Name: Fibroblastların ve Schwann Hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Öğrenin duyusal ve motor sinirlerden fibroblast ve Schwann hücrelerinin in vitro izolasyonunu. Bu yöntem sinir rejenerasyonu ve sinir sistemi hastalıkları üzerine araştırmalar için yüksek saflıkta hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Grant No. 2017YFA0104703), Çin Ulusal Doğal Vakfı (Grant No. 31500927) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma Nantong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan denekleri de dahil olmak üzere tüm prosedürler etik Deneysel Hayvanlar, Jiangsu Eyaleti, Çin İdare Komitesi tarafından onaylandı.
1. Motor ve duyusal sinir fibroblastları ve SC'lerin izolasyonu ve kültürü
<ol><li>Çin Nantong Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi tarafından sağlanan yedi günlük Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını (n=4) kullanın. Sıçanları %5 izofluran içeren bir tanka 2-3 dakika yerleştirin, hayvanların yavaşça nefes almasına ve bağımsız bir aktivitesi olmamasına izin verin ve sonra kafa kesmeden önce %75 etanol kullanarak dezenfekte edin.</li>
	<li>Yaklaşık 3 cm için arka deri kesmek ve omurilik kaldırmak için makas kullanın. Omuriliği ortaya çıkarmak için vertebrakanalını dikkatlice açın.</li>
	<li>Omuriliği 60 mm'lik petri kabında 2-3 mL buz gibi d-Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile koruyun.</li>
	<li>Anatomik yapıya dayanarak, ventral kök (motor sinir) ve daha sonra dorsal kök (duyusal sinir) bir diseksiyon mikroskop altında çıkarmak. Daha sonra, buz gibi d-Hanks 'dengeli tuz çözeltisi (HBSS) yerleştirin.</li>
	<li>HBSS'yi çıkardıktan sonra sinirleri makasla 3-5 mm'ye bölün ve 1 mL %0,25 (w/v) tripsin ile 37 °C'de 18-20 dk. Daha sonra, sindirimi durdurmak için % 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 3-4 mL DMEM ile ek.</li>
	<li>Pipet karışımı yavaşça yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı ve santrifüj 800 x g 5 dakika için. Bundan sonra, supernatant atın ve DMEM 2-3 mL% 10 FBS ile takviye çökelti askıya.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 400 örgü filtre kullanarak filtre uygulayın ve 60 mm Petri kabındaki hücreleri ve kültürü %5 CO2varlığında 37 °C'de aşılamak. 4-5 günlük bir kültü nden sonra % 90 birleştiğinde 0 (p0) fibroblast ve SC'yi izole edin.</li>
	<li>SC'lerin izolasyonu ve kültürü (Şekil 1)<ol>
<li>Hücreleri 1x PBS kullanarak bir kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 8-10 s sindirmek için 60 mm Petri kabıbaşına %0,25 (w/v) tripsin (37 °C) 1 mL ekleyin. Bundan sonra, sindirimi durdurmak için % 10 FBS ile desteklenen 3 mL DMEM ekleyin.</li>
		<li>SC'leri pipetle ayırmak için karışımı hafifçe üfler. Daha sonra 5 dk için 800 x g'da SC'leri toplayın ve santrifüj edin.</li>
		<li>Supernatant atın ve% 10 FBS ile DMEM 3 mL çökelti askıya, 1% penisilin / streptomisin, 2 μM forskolin ve 10 ng / mL HRG, ve sonra kaplamasız hücreleri aşılamak 60 mm Petri kabı. 37 °C'de 30-45 dakika küllettikten sonra, fibroblastlar (birkaç sayıda fibroblast SC ile sindirilir) yemeğin dibine bağlanır.</li>
		<li>Supernatant 'ı (SC'ler dahil) 37 °C'de başka bir poli-L-l-lizin (PLL) kaplamalı orta yemek ve kültüre 2 gün aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fibroblastların izolasyonu ve kültürü (Şekil 1)<ol>
<li>SC'leri çıkardıktan sonra (adım 1.8'de gösterildiği gibi), kalan fibroblastları 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra fibroblastları 37 °C'de 2 dk sindirmek için %0,25 (w/v) trypsin 1 mL ekleyin.</li>
		<li>Sindirimi sona erdirmek için %10 FBS ile desteklenen DMEM ekleyin. Bir pipet kullanarak fibroblastlar darbe ve sonra toplamak ve 5 dakika için 800 x g onları santrifüj.</li>
		<li>Süpernatant atın, % 10 FBS içeren DMEM 2 mL ile çökelti askıya, ve sonra kaplamasız hücreleri aşılamak 60 mm Petri çanak. 37 °C'de 30-45 dk.'da kültürden sonra fibroblastlar yemeğin dibine bağlanır. Supernatant atın (SCs birkaç sayı dahil). Daha sonra 37 °C'de fibroblastlar yemeğine ve kültürüne %10 FBS ile takviye edilmiş 3 mL DMEM ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>P1 hücrelerini %90'a ulaşana kadar iletin. Daha sonra bölüm 1.8 ve 1.9'da açıklandığı gibi diferansiyel sindirim ve diferansiyel bağlılık ile tekrar arındırın.</li>
	<li>2 gün boyunca kültürden sonra p2 fibroblastlar ve SCs sindirin ve sonra hücreleri toplamak, saymak ve 1 x 105 sayı / iyi immünositokimya (ICC) için PLL kaplı slaytlar üzerinde.</li>
</ol>2. Hücre saflığının belirlenmesi için ICC
<ol><li>37 °C'de hücreleri 24 saat kültüre ve diferansiyel sindirim ve motor ve duyusal fibroblastlar ve SC'lerin diferansiyel yapışması sonrasında ICC boyama gerçekleştirin.</li>
	<li>Motor ve duyusal fibroblastları ve SC'leri 1x PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 18 dakika boyunca %4 paraformaldehit (pH 7.4) 200 μL/iyi olarak düzeltin.</li>
	<li>Numune SC'lerini bloke edici tamponile (%0,1 Triton X-100% 0,01 M PBS içinde %5 keçi serumu içeren) bloke edin ve numune fibroblastlarını %5 keçi serumu içeren blokajlı (%5 keçi serumu içeren 0,01 M PBS) 37 °C'de 45 dk'da PBS üç kez yıkayarak engelleyin.</li>
	<li>Engelleme tamponunu çıkarın ve aşağıdaki birincil antikorlarla kuluçkaya yatın: fare monoklonal anti-CD90 antikor (fibroblastlar için özel bir belirteç) (1:1000) fibroblastlar ve fare anti-S100 antikorları (SC'ler için özel bir belirteç) (1:400) gecede 4 °C'de SC'ler için.</li>
	<li>Birincil antikorları atın, PBS ile üç kez yıkayın ve aşağıdaki ikincil antikorlarla kuluçkaya yatın: Fibroblastlar için Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG (1:400) ve 488 konjuge keçi anti-fare IgG (1:400) oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca sc'ler için.</li>
	<li>Numuneleri PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çekirdekleri 5 μg/mL Hoechst 33342 boya ile lekeleyin. Numuneyi üç kez 1x PBS ile yıkayın ve cam kaydırak üzerine montaj ortamını (20 μL/slayt) kullanarak monte edin.</li>
	<li>Her kuyu için üç rasgele alanda confocal lazer tarama mikroskobu ile hücre fotoğrafları çekin. Toplam çekirdek ve CD90 pozitif hücre sayısını, S100-pozitif hücreleri değerlendirin ve ardından sırasıyla CD90-pozitif hücrelerin ve S100-pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Boyamayı triplicate olarak gerçekleştirin.</li>
</ol>3. Hücre saflığının belirlenmesi için akış sitometri analizi (FCA)
<ol><li>FCA16tarafından daha önce açıklandığı gibi motor ve duyusal fibroblastların ve SC'lerin saflığını değerlendirin. Kısaca, p2 motor ve duyusal fibroblastlar ve SCs% 0.25 (w / v) tripsin ile sindirmek, hücre pelet resuspend ve 15 dakika oda sıcaklığında fiksasyon ortamda onları kuluçka.</li>
	<li>Permeabilizasyon ortamı olan hücreleri kuluçkaya yatırın ve fibroblastlar için fare monoklonal anti-CD90 antikorunu (0.1 μg/106 hücre, 200 μL) ve 30 dakika oda sıcaklığındaki SC'ler için fare anti-S100 antikor (1:400, 200 μL) kullanarak sonda yıkıntın.</li>
	<li>Hücreleri 488 konjuge keçi anti-fare IgG ile 30 dk. Akış sitometrisi gerçekleştirmek için FACS kalibrekullanın ve Cell Quest yazılımı kullanarak verileri analiz.</li>
	<li>Hücreleri sadece 488 konjuge keçi anti-fare IgG (fibroblastlar Grubu) ve fare IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - İzotip kontrolü (SCs grubu), negatif kontrol olarak hizmet veren ile kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>4. İstatistiksel analiz
<ol><li>Tüm verileri ± SEM. GraphPad Prism 6.0 kullanarak eşleşmemiş t-testi ile verilerdeki istatistiksel farklılıkları değerlendirin. P<0.05'te istatistiksel anlamlılığı ayarlayın. Tüm tahlilleri triplicate olarak gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Stierli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+homeostasis+and+regeneration+of+peripheral+nerve+is+distinct+from+the+CNS+and+independent+of+a+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28The+Company+of+Biologists%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population.</a> Development (The Company of Biologists). , (2018).</li>
<li>Schubert, T., Friede, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoneurial+fibroblasts+in+myelin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).</li>
<li>Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibroblast+impact+on+Schwann+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).</li>
<li>Lavdas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+engineered+to+express+the+cell+adhesion+molecule+L1+accelerate+myelination+and+motor+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143 (1), 145-155 (2010).</li>
<li>Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Controls+the+Long-Term+Survival+and+Phenotype+of+Repair+Schwann+Cells+during+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration.</a> Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).</li>
<li>Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+neuron-glial+cell+interaction+and+pathogenesis+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).</li>
<li>Hoke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+express+motor+and+sensory+phenotypes+that+regulate+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).</li>
<li>Brushart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+phenotype+is+regulated+by+axon+modality+and+central-peripheral+location%2C+and+persists+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro.</a> Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Gene+Expression+in+Primary+Cultured+Sensory+and+Motor+Nerve+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).</li>
<li>Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinstein%2C+DE+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. , (2001).</li>
<li>Palomo Irigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Primary+Rodent+Schwann+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).</li>
<li>Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+promotes+Schwann+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation.</a> Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).</li>
<li>Pannunzio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+selecting+Schwann+cells+from+adult+mouse+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve.</a> Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).</li>
<li>Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+Schwann+cells+based+on+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting.</a> Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).</li>
<li>He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+in+the+biological+characteristics+between+primary+cultured+sensory+and+motor+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells.</a> Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).</li>
<li>Weiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+transcriptomics+of+peripheral+nerve+tissue+and+cells+unravel+new+aspects+of+the+human+Schwann+cell+repair+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype.</a> Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Periferik sinirlerin iki büyük hücre popülasyonları SCs ve fibroblastlar dahil. Öncelikle kültürlü fibroblastlar ve SCs doğru periferik sinir gelişimi ve rejenerasyon sırasında fibroblastlar ve SCs fizyolojisi modelleme yardımcı olabilir. Çalışma, P7 sıçan siyatik sinir hücrelerinin S100-pozitif SC'lerin yaklaşık %85'ini, OX7-pozitif fibroblastların %13'ünü ve OX42-pozitif makrofajların sadece %1,5'ini13'üiçerdiğini göstermiştir. Fibroblast ların sayısı SC'lerden daha az olmasına rağmen, fibroblas...

Periferik sinir sisteminde, sinir lifleri esas olarak akson oluşur, Schwann hücreleri (SCs), ve fibroblastlar, ve aynı zamanda makrofajlar az sayıda içerir, mikrovasküler endotel hücreleri, ve bağışıklık hücreleri1. SC'ler aksonlar1:1 oranında sarılır ve endoneurium adı verilen bağ dokusu tabakası ile çevrilidir. Aksonlar daha sonra fasikül adı verilen gruplar oluşturmak için bir araya toplanır ve her fasikül perineurium olarak bilinen bir bağ dokusu tabakasına sarılır. Son olarak, tüm sinir lifi bağ dokusu bir tabaka sarılır, hangi epineurium olarak denir. Endoneurium'da, tüm hücre popülasyonu %48'lik SC'lerden oluşur ve kalan hücrelerin2önemli bir kısmı fibroblastlar 2'dir. Ayrıca, fibroblastlar epineurium, perineurium ve endoneurium3dahil olmak üzere tüm sinir kompartmanlarının önemli bileşenleridir. Birçok çalışma, SCs ve fibroblastlar periferik sinir yaralanmaları sonra rejenerasyon sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir4,5,6. Periferik sinirin ranzeksiyonundan sonra, perineurial fibroblastlar SC'ler ve fibroblastlar arasındaki efrin-B/EphB2 sinyal yolu üzerinden hücre sıralamasını düzenler, yaralar la aksonal yeniden büyümeye rehberlik eder5. Periferik sinir fibroblastları tenascin-C proteini salgılar ve β1-integrin sinyalyolu7 ile sinir rejenerasyonu sırasında SC'lerin göçünü artırır. Ancak, yukarıdaki çalışmalarda kullanılan SCs ve fibroblastlar siyatik sinir türetilmiştir, hangi duyusal ve motor sinirler hem de içerir.
Periferik sinir sisteminde, duyusal sinirler (afferent sinirler) merkezi sinir sistemi (CNS) reseptörlerinden duyusal sinyal yapmak, motor sinirler (efferent sinirler) kaslara CNS sinyalleri ilerlerken. Önceki çalışmalar, SCs farklı motor ve duyusal fenotipler ifade ve periferik sinir rejenerasyon desteklemek için nörotrofik faktörler salgılargöstermiştir 8,9. Yakın tarihli bir araştırmaya göre, fibroblastlar da farklı motor ve duyusal fenotipler ifade ve SCs göç etkiler10. Böylece, motor ve duyusal sinir fibroblastları/SC'leri arasındaki farkların araştırılması, periferik sinir spesifik rejenerasyonunun karmaşık altta yatan moleküler mekanizmalarını incelememizi sağlar.
Şu anda, antimitotik ajanların uygulanması da dahil olmak üzere, SCs ve fibroblastlar arındırmak için birçok yolu vardır, antikor aracılı sitoz11,12, sıralı immünpanning13 ve laminin substratum14. Ancak, yukarıdaki tüm yöntemler fibroblastlar kaldırmak ve sadece SCs korumak. Yüksek saflaştırılmış SCs ve fibroblastlar akış sitometri sıralama teknolojisi15elde edilebilir , ama zaman alıcı ve pahalı bir tekniktir. Bu nedenle, bu çalışmada, duyusal ve motor sinir fibroblastları ve SC'leri daha hızlı bir şekilde elde etmek için basit bir diferansiyel sindirim ve diferansiyel bağlılık yöntemi geliştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 Keçi Anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11005</td><td>Seyreltme: 1:400</td></tr><tr><td>CoraLite488-konjuge Affinipure Keçi Anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Proteintech</td><td>SA00013-1</td><td>Seyreltme: 1:400</td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Cell Quest yazılımı</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Hank'in dengeli tuz çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZ2-ILST</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Montaj Ortamı Abcam</td><td></td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>Fiksasyon ortamı / Geçirgenleştirme ortamı</td><td>Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD</td><td>GAS005</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometrisi</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - İzotip Kontrolü</td><td>Abcam</td><td>ab106163</td><td>Seyreltme: 1:400</td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-CD90 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab225</td><td>Seyreltme: ICC, 0.1 ve mikro için 1:1000; 106 hücreleri için g Flow Cyt</td></tr><tr><td>Fare anti-S100 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab212816</td><td>Seyreltme: 1:400</td></tr><tr><td>Polilisin (PLL)</td> <td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan NRG1-beta 1 / HRG1-beta 1 EGF Etki Alanı Protein R</td><td>& D Sistemleri</td><td>396-HB-050</td><td></td></tr><tr><td>%0,25 (a/h) tripsin</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr></tbody></table>

fibroblastların ve schwann hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Periferik sinir sistemindeki başlıca hücreler Schwann hücreleri (SCs) ve fibroblastlardır. Her iki hücre de sinir rejenerasyonunu etkileyen nörotrofik faktör gen ekspresyonu ve diğer biyolojik süreçlerin farklı desenlerinde yer alan duyusal ve motor fenotipleri belirgin bir şekilde ifade eder. Bu çalışma, yüksek oranda saflaştırılmış sıçan duyusal ve motor SC'leri ve fibroblastları daha hızlı elde etmek için bir protokol oluşturmuştur. Yenidoğan sıçanlarının ventral kökü (motor sinir) ve dorsal kökü (duyusal sinir) ayrıştırıldı ve hücreler 4-5 gün boyunca kültürlendi, ardından ayırıcı sindirim ve diferansiyel yapışma yöntemlerini sırayla birleştirerek duyusal ve motor fibroblastlar ve SC'lerin izolasyonu yapıldı. İmmünositokimya ve akış sitometrisi analizlerinin sonuçları duyusal ve motor SC'lerin ve fibroblastların saflığının %gt;90 olduğunu gösterdi. Bu protokol duyusal ve motor sinir rejenerasyonu keşfine katkıda, duyusal ve motor fibroblastlar / SCs çok sayıda elde etmek için kullanılabilir.

Işık mikroskobik gözlem SC'ler ve fibroblastlar sinir dokularından primer hücre kültüründe elde edilen iki ana hücre popülasyonudur. 1 saat için aşılama sonra, hücrelerin çoğu çanak altına yapışmış ve hücre morfolojisi yuvarlak oval değişti. 24 saat kültürden sonra, SC'ler bipolar veya tripolar morfoloji sergilediler ve bunların uzunluğu 100 ile 200 m arasında değişmektedir. 48 saat sonra, hücrelerin toplanması ve çoğalması meydana geldi, hangi birçok hücre uçtan uca, ...

Burada, fibroblastlar ve Schwann hücrelerini in vitro olarak duyusal ve motor sinirlerden arındırmak için bir yöntem salıyoruz.

Fibroblastların ve Schwann Hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Bu protokol sensör ve motor fibroblast ve Schwann hücrelerinin hızla çok sayıda elde etmek için kullanılabilir. Bu mesaj la elde edilen hücreler sinir rejenerasyonu ve sinir sistemi hastalıkları nın incelenmesinde kullanılabilir. Diferansiyel sindirim adımının zamanını daha iyi kontrol etmek ve deneysel adımların anlaşılmasını kolaylaştırmak için deneyselliği temsil edebileceğimizi gösteriyoruz.Patlamak için arka deride üç santimetrelik bir kesi yapmak için makas kullanın. Omuriliği çıkar. Omuriliği ortaya çıkarmak için vertebrakanalını dikkatlice açın.Bir 60 milimetre Petri çanak içinde omurilik Dantel, buz soğuk D Hanks bir diseksiyon mikroskop altında tuz çözeltisi dengeli üç ila dört mililitre ile, ventral kök ve dorsal kök çıkarmak. Buz soğuk D Hanks dengeli tuz çözeltisi yerleştirin. HBSS çıkardıktan sonra, makas ile, üç ila beş milimetrelik parçalar halinde sinirlerdilim.0.25% tripsin bir mililitre ekleyin ve beş mililitre santrifüj tüpler için sinir parçaları aktarın. 37 derecede 18-20 dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, sindirimi durdurmak için, % 10 fetal sığır serumu içeren DMEM üç ila dört mililitre ekleyin.Pipet karışımı yukarı ve aşağı yavaşça yaklaşık 10 kez. 5 dakika

purification-fibroblasts-schwann-cells-from-sensory-motor-nerves

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, sıçan embriyolarından dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarını izole etmek ve olgun Schwann hücreleri oluşturmak için bunları Schwann hücre öncüleri ile birlikte kültürlemek için bir prosedürü göstermektedir. İzole edilen DRG'ler, nöronları ve glial hücreleri izole etmek için işlenir. İzole edilen hücreler, nöronları saflaştırmak için kültürlenir ve daha sonra bir ko-kültür ortamında Schwann hücre benzeri hücreler (SCLC'ler) ile birlikte kültürlenir. DRG nöronları ile etkileşim,...

DRG Nöronlarının İzolasyonu ve Schwann Hücreleri Oluşturmak için Schwann Hücre Öncüleri ile Kokültür

Bu video, insan dermis dokularından Schwann hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için bir protokol göstermektedir. İnsan dermisi, fibroblastlar ve Schwann hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri içerir. İzolasyondan sonra, hücreler çoğalan fibroblastları ortadan kaldırmak için bir antimitotik ajan ile muamele edilir ve bu da saf bir Schwann hücresi kültürü ile sonuçlanır.

İnsan Dermisinden Primer Schwann Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Bu video, fare omurga köklerinden Schwann hücrelerinin izolasyonunu ve kültürlenmesini özetlemektedir. İzole edilen hücreler daha sonra spesifik ortamda kültürlenir. Schwann hücreleri, diferansiyel sindirim ve aderans yoluyla izole edilir. Daha sonra bağlanma ve çoğalma için hücre dışı matris kaplı lamellere aktarılırlar.

Schwann Hücrelerinin Fare Omurga Köklerinden İzolasyonu

Bu video, bir dorsal kök ganglion eksplant ve Schwann hücrelerinin kokülasyon modelini göstermektedir. Kokültür koşullarında, askorbik asit, Schwann hücrelerinin miyelinatör formlara farklılaşmasını teşvik eder. Miyelinizan Schwann hücreleri, sinir fonksiyonu için gerekli olan bir miyelin kılıfı oluşturmak için aksonları birden çok kez sarar.

Nöron Miyelinasyonu için Dorsal Kök Ganglion Eksplantının Schwann Hücreleri ile Birlikte Kültürlenmesi

Bu video, Schwann hücrelerini fare siyatik sinir liflerinden izole etmek için bir yöntemi göstermektedir.

Schwann Hücrelerinin Fare Siyatik Sinirlerinden Manyetik Olarak Ayrılması

Kaynak: Han, J., et.al. İn Vitro Periferik Sinir Rejenerasyonu için Nanosaniye Darbeli Elektrik Alanı ile Schwann Hücre Büyümesinin Düzenlenmesi. J. Vis. Uzm. (2024)Bu video, Schwann hücresi (SC) büyümesini modüle etmek için nanosaniye darbeli elektrik alanı (nsPEF) tekniğinin uygulanmasını göstermektedir. Hızlı elektrik darbeleri, SC membranlarında geçici nanogözenekleri indükleyerek, SC proliferasyonunu, farklılaşmasını ve nörotrofik faktör sekresyonunu yönlendiren sinyal yollarını aktive...

Nanosaniye Darbeli Elektrik Alanı Tekniği Kullanılarak İn Vitro Schwann Hücre Büyümesinin Düzenlenmesi

Bu makale, biyokimyasal ve immünositokimyasal analizler için büyük miktarlarda saf aksonal numune elde etmek için kullanılabilecek bir nöronal kültür sistemini açıklamaktadır. Bu teknik, normal aksonal fizyolojinin ve nörodejenerasyona yol açan sinyal yollarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Biyokimyasal Analiz için Duyu Nöronlar gelen üretim ve Aksonlar izolasyonu gözenekli Filtre Kullanma

Sinirsel potansiyeli olan ilik stromal hücreleri (MSC'ler) kemik iliğinde mevcuttur. Protokolümüz hipoksik ön koşullandırma yoluyla bu hücre popülasyonunu zenginleştirir ve bundan sonra onları olgun Schwann hücreleri haline getirir.

Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Dorsal kök gangliyonları ve Schwann hücrelerinin kokültür sisteminde, periferik sinir sisteminin miyelinasyonu incelenebilir. Bu model, periferik miyelinasyonu gözlemlemek ve ölçmek ve ilgilenilen bileşiklerin miyelin kılıfı üzerindeki etkilerini incelemek için deneysel fırsatlar sunmaktadır.

Sıçan dorsal kök ganglion eksplantları ve schwann hücrelerinin bir kokültüründe periferik aksonların in vitro miyelinasyonu

Burada, Schwann hücrelerini in vitro olarak uyarmak için nanosaniye darbeli elektrik alanı (nsPEF) uygulamak için bir protokol sunuyoruz. İlgili faktörlerin ve hücre davranışı değişikliklerinin sentezi ve salgılanma yeteneği, nsPOF kullanılarak başarılı stimülasyonu doğruladı. Çalışma, periferik sinir rejenerasyon yönteminin olumlu bir görünümünü vermektedir.

İn Vitro Periferik Sinir Rejenerasyonu için Nanosaniye Darbeli Elektrik Alanı ile Schwann Hücre Büyümesinin Düzenlenmesi

Öğrenin duyusal ve motor sinirlerden fibroblast ve Schwann hücrelerinin in vitro izolasyonunu. Bu yöntem sinir rejenerasyonu ve sinir sistemi hastalıkları üzerine araştırmalar için yüksek saflıkta hücre sağlar.

Fibroblastların ve Schwann Hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması

Daha fazla video keşfet