Kantitatif Kromozom Konformasyon Yakalama (4C) ile Embriyoid Cisimlerde Arttırıcı-Organizatör Kontalarının Belirlenmesi

Genlerin hassas spatiotemporal düzenlemesi aralarında etkileşim edebilen çeşitli cis-düzenleyici elementler tarafından kontrol edilir. Protokolümüz, organizatörler gibi seçilmiş locilerin kromatin kontalarını nicel olarak sorgulamayı mümkün kılar. Bu teknik, çeşitli düzenleyici unsurlar arasındaki etkileşim sıklıklarını aynı anda belirlememize ve ölçmemize olanak tanır.

Embriyoid cisimler oluşturmak için, fare embriyonik kök hücreleri% 60 birleşme için culturing ile başlar. Sonra kültür ortamını çıkarın ve iki mililitre sterilpişmiş PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi tamamen çıkarın ve iki mililitre hücre ayırma ortamı ekleyin.

Kültür yemeğini 37 derecede kuluçkaya yatırın. Beş dakika kuluçka sonra, çanak IÇIN EB farklılaşma orta sekiz mililitre ekleyin. MESC kolonilerini tek hücreli süspansiyon elde etmek için ayırmak için, orta daki pipetleri 15-20 kez yukarı ve aşağı layın ve süspansiyonu 10 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri oda sıcaklığında 300 kez 5 dakika santrifüj edin. Sonra dikkatle supernatant çıkarın. Hücreleri sayarak, EB farklılaşma ortamı ile hücre pelet resuspend.

15 santimetrelik bir kültür yemeğinin kapağını ters çevir. 200 mikrolitrelik çok kanallı pipet kullanarak, kapak üzerinde resuspended hücrelerin 20 mikrolitre damla mevduat. Kapağı dikkatlice ters çevirin ve kültür yemeğinin alt kısmına yerleştirin.

Üç gün boyunca asılı damla ile çanak kuluçka. Kuluçkadan sonra hücreleri toplamak için kapağı 10 mililitre PBS ile hafifçe yıkayın. EB'leri içeren PBS'yi 50 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın.

Tüp oda sıcaklığında 30 dakika oturduktan sonra, dikkatle supernatant çıkarın. EB'ler tüpün altında bırakılacak. EB'leri 10 mililitre taze EB farklılaştırma ortamında yavaşça askıya alın.

Süspansiyonu 10 santimetrelik bakteriyolojik Petri kabına aktarın. Üç ila altı gün sonra, EB oluşumunu kontrol etmek için ters bir mikroskop kullanın. EB'ler yuvarlak ve homojen boyutlarda olmalıdır.

50 mililitrelik plastik bir tüp içine iki veya üç 10 santimetrelik yemekler DEN EBs toplayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez g'de EBs santrifüj. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 10 mililitre PBS'deki EB'leri yeniden askıya alın.

EB'leri 300 kez g'de oda sıcaklığında santrifüj edin, bu sefer üç dakika. Supernatant çıkarın ve pelet için trypsin-EDTA iki mililitre ekleyin. Tüpü 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.

Kuluçka sırasında, pipet yukarı ve aşağı her üç dakikada bir tek hücreli süspansiyon elde etmek için. Tripsin reaksiyonunu durdurmak için sekiz mililitre EB farklılaştırma ortamı ekleyin. Taze EB ortamda hücreleri resuaskıya sonra, rotasyon altında oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücreleri kuluçka% 1 son konsantrasyonuna paraformaldehit ekleyin.

0.125 molar son konsantrasyonuna glisin ekleyerek formaldehit ifini söndürün. El yazmasında açıklandığı gibi fiksasyon işlemini tamamlayın ve hücre peletlerini sıvı nitrojenle dondurun. Hücre peletini taze hazırlanmış buz gibi lysis tamponu içinde yavaşça askıya alın ve tüpü buzüzerine yerleştirin.

15 dakika sonra hücreleri 1,000 kez g'de santrifüj edin ve dört santigrat derecede beş dakika bekleyin. Supernatant atın ve soğuk lysis tampon 500 mikrolitre ile pelet yıkayın. 1x tampon iki de 0,5% SDS 50 mikrolitre ile 1.5 mililitrelik bir tüp pelet resuspend ve 62 santigrat derece bir ısıtma bloğu tüpü yerleştirin.

10 dakika sonra, ısıtma bloğundan tüp çıkarın ve sindirim tampon ekleyin. Pipetleme yaparak, aşırı köpüklenmeyi önleyerek iyice karıştırın ve tüpü 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Verimli kısıtlama enzim sindirimsağlamak için, bu protokolde, sindirim tekrarlayan bir adım dahil ettik.

Bu nedenle sindirim tamponundaki çekirdekleri yeniden askıya almak da önemlidir. Sindirim tampon başka 25 mikrolitre ekleyin, ters karıştırArak, ve sindirilmemiş bir kontrol olarak sekiz mikrolitre almak. Sindirilmemiş kontrol örneğini negatif 20 santigrat derecede saklayın.

Daha sonra, her aliquot sonra rotasyon altında 37 santigrat derece kuluçka, kısıtlama enzimMbol birkaç aliquots ekleyeceğiz. Sindirilmiş kontrol numunesi olarak sekiz mikrolitre alın. Her iki kontrol örneğini de-crosslink için, bir saat boyunca 65 santigrat derece proteinaz K.Incubate 10 mikrolitre TE tampon 80 mikrolitre ekleyin.

Sindirim verimliliğini kontrol etmek için, %0,6 jel üzerinde 20 mikrolitre lik aliquot çalıştırın. Başarılı sindirim çoğunlukla 3.0 ila 5.0 kilobase çiftleri aralığında parçalar göstermektedir. El yazmasında açıklandığı gibi, DNA'yı kırpma için hazırlayın.

150 ila 700 baz çifti boyutunda DNA kesme için bir sonicator kullanın. Yıkınılmış DNA'yı normal yeni bir güvenli kilit tüpüne aktarın, aynı örnekten birden fazla sonications biraraya. Isınmış DNA arınma boncuklarını mevcut hacmin 1,8 katına eşit bir miktarda ekleyin ve yeniden sulandırarak karıştırın.

Kuluçka beş dakika sonra, bir manyetik raf ile boncuk toplamak. Tüpleri manyetik rafta tutarak, boncukları bir mililitre taze hazırlanmış %80 etanolle iki kez yıkayın. 2-3 dakika oda sıcaklığında boncukhava kurutma sonra, 1x Tris tampon boncuklar resuspend tarafından DNA'yı esuute.

Asma-damla yöntemi kullanılarak, ESC farklılaşmasının indüksiyonundan altı gün sonra homojen bir EB popülasyonu elde edildi. Jel elektroforezi, kalite kontrol protokolü boyunca uygulandı. Mbol tarafından verimli sindirim az üç kilobaz çiftleri parçaları ile sonuçlanır.

Ligasyon sonrası elektroforez, çoğu parçanın üç kilobaz çiftten daha büyük olduğunu gösterdi. Sonication sonra 400 ila 500 baz çiftleri parça boyutları bekleniyor. Defosforilasyon ve tek uçlu adaptör ligasyonundan sonra, ilgi çekici hedefleri yükseltmek için iki tur PCR yapıldı.

Her hedef, Pou5f1 locus'u için A ve B olmak üzere iki farklı astar çifti ve T çekirge için C ve D olmak üzere ayrı ayrı güçlendirilmiştir. Bu da yaklaşık 400 baz çiftinin DNA smearlanmasıyla sonuçlandı. Alternatif olarak, a ve c hedeflerini aynı anda yükseltmek için multipleks PCR yapıldı ve arınma sonrası benzer bir parça boyutu elde edildi.

Bu 4C profillerde, açık mavi kutular farklılaşma sırasında dinamik değişikliklerle artırıcıların konumunu gösterir. Kromatin bölgeleri EB farklılaşması sırasında Pou5f1 ve T genlerinin organizatörleri ile temas alar. Pou5f1 EB farklılaşması sırasında indirgendi.

Tersine, T EB farklılaşması sırasında upregulated oldu. Verimli restriksiyon enzim sindirimi ve geçiş genomik DNA'nın yakınlık ligasyonu bu protokolün başarısını sağlamak için önemli faktörlerdir. Başka bir şey her locus temas haritası sorgulamak için astar tasarımıdır.

Bu prosedür, hedeflenen loci de kromatin temas sorgulamak için idealdir. Küresel değişiklikler gerekiyorsa, Hi-C, promotör yakalama Hi-C veya HiChIP gibi genom çapında yaklaşımlar yapılabilir.