin. El yazması talimatlara göre 500 Pascal jel ön karışımı hazırlayın, ardından 1,67 mikrolitre boncuk ile 167 mikrolitre ön karışımı birleştirin. Girdap ve beş dakika boyunca bir banyo sonicator karışımı sonicate.
Karışımı alüminyum folyo ile ışıktan koruyun. Polimerizasyonu sermayelendirmek için jel karışımına %10 amonyum persülfat 1.67 mikrolitre ekleyin, ardından 0,2 mikrolitre TEMED ekleyerek ve jeli pipetle karıştırarak polimerizasyonu başlatın. Jel döküm için, pipet jel karışımı dokuz mikrolitre her tuzlu coverslip veya cam alt çanak üzerine.
Hemen silikonlu coverslip ile jel düzleştirmek, jel coverslip tüm alana yayılır ve bazı dışarı sızar sağlamak için forseps ile bastırarak. Coverslip veya cam alt kabı büyük bir Petri kabına ters çevirin ve boncukları jel yüzeyine doğru zorlamak için tezgaha dokunun. Isledilmiş bir oda oluşturmak için çanak üzerine nemlendirilmiş bir doku yerleştirin.
Alüminyum folyo ile kaplayın ve bir saat kuluçka. Kuluçkadan sonra, numuneye PBS ekleyerek coverslip salınımını kolaylaştırın. Dikkatlice bir iğne ile coverslip çıkarın, hafifçe çanak eğilerek ama jel PBS batık olduğundan emin olun.
Silikonlaştırıcı ajan, akrilamid, baz akrilamid ve TEMED inhalasyon ile toksik olabilir. Standart kişisel koruyucu ekipman giyin ve bu ürünleri kimyasal bir başlık altında manipüle edin. PBS'yi jellerden aspire edin ve oda sıcaklığında 150 mikrolitre Sulfo-SANPAH ekleyin.
Jeli uv tedavisine iki dakika maruz bırakın, sonra jeli PBS ile üç kez yıkayın. Sulfo-SANPAH ve PBS yıkayımı ile tedaviyi tekrarlayın, sonra jel için tavuk yumurtası lysozyme veya HEL 250 mikrolitre ekleyin ve dört derece santigrat folyo alüminyum kaplı bir nem odasında gece boyunca kuluçka. Kuluçkadan sonra HEL antijenini çıkarın ve jeli üç kez PBS ile yıkayın.
Son olarak, B hücre kültürü medya 500 mikrolitre ile jel kapağı ve oda sıcaklığında bırakın. Görüntüleme için termal ve karbondioksit kontrolü ile bir konfokal mikroskop kullanın. Yaklaşık 200 mikrolitre bırakarak, jel medya aspire.
Jeli mikroskoba yerleştirin. Jelin alt ve üst kısmında iki ana kat boncuk görünecektir. Jel düzlemine odaklanın ve görüntü için eşit bir alan bulun.
Görüntüleme alanını dikkatle seçin ve odakta kaldığından emin olun. Uygun bir boncuk yoğunluğu ve çift yüzey sağlam ve güvenilir kuvvet ölçümleri elde etmek için anahtardır. MD4 farelerden jeliçin birincil B lenfositlerin 80 mikrolitre ekleyin, odak korumak için jel dokunmaktan kaçınarak.
Odak hala doğru olduğundan emin olun ve hücrelerin bölgede azalan görülebilir. Hücreler jel ulaşmadan önce edinimi başlatın. Filmi ImageJ'de bir görüntü yığını olarak açın, ardından makro cropandsave.ijm'i çalıştırın.
Bir çıktı dizini seçin ve öznitelik kanalı ayarlarını yapılandırın. Dikdörtgen aracıyla ilgi çekici bölgeleri seçin ve T tuşunu kullanarak YG listesine ekleyin. Bittiğinde Tamam'ı tıklatın. Makro hücrenin bir maskesi önerdiğinde, tatmin ediciyse Tamam'ı tıklatın.
Tatmin edici değilse, Tamam'ı tıklatın ve ardından herhangi bir seçim aracıyla kapalı bir bölgeyi el ile seçin ve ardından devam et'i tıklatın. MATLAB'ı açın ve tfmv1.m çalıştırın. Gerekli parametreleri girdi.
Özellikle, piksel boyutu ve edinme zaman aralığı ve Young modül E ve Poisson oranı gibi jel özellikleri gibi görüntü özelliklerini kontrol edin. Tamamlandığında, yazılımın çıktılarını özgün dosyayla aynı dizinde bulun. Doğru boncuk görüntüleri yıldızlı gökyüzüne benzer parlak noktalar bir üniforma ve rasgele dağılımı gibi görünüyor.
Boncuk sayısı çok düşük olduğunda veya görüntü odak dışında olduğunda veri ve analiz güvenilir değildir. Hücrenin substratile ilk temasından önceki bir referans çerçevesi kullanarak boncukların gözle hareketini gözlemlemek mümkündür. Tek parçacık takibinden yaklaşık sonuçlar elde edilebilir.
Analiz, referans görüntüsündeki boncukların denetim olarak bölümlenmesini sağlar. Yazılım kullanarak, her piksel ve her zaman noktasında yerel stres vektörü olan deplasman ve stres alanı elde etmek de mümkündür. Hücre nin alanına entegre edilmiş yer değiştirme ve kuvvet alanlarının skaler ürünü, hücrenin substrat üzerinde uyguladığı toplam çalışmayı sağlar.
İki biyolojik koşul karşılaştırıldığında, ortalama bir eğri veya enerjinin bir platoya ulaştığı son zaman noktalarına göre ortalama bir değer hesaplanabilir. Kuvvetlerin mekansal bilgileri ilgili olduğunda, her koşulun tek zaman noktalarını karşılaştırmak da mümkündür. Floresan antijen ekstraksiyon zaman atlamalı bir örnek burada gösterilmiştir.
Sinapstaki floresan sinyallerin ilerleyici görünümü, jelden antijen kopma gösterir. Floresan verileri ortalama bir çıkarma eğrisi oluşturmak için kullanılabilir. Protokoldeki en hassas adım, jelin örtü altında polimerizasyonudur.
Bu adım nispeten hızlı ve dikkatli bir şekilde jel coverslip altında düzgün sıkılır sağlanması yapılmalıdır. Bu prosedürü takiben, B lenfositleri ifade eden floresan protein hücre içi yapıların lokalizasyonunu ve kuvvet desenlerini eş zamanlı olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik, hücre kontraktilite ve antijen alımı belirli proteinlerin rolünü değerlendirmek için genetik veya kimyasal pertürbasyonlar ile kombine edilebilir.
Genel Bakış
Bu makale, poliakrilamid jellerin hazırlanmasını ve veri toplama yöntemlerini detaylandırarak, B hücreleri üzerinde traksiyon kuvveti mikroskopisi deneyleri için bir protokol sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
Arka Plan
- Traksiyon kuvveti mikroskobisi, B hücreleri tarafından uygulanan kuvvetlerin ölçülmesine olanak tanır.
- İmmün sinapsların anlaşılması, immünolojik araştırmalar için kritik öneme sahiptir.
- Hücrelerin mekanik özelliklerini incelemek için poliakrilamid jeller kullanılır.
- Klasik yöntemlerin B hücrelerine uyarlanması, kendine özgü zorluklar sunar.
Çalışmanın Amacı
- İmmün sinapslardaki B hücrelerinin mekanik yeteneklerini ölçmek.
- Kuvvet dağılımını protein katılımıyla ilişkilendirmek.
- Çeşitli immün etkileşimlerin incelenmesi için esnek bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Tuzlandırılmış poliakrilamid jellerin hazırlanması.
- Jellerin UV işlemi ve proteinlerle fonksiyonelleştirilmesi.
- Konfokal mikroskopi kullanılarak veri toplama.
- Kuvvet ölçümleri için ImageJ ve MATLAB ile görüntü analizi.
Ana Sonuçlar
- B hücreleri tarafından uygulanan kuvvetlerin başarılı bir şekilde ölçülmesi.
- Veri güvenilirliğini etkileyen temel parametrelerin belirlenmesi.
- Protokolün diğer immün hücrelere uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- İmmün yanıtlar sırasında B hücrelerinin mekanik davranışlarına ilişkin içgörüler.
Sonuçlar
- Protokol, B hücresi mekaniğinin detaylı analizine olanak tanır.
- Bulgular, immün sinaps dinamiklerinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Gelecekteki uygulamalar, diğer hücre tiplerine ve ligandlara genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
İmün sinapslarda hücresel kuvvetlerin ölçülmesi, humoral immünite ve aşı yanıtında kritik bir süreç olan B hücresi aktivasyonuna dair mekanistik içgörüler sağlar. Traksiyon kuvvet mikroskopisi, reseptör sinyalizasyonu ve antijen ekstraksiyonu ile korelasyon gösteren biyofiziksel parametrelerin kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak biyolojik ilaç geliştirmede hedef risk azaltma süreçlerini destekler. Bu yaklaşım, moleküler etkileşimi fonksiyonel hücresel çıktılara bağlayarak erken keşif aşamasındaki öngörüsel güvenilirliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: BCR etkileşimini biyomekanik yanıtlar ve immün sinapstaki protein alımıyla ilişkilendirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Primer B lenfositlerinde kuvvetle ilişkili süreçlerin doğrudan ölçümü yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Alt akış fonksiyonel sonuçlarla korelasyon gösteren aktivasyonun biyofiziksel imzalarını nicelleştirerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Ligand kaynaklı hücresel mekanikleri tekrarlanabilir bir formatta değerlendirmek için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Güvenilir kuvvet ölçümleri için kontrollü jel sertliği, boncuk yoğunluğu ve protein fonksiyonelleştirmesi yoluyla analiz koşullarını standardize eder.
- Ölçeklenebilirlik: Kontrollü koşullar altında çok sayıda B hücresinin hızlı kurulumuna ve görüntülenmesine olanak sağlayarak tarama hazırlığını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Fizyolojik immün sinaps dinamiklerini yansıtan kuvvet modellerini ölçerek, erken keşif bulgularını preklinik doğrulamayla birbirine bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Antijen ekstraksiyonunu hücre içi sinyalleme ve hücre iskeleti organizasyonu ile ilişkilendirerek hedef modülasyonundaki belirsizliği azaltır.
- Hastalıkla İlişkililik: Otoimmünite ve enfeksiyon hastalıkları gibi bağlamlarda B hücresi yanıtlarını incelemek için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, hücresel mekanobiyolojinin görüntüleme tabanlı nicel okumalarını sağlayarak, hedef etkileşimi taramasından öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Sinaps mimarisini ve sinyalleşme koordinasyonunu ortaya çıkaran uzamsal ve zamansal kuvvet dağılımlarını ölçerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tutarlı kuvvet nicelendirmesi için standartlaştırılmış poliakrilamid jel hazırlama ve boncuk tabanlı yer değiştirme takibi ile assay hazırlığı sağlar.
- Analiz: Aktivasyon durumlarını karşılaştırmak için toplam iş ve enerji plato metriklerinin hesaplanmasına olanak tanıyan yer değiştirme ve stres alanları oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Fizyolojik antijen sunumu ve ekstraksiyon senaryolarını yansıtan kuvvet paternlerini yakalayarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: T hücreleri ve fagositik sistemler dahil olmak üzere, B hücrelerinin ötesinde çeşitli ligandlara ve bağışıklık hücresi tiplerine uyarlanabilen yeniden kullanılabilir bir platform olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Doğrudan biyofiziksel ölçüm yoluyla B hücresi aktivasyon yollarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış jel polimerizasyonu, fonksiyonelleştirme ve görüntüleme protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Fonksiyonel sonuçlardan önce gelen erken aktivasyon biyofiziksel biyobelirteçlerini tanımlayarak git/gitme (go/no-go) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Antijen ekstraksiyon verimliliği ile bağlantılı kuvvet üretim kapasitesine dayalı olarak hedeflerin riskten arındırılmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Hücre kültürü, konfokal mikroskopi ile ImageJ ve MATLAB kullanılarak yapılan biyomekanik analizler konusunda uzmanlık gerektirir.
- UV işlemi, jel polimerizasyonu ve canlı hücre görüntüleme sırasında çevresel kontrol için kullanılan ekipmanlara bağımlıdır.
- Veri karşılaştırılabilirliğini sağlamak için jel hazırlama, boncuk yoğunluğu ve protein kaplamanın ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Özellikle B hücreleri (~6 µm) gibi küçük hücreler için farklı hücre boyutları ve ligand yoğunluklarına yönelik adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Akrilamid ve TEMED'in toksisitesi nedeniyle kimyasal çeker ocak kullanımı ve KKD gereksinimi ile güvenilir ölçümler için boncuk yoğunluğuna ve odaklamaya karşı duyarlılık gibi pratik sınırlamaları kapsar.
