Name: Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin, Drosophila larva ve pupa testislerinin canlı, sağlam dokuda hücre bölünmesi analizi için floresan mikroskopiyle nasıl hazırlandığını. Bu yöntem, hücrelerin fizyolojik ortamını koruyarak canlı görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Savunma Bakanlığı'nın J.T.S.'ye verdiği başlangıç fonları tarafından desteklendi.

1. Diseksiyon için Hayvanları, Araçları ve Medyayı Hazırlayın
<ol><li>Çapraz erkek ve kadın istenilen genotip atasını elde etmek için uçar. Meyotik spermatositlerin tanımlanması ve evrelemesi için yararlı transgenik belirteçler, kromozomlarıetiketlemekiçin GFP-tubulin ve rfp-histon 2A'yı etiketlemek için kromozom8 içerir. Çapraz başına beş ila on kadın kullanın ve üçüncü yıldız larvaları şişenin kenarlarında (4-5 gün) sürünmeye başlayana kadar 25 °C'lik bir kuluçka makinesinde standart sinek yiyeceğinde haçlar kullanın. Erken beyaz pupa bir gün sonra oluşmaya başlayacak.</li>
	<li>İnce uçlu iki çift düz forceps elde edin. Uçların keskin, hatta uzunlukta ve düz olduğundan emin olun (Şekil 1A). Bu forsepsleri yalnızca diseksiyonlar için kullanın ve kullanılmadığında 10 μL pipet uçları yla kaplayın.</li>
	<li>
Bir neşter aleti hazırlayın.
	<ol>
<li>Siyah anodize edilmiş çelik böcek piminin künt ucunu bir pim tutucuya takın ve pimi yerinde sabitlemek için tutucunun vidasını bükün. Bir çift forseps kullanarak ve bir kesme mikroskobu altında, ortasındaki böcek iğnesini kavrar ve 135° bir iç açı oluşturacak şekilde bükün(Şekil 1B). Keskin uç doku kesmek için, kenar medya damlaları arasında testis aktarmak için kullanılırken.</li>
		<li>Kullanılmadığında 1.000 μL pipet ucu ile kap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku kültürü başlığında çalışarak, Schneider'ın medyasından 5 mL aliquot hazırlayın ve kullanım saatine kadar 4 °C'de saklayın. Diseksiyon lara başlamaya hazır olduğunuzda, oda sıcaklığına kadar 5 mL'lik bir ortam ısıtın. Daha sonra ısıtılmış diseksiyon ortamını 10 mL şırıngaya aktarın ve 0,22 m şırınga filtresi takın.</li>
</ol>2. Larva ve Erken Pupa testislerinin diseksiyonu
<ol><li>Bir cam kaydıranın üst, orta ve alt kısmındaüç damla (her biri 50°L) dışarı atmak için ortam dolu filtre şırıngını kullanın.</li>
	<li>Beş ila on üçüncü instar larvaları veya erken pupa (hala beyaz veya sarı pupa) üst damla aktarmak için bir kesme prob kullanın. Hafifçe herhangi bir gıda veya enkaz kaldırmak için diseksiyon sondası ile medyada larva ve pupa çalkalayın.</li>
	<li>Bir diseksiyon mikroskobu altında, vücudun arka üçüncü oval şekilli yarı saydam yapılar olarak görünen iki ikili testisleri tanımlamak için bir diseksiyon sondası ile yan tarafında tek bir larva veya pupa açın(Şekil 2A, B). Testisleri olmayan hayvanlar dişidir ve atılmalıdır.</li>
	<li>Bir erkek larva veya pupa bulunduğunda ve temiz olduğunda, medyanın ikinci damlasına taşıyın. 3 veya 4 erkek larva ve/veya pupa medyanın ikinci damlasına aktarılana kadar tekrarlayın.</li>
	<li>Medyanın ikinci damlasında çalışmak, tek bir erkek larva veya pupa ile orta bölgesinde bir çift forceps kavramak, sadece testisler için ön. Hayvanı yavaşça ikiye ayırmak için ikinci çift forceps'u kullanın.</li>
	<li>Larva veya pupanın arka ucunu bir çift forceps ile cam kaydırak üzerinde tutun. Ponpların hemen yanından başlayarak, neşter aracının kenarını kullanarak miteyi aşağı itin ve neşteri hayvanın kesilen ucuna doğru hareket ettirin. Bu bağırsaklar, yağ organları ve testisler dahil hayvanın iç organları, dışarı atacaktır.</li>
	<li>Testisleri diğer organlardan ayırın. Testisler açık, yağ vücut şeritler gömülü oval şekilli organlar (Şekil 2C).</li>
	<li>Testisleri birer birer üçüncü ortam düşüşüne aktarın. Bunu başarmak için, yağ gövdesi altında neşter kenarına eklemek, ortamdan doku kaldırın ve hızlı bir şekilde üçüncü damla hareket ettirin.</li>
	<li>Alternatif olarak, hala başarılı bir şekilde doku kaldırmak için testisler bağlı yeterli yağ vücut yoksa, yavaşça diseksiyon ortamı ile önceden ıslak olan bir cam Pasteur pipet kullanarak doku transferi.</li>
	<li>Neşter aletinin keskin ucunu kullanarak aşırı yağ gövdesini testislerden hafifçe dilimleyin, kenarlarda sadece küçük bir yağ kenarı bırakarak kullanın(Şekil 2C). Tüm yağ vücut kaldırmak için gerekli değildir, ve bunu yapmaya çalışırken büyük olasılıkla zarar veya testislerin yırtılması neden olacaktır.</li>
	<li>Cam slayt üzerinde erkek larvatüm yukarıdaki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Adım 3'e veya adım 5'e geçin.</li>
</ol>3. Canlı Mikroskobik Görüntüleme Için Montaj Testisleri
NOT: Bu montaj prosedürü Drosophila larva beyin nöroblastları görüntüleme için yeni yayınlanan bir protokol uyarlanmıştır20. Bu başvuruda ek ayrıntılar bulunabilir.
<ol><li>50 mm gaz geçirgen kültür yemeğinin ortasına Schneider'ın medyasından (yaklaşık 30°L) tek bir damla sını (yaklaşık 30°L) yatırmak için filtre şırıngasını kullanın.</li>
	<li>Hazırlanan testisleri gaz geçirilme çanağı üzerindeki damlaya aktarmak için önceden ıslak pasteur pipeti kullanın. Testisler genellikle damla yüzeyine yüzer.</li>
	<li>Testisleri gaz geçirilebilir membrana hafifçe itmek için neşter aletikullanın. Neşterin keskin noktası ile gaz geçirilebilir membran yırtMak için dikkat edin. Tüm testisleri damlanın ortasına doğru itin.</li>
	<li>Gaz geçirgen membranÜzerinde her biri yaklaşık 30°L olmak üzere dört damla yağ yapmak için halokarbon yağıyla dolu 1 mL'lik bir şırınga kullanın. 22 mm'lik cam kapak lı bir kapağın dört köşesine karşılık gelecek şekilde testisleri içeren ortam damlasının etrafına yağ damlalarını boşluk bırakın.</li>
	<li>22 mm'lik cam kapak lı bir kapağın köşelerini dört damla halokarbon yağıyla hizalayın ve coverslip'i hafifçe ortama ve yağa indirin. Coverslip yerleşmek ve testisler içeren medya petrol damlaları arasında yayılmasını bekleyin.</li>
	<li>Coverslip'in testislerin yüzeyine yerleşmesine izin vermek için fazla ortamı çıkarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında testisler gözlemlerken, sıvı küçük bir miktar uzakta wick için kapak altında ortama hassas bir görev silme köşesi ekleyin. Cam kapak kayma sadece en büyük testis yüzeyi ile temas edene kadar wick yeterli medya. Bu testisler üzerinde baskı uygulamak ve yırtılma neden olacak gibi çok fazla medya kaldırmak ve coverslip çok uzak düşürmek için önemlidir (Şekil 5'ebakınız).</li>
</ol>4. Meiyotik Spermatositlerin Canlı Görüntülenmesi
NOT: Spermatositler lazer tarama veya dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Sistem, floresan proteinlerin fotobeyazmasını veya dokunun fotohasarından kaçınmak için yeterli hız ve duyarlılığa sahip olmalıdır.
<ol><li>Testislerin hemen üzerinde cam kapak üzerine bir damla daldırma yağı yerleştirin. Çanak üzerinde çevirin ve mikroskop aşamasında yerleştirin ve testisler hemen altında olana kadar yağ içine mikroskop hedefi (40x veya 60x) taşıyın. Tek bir testis bulmak ve odak haline getirmek için iletilen ışığı kullanın.</li>
	<li>Konfokal ile hızlı görüntüler yakalarken, hücrelerin organizasyonunu incelemek için testis'i hareket ettirin. Testislerin bir ucunda çok sayıda küçük, yoğun paketlenmiş hücre bulunur. Bu uç germline kök hücreleri ve spermatogoniiçerir. Organın diğer ucuna doğru hareket, ayrıkümeler veya kistler halinde organize giderek daha büyük hücreleri belirlemek. Bu büyük hücreler spermatositlerdir (Şekil 3A).</li>
	<li>GFP-tubulin görüntüleme ise, hücrenin korteksinde bulunan iki parlak mikrotübül asterin (yani, centrozomlar) varlığı ile 30-60 dakika içinde meyozasyon başlayacak spermatositleri tanımlayın(Şekil 3B, C).</li>
	<li>Bir kez meyotik spermatosit bir kist tespit edilmiştir, zaman içinde görüntülerin z-yığınları yakalamak için edinim parametreleri kurmak. Tipik olarak, z boyutunda 1,5 μm aralıklı 15-20 görüntü elde etmek aynı kist içinde çeşitli spermatositlerin tam hacmiyakalamak için yeterlidir.</li>
	<li>Yaklaşık 1,5 saat süren ilk meyotik bölümün tamamını görüntülemede her 2 dakikada bir tam z-yığınları edinin. Özellikle sadece belirli bir meyozolayı nın incelenmesi durumunda daha hızlı edinme oranları kullanmak mümkündür. Ancak, örneğin lazer uyarma sına tekrar maruz kalmasına bağlı olarak fotobeyazrlama veya fotohasara neden olmamak için dikkatli olmaya özen.</li>
	<li>Satın alma uzun zaman boyunca odak kayması önlemek için sürekli, otomatik odaklama kontrol sistemi kullanın. Numunenin mikroskop aşamasında ki sıcaklık kontrolü genellikle 22-23 °C oda sıcaklığında olduğu varsayılsa gerekli değildir. Sıcaklık kontrolü varsa, numuneyi mikroskop aşamasında 25 °C'de saklayın.</li>
	<li>Meyotik spermatosit bulunamazsa, numuneyi birkaç saat veya gece boyunca 25 °C'lik bir kuluçka makinesinde ve görüntüde tekrar saklayın.</li>
</ol>5. Fiksasyon ve İmmünBoyama
<ol><li>Yukarıdaki adım 2.10 itibaren, PBSTx 0.5 mL içeren 9 kuyulu cam diseksiyon çanak bir kuyuya testisaktarmak için bir cam Pasteur pipet kullanın (fosfat% 0.3 Triton X-100 ile tamponlu salin). Testislerin yemeğin altında olduğundan emin olun. NOT: Paraformaldehit toksiktir ve duman kaputunda eldivenlerle işlenmelidir.</li>
	<li>Testisleri oda sıcaklığında 20 dk olarak düzeltin.</li>
	<li>Testisleri 0,5 mL PBSTx içeren bir kuyuya aktarın. 5 dakika boyunca hafif ajitasyonla yıkayın. Taze PBSTx ile yeni kuyularda yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>1,5 mL mikrosantrifüj tüpte %5 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren 0,5 mL PBSTx'te primer antikorları istenilen konsantrasyona seyreltin. Testisleri 9 kuyulu cam kesme kabından seyreltilmiş primer antikor tüpüne aktarın ve bir gecede 4 °C'de hafif sallanan veya fındıkla kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Testisleri 0,5 mL PBSTx'te 5 dakika boyunca 9 kuyulu cam diseksiyon kabında yıkayın. Taze PBSTx ile yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>%5 BSA içeren 250 μL PBSTx'teki sekonder antikorları seyreltin ve 9 kuyulu cam kesme kabının temiz bir kuyuya dağıtın. İstenirse, DNA leke için DAPI ekleyin. Testisleri ikincil antikor içeren kuyuya aktarın, plastik sargı ile kaplayın ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca hafif ajitasyon la karanlıkta kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Testisleri 0,5 mL PBSTx ile dolu temiz bir kuyuya aktarın. 5 dakika boyunca iki kez taze PBSTx ile yıkayın ve 30 dakika boyunca üçüncü kez yıkayın.</li>
</ol>6. Montaj Sabit Testisler
<ol><li>Testisleri son yıkamadan pasteur pipeti kullanarak cam mikroskopi slaytına aktarın. Gerekirse, testisleri slayt yüzeyine itmek için neşter aracının kenarını kullanın.</li>
	<li>Testislerden fazla sıvıyı uzaklaştırmak için hassas bir görev silme nin köşesini kullanın. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın.</li>
	<li>Testislere 30-50 μL'lik bir damla mikroskopi montaj ortamı uygulayın.</li>
	<li>Montaj ortamının damlasına 22 mm'lik bir kapak kayması yerleştirin ve coverslip'in yerleşmesine ve montaj ortamının kapak altına yayılmasına izin verin. Aşırı montaj ortamını sıkmak için gerekirse coverslip'e hafif basınç uygulayın ve örtünün testislerin yüzeyinde dinlenmesine izin verin.</li>
	<li>Kapak kayma kenarları mühür için oje kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).</li>
<li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li>
<li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycling+through+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li>
<li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li>
<li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractured+genome+of+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111(2013).</li>
<li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Meiosis+to+Mitosis%3A+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li>
<li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).</li>
<li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456(2019).</li>
<li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li>
<li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8(2004).</li>
<li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li>
<li>Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460(2012).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li>
<li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li>
<li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li>
<li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+spermatogenesis%3A+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058(2014).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li>
<li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li>
<li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure%2C+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li>
<li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li>
<li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li>
<li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTates%2C+AD+%22Cytodifferentiation+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+An+electron+microscope+study%22">Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study</a>. , (1971).</li>
<li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868(2014).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li>
<li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Spermatosit hücre bölünmesinin uzun süreli canlı görüntülemesi için optimize edilmiş larva veya erken pupal Drosophila testislerinin hazırlanması için bir protokol tanımladık. Bu bozulmamış doku fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi analizi için güçlü bir yöntemdir. Bu yöntemin gücü, spesifik gen mutasyonları, dokuya özgü RNAi aracılı baskılama ve floresan olarak etiketlenmiş protein ve organel belirteçleri gibi Drosophila genetik araçlarıyla birleştirildiğinde daha da genişletilir. Buna ek olarak, larv...

Hücre bölünmesi genellikle kültür1yetiştirilen hücre hatları kullanılarak incelenir. Biz bu çalışmalardan temel mekanizmaların paha biçilmez bir anlayış ve anlayış zenginliği kazanmış olsa da2, kültürde yetiştirilen hücreler tam olarak bozulmamış, canlı doku oluşur gibi hücre bölünmesi fizyolojisi özetlemek olamaz. Örneğin, bozulmamış doku ve organlarda, hücreler doğru yerde ve doğru zamanda bölmek gerekir, böylece döl hücreleri düzgün doku içinde yer, böylece uygun farklılaşma veya fonksiyonel programlar geçirebilir, ve böylece hücre çoğalması düzgün doku büyüme veya homeostaz ile koordine edilir3. Öte yandan kültürde yetişen hücreler için hücre bölünmesi genellikle kültür ortamı4'tekibüyüme faktörleri tarafından düzenlenir ve bu nedenle doku mimarisi veya gelişimsel sinyalizasyon gibi canlı çevresel faktörlerin bölünme sürecini nasıl etkilediğini bu hücrelerden öğrenemeyiz. HeLa ve U2OS hücreleri gibi hücre bölünmesini incelemek için kullanılan hücre hatlarının birçoğunun metastatik tümörlerden elde edildiğini belirtmek de önemlidir5. Bu nedenle, bu kanser hücrelerinin temel fizyolojisi birçok yönü, hücre döngüsü düzenleyici mekanizmalar ve kromozomal stabilite gibi, büyük olasılıkla sağlıklı hücrelere göre değiştirilmiştir. Hücre bölünmesi fizyolojisinin tam olarak anlaşılması, bu nedenle, fizyolojik düzenleyici mekanizmaları ve doku mimarisini koruyan, yerli, in vivo ortamlarda bölen hücreleri inceleme yeteneğimize bağlıdır.
Hücre bölünmesinin bozulmamış doku ve organlar da nasıl işlediğini anlamadaki gelişmeler, in vivo veya ex vivo analizine doğal zorluklar nedeniyle engellenir. İlk olarak, büyük organlar veya kalın dokular içinde mikroskobik analiz için bölen hücrelere erişmek zor veya imkansız olabilir. İkinci olarak, genellikle tek tek hücrelerin in vivo bölmek ne zaman tahmin etmek zordur. Üçüncü olarak, doku fizyolojisi hızla ex vivo kültür sırasında bozulabilir. Bu protokolde, Drosophila melanogaster spermatositlerin tam bozulmamış testisler içinde meyotik hücre bölünmeleri geçirerek canlı ve sabit analizi için kolayca erişilebilir yöntemleri açıklıyoruz. Bu hücreler canlı, ex vivo analiz için idealdir çünkü konfokal mikroskopi gibi standart optik yöntemlerle kolayca erişilebilirler, öngörülebilir zamanlarda ve konumlarda bölünürler ve bozulmamış testisler ex vivo kültüründe yaklaşık 24 saate kadar muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, Drosophila spermatositler büyük yuvarlak hücrelerdir (yaklaşık 20-30 μm çapında) bölündüklerinde şekil değiştirmeyen, onları yüksek çözünürlükte, mil aparatı ve sitoplazmik organeller gibi hücresel bileşenlerin hızlandırılmış görüntülemesi için ideal hale getirir. Bu hücreler mitoz yerine meyozis geçmesine rağmen, temel hücre bölünmesi süreçlerinin çoğu bu iki hücre bölünmesi mekanizmaları arasında çok benzer6. Bu avantajlar, güçlü Drosophila genetik araçları ile birlikte, Drosophila spermatositler mil oluşumu ve düzenleme, sitokinenzis ve organel remodeling ve bölümleme7dahil olmak üzere temel hücre bölünmesi süreçlerinin ex vivo analizi için yaygın olarak kullanılan bir model yaptık7 ,8,9,10,11.
Spermatositler spermatogenezin meyotik evresinde olan hücrelerdir. Drosophilayılında, spermatogenez testis bir kutup küçük bir bölgede veya "hub" bulunan germline kök hücrelerin bir grup ile başlar12,13. Bu hücreler asimetrik bir mitoz bölünme, tek bir farklılaştırılmış spermatogonium yol açan. Spermatogonia sonra tek bir kist içinde yakından ilişkili kalır 16 hücrebir grup üretmek için dört senkron mitoz geçmesi. Bu aşamada hücreler mitotikten meyotik hücre döngüsüne geçiş tevesyetik olarak adlandırılırlar. Spermatositler hücre döngüsünün genişletilmiş bir G2 aşamasında yaklaşık iki ila üç gün geçirmek, sırasında onlar dramatik büyümek ve iki meiyotik bölünmeler ve sonraki spermiyogenez için hazırlık sitolojik değişikliklere uğrar13,14. Tek bir kist içinde 16 spermatosit tüm grup daha sonra aynı anda ilk meyotik bölünme girin. Böylece, birkaç meyotik spermatosit hücre bölünmesi ile devam ederken aynı anda görüntülenebilir. İlk meyotik bölünme yaklaşık 1,5 saat devam eder ve hemen ikinci meyotik bölünme tarafından takip edilir, olgun spermatozoa içine ayırt etmek için devam 64 toplam spermatidler verim.
Canlı hücre bölünmesi ni incelemek için spermatosit kullanmanın eşsiz bir avantajı, bozulmamış doku grupları nın veya hücrelerin kistlerinin spermatogenezin farklı aşamalarında sürekli ilerlemeleri dir ve spermatogenezin tüm aşamalarındaki hücreler genellikle herhangi bir testiste tanımlanabilir (Bkz. Şekil 3A). Bu nedenle, tüm testislerde meyotik hücreleri bulmak nispeten kolaydır. Bu hücreler yüksek çözünürlüklü görüntülemeye çok daha büyük ve daha elverişli olduğu için genellikle analizlerimizi ikinci meyozisyerine ilkine odaklarız, ancak her iki meyyotik bölümü de kapsayan tüm süreç başarılı bir şekilde görüntülenebilir. Ayrıca testis hazırlık ve kültür için genel protokol spermatogenez diğer süreçleri analiz etmek için de kullanılabilir unutulmamalıdır, önceki mitotik kök hücre veya spermatogonial bölünmeler veya spermatidler spermatozoa içine olgun olarak meydana gelen sitolojik değişiklikler gibi15. Spermatogenezbu yönlerinin çoğu drosophila ve insanlar arasında son derece korunur16.
Drosophila spermatositler Drosophila gelişiminin üçüncü instar larva evresi sırasında spermatogenezin meziyotik fazulaşmaya başlar13. Bu nedenle, üçüncü instar larvaları ile başlayan ve pupa ve yetişkinler de dahil olmak üzere yaşam döngüsü aşamalarından izole testisler spermatositlerin bölünmesi analizi için kullanılabilir. Spermatogenez17,18,,19canlı ve sabit analiz için yetişkin erkek sinekler testislerinin çıkarılması için çeşitli mükemmel protokoller mevcuttur. Bu protokoller spermatogenezin geç evrelerinin incelenmesi veya sadece yetişkinlerde görülebilen genetik belirteçlerin kullanılması gerekiyorsa tercih edilebilir. Protokol bunun yerine larvave erken pupadan testis hazırlığına odaklanır, çünkü bu aşamalarda testislerin özellikle yüksek çözünürlüklü, hızlandırılmış mikroskopi ile hücre bölünmesi analizine uygun çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, larva ve pupa testisleri yetişkinlerden daha küçüktür ve organ içindeki hücreler daha az kalabalıktır. Bu nedenle, spermatositlerin bölünmesi genellikle larva testislerinin dış yüzeyine yakın, ışık saçılma dokusunun birden fazla katmanından nüfuz etmek zorunda kalmadan görüntülenebilir. İkinci olarak, erişkin testisler bağlı aksesuar organların kasılmaları nedeniyle ritmik hareket, ve bu hareketler bireysel hücrelerin zaman atlamalı görüntüleme zor olun. Ve üçüncüsü, larva testisleri pupal veya erişkin öldürücüye neden olan gen mutasyonlarını incelerken avantajlıdır. Yöntemlerimiz mikroskop aşamasında testislerin uzun vadeli kültür için optimize edilmiştir, hücre bölünmesi birden fazla tur görüntüleme veya aynı hazırlık spermatogenez birden fazla aşamada bireysel hücrelerin ilerlemesi için izin. Ayrıca tüm testislerin fiksasyonu ve immünboyması için bir protokol uyguluyoruz. Genel olarak, protokollerimiz özellikle bozulmamış dokuda hücre bölünmesi eğitimi almak isteyenler için yararlıdır ve spermatosit analizini yüksek derecede çekici Drosophila genetik araçlarıyla birleştirme yeteneği bu özellikle güçlü bir yaklaşım dır.

<table><tbody><tr><td>5" Diseksiyon Probu</td><td>Fisher</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>5.75" Cam Pastör Pipet</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td>İnce uçlu düz forcepts</td></tr><tr><td>Buzlu Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td>Buzlu yazı yüzeyli sabit doku montajı için slaytlar</td></tr><tr><td>Halokarbon yağı 700</td><td>Sigma</td><td>H8898-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Lumox Kabı 50</td><td>Sarstedt</td><td>SAR946077410</td><td>Gaz geçirgen doku kültürü kabı</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapağı Cam</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>22 mm x 22 mm, #1.5 cam lamel</td></tr><tr><td>Minutien</td><td>Pimleri Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-15</td><td>Böcek iğneleri yapmak için kullanılır neşter aracı</td></tr><tr><td>Nikel Kaplama Pim Tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit% 32 Çözelti, EM Sınıfı Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Plan Eğimli Kenar Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher</td><td>12-549-5</td><td>Diseksiyonlar için kullanılan slaytlar</td></tr><tr><td>PYREX Spot Plakaları</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>9 kuyulu cam diseksiyon kabı</td></tr><tr><td>Schneider'in Drosophila orta</td><td>boy Fisher</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtresi, 0.22 ve mikro; m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td>Mikroskopi montaj ortamı</td></tr></tbody></table>

drosophila larval ve pupal testislerinin canlı, sağlam dokuda hücre bölünmesi analizi İçin hazırlanması

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Hücre bölünmesinin canlı, bozulmamış doku ve organlarda bölünmesi, hücre bölünmesinin gelişim, doku homeostazları ve hastalık süreçleri ile nasıl bütünleşiştüğünün anlaşılması için deneysel analizler gereklidir. (1) spermatosit içeren tüm Drosophila testisleri nispeten mikroskopi için hazırlamak kolay, çünkü meyozis geçiren Drosophila spermatositler bu analiz için idealdir, (2) spermatositlerin büyük boyutu onları iyi yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun hale getirir, ve (3) güçlü Drosophila genetik araçları in vivo analizi ile entegre edilebilir. Burada, Drosophila üçüncü instar larvaları ve erken pupa tüm testislerin hazırlanması için kolayca erişilebilir bir protokol sıyoruz. Hazırlanan tüm testislerde meyotik spermatositlerin nasıl tanımlanabileceğimizi ve zaman atlamalı mikroskopi ile nasıl görüntülenebileceğimizi anlatıyoruz. Fiksasyon ve immünboyama tüm testisler için protokoller de sağlanmaktadır. Larva testislerinin kullanımı, spermatosit analizi nde yetişkin testislerini kullanan mevcut protokollere göre çeşitli avantajlara sahiptir. En önemlisi, larva testisleri erişkin testislere göre hücrelerle daha küçük ve daha az kalabalıktır ve bu spermatositlerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesini büyük ölçüde kolaylaştırır. Bu avantajları ve protokollerin uygulamalarını göstermek için, zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile görüntülenmiş tek bir spermatositte hücre bölünmesi sırasında iğ mikrotübüllerine göre endoplazmik retikulumun yeniden dağılımını gösteren sonuçlar sayılmaktadır. Protokoller floresan etiketli proteinler veya organel belirteçleri herhangi bir sayı ifadesi ile kombine edilebilir, yanı sıra gen mutasyonları ve diğer genetik araçlar, bu yaklaşım özellikle tüm doku ve organların fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi mekanizmalarının analizi için güçlü hale.

Bu protokol başarıyla yürütüldüğünde, testisler konfokal mikroskopi veya diğer floresan mikroskopi yöntemleri ile görüntüleme için tamamen bozulmadan kalacaktır. Şekil 3A'dagörüldüğü gibi testislerin hücresel organizasyonu korunur ve hücre farklılaşmasının testisin bir ucundan spermatogonia, spermatositler ve haploid spermatidler gibi diğer ucuna ilerlemesi görülebilir. GFP-tubulin spermatositlerin bölünmesini belirlemek ve hücrelerin meyozis yoluyla ilerlemesinicanlı görüntüleme için yararl...

Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Bu protokol, floresan mikroskopi kullanılarak canlı, bozulmamış doku bağlamında hücre bölünmesi mekanizmalarıanaliz etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücrelerin doğal fizyolojik ortamlarının korunması ve aynı zamanda uzun süreli kurslar da canlı görüntülemeye olanak sağlamasıdır. Bu tekniğin en önemli parçası, testislerin diseksiyon veya montaj sırasında zarar görmemesini sağlamaktır.Bu zaman ve uygulama biraz elde edilen bir beceridir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü testislerin nasıl tanımlanıp izole edilebildiğini ve dokuya zarar vermeden görüntüleme için nasıl monte edilebildiğini gösterir. El yazmasında açıklandığı gibi hayvanları, araçları ve medyayı hazırlayın.Diseksiyonu başlamadan önce, cam bir kaydıraktan her biri 50 mikrolitre lik üç damla medya çıkarmak için ortam dolu filtre şırıngasını kullanın. Bir diseksiyon sondası kullanarak, beş ila 10 üçüncü instar larvaları veya erken pupa slayt üzerinde medya üst damla aktarın. Hafifçe herhangi bir gıda veya enkaz kaldırmak için diseksiyon sondası ile medyada larva ve pupa çalkalayın.Tek bir larva veya pupa yan açmak için diseksiyon sondası kullanın. Vücudun arka üçüncü yarı saydam oval yapılar olarak görünen iki çift taraflı testisler arayın. Testisleri olmayan hayvanlar dişidir ve atılmalıdır.Bir erkek larva veya pupa bulunduğunda ve temiz olduğunda, medyanın ikinci damlasına taşıyın. Üç veya dört erkek larva veya pupa medyanın ikinci damlasına aktarılana kadar tekrarlayın. Sonra medyanın ikinci damlasında çalışırken, orta bölgesinde bir çift forceps ile tek bir hayvan kavramak, sadece testisler için ön.Hayvanı yavaşça ikiye ayırmak için ikinci bir çift forceps kullanın. Bir çift forceps kullanarak, cam slayt üzerinde hayvanın arka ucunu basılı tutun. Forceps hemen yanında başlayarak, neşter kenarını kullanarak mite aşağı itin.Neşteri hayvanın kesilen ucuna doğru hareket ettirin. Bu bağırsaklar, yağ organları ve testisler dahil hayvanın iç organları, dışarı atacaktır. Testisler renksiz ve neredeyse şeffaf oval organlar yağ vücut şeritler gömülü.Testisleri diğer organlardan ayırın. Testisleri teker teker aktarmak için, neşterin kenarını yağ gövdesinin altına yerleştirin, dokuyu ortamdan kaldırın ve hızlı bir şekilde üçüncü damlaya taşıyın. Yeterli yağ vücut hala neşter ile doku kaldırmak için testisler bağlı değilse diseksiyon orta ile önceden aşınmış olan bir cam Pasteur pipet kullanın.Orta üçüncü damla çalışma, yavaşça testislerden aşırı yağ vücut dilim lemek için neşter keskin ucunu kullanın, kenarlarında yağ vücut sadece küçük bir jant bırakarak. İlk olarak, 50 milimetrelik gaz geçirilebilir kültür çanak merkezine Yaklaşık 30 mikrolitre Schneider orta tek bir damla yatırmak için filtre şırınga kullanın. Neşter aracını veya önceden ıslanmış pasteur pipetini kullanarak hazırlanan testislerden beşine kadar çanak taki damlasına aktarılır.Daha sonra, testisleri gaz geçirilebilir membranın üzerine ve orta daki damlanın ortasına yavaşça itmek için neşter aracını kullanın. Bir mililitrelik şırınga kullanarak, orta damla çevreleyen gaz geçirilebilir membran üzerinde halokarbon yağı dört damla yerleştirin. Damlaların yerleri 22 milimetrelik bir kapak fişinin dört köşesine karşılık gelir.Daha sonra 22 milimetrelik cam kapak lı bir kapağın köşelerini dört damla halokarbon yağıyla hizalayın ve coverslip'i hafifçe ortama ve yağa indirin. Coverslip yerleşmek için izin verin ve testisler içeren medya için yağ damlaları arasında yayıldı. Kültür çanasını bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin.Fazla ortamı kaldırmak için, kapak altına hassas bir görev silme nin köşesini takın. Sadece en büyük testis yüzeyi ile temas yapmak için cam coverslip için yeterli medya wick uzakta. Çok fazla ortam çıkarmayın ve kapak kaymasını çok fazla düşürün.Bu testisler üzerinde baskı uygulayacak ve onları yırtılma neden olabilir. Son olarak, testislerin hemen üzerinde cam kapak üzerine daldırma yağı bir damla yerleştirin. Tabağı ters çevirin ve mikroskop aşamasına yerleştirin.Testislerin hemen altında olana kadar 40 veya 60 X mikroskop hedefini yağa taşıyın. Tek bir testis bulmak ve odak haline getirmek için iletilen ışığı kullanın. PBSTx'te 0,5 mililitre %8 paraformaldehiti dokuz iyi diseksiyon kabının bir kuyusu içinde yerleştirin.Testislerden 10'a kadarını kuyuya aktarmak için cam bir Pasteur pipeti kullanın. Testislerin kuyunun dibinde olduğundan emin olun. 20 dakika sonra testisleri 0,5 mililitre PBSTx içeren bir kuyuya aktarın.Beş dakika hafifçe çalkalayarak testisleri yıkayın. Taze PBSTx ile yeni kuyularda iki kez daha yıkayın. El yazmasında açıklandığı gibi 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde birincil antikor seyreltme hazırlayın.Daha sonra testisleri dokuz kuyu cam kesme çanaktan tüpe aktarın. Tüp gece boyunca dört santigrat derecede hafif sallanma veya fındık ile tüp kuluçka. Testislerin ikincil antikorla boyanma prosedürü benzerdir.Ayrıntılar için el yazmasına bakın. İlk olarak, pasteur pipetkullanarak, testisleri dokuz kuyu plakasından cam mikroskopi slaytına aktarın. Gerekirse, testisleri slayt yüzeyine itmek için neşterin kenarını kullanın.Daha sonra, testislerden fazla sıvıyı uzaklaştırmak için hassas bir görev silme nin köşesini kullanın. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın. Daha sonra testislere 30-50 mikrolitrelik mikroskoper montaj ortamı uygulayın.Son olarak, montaj ortamının damlaüzerine 22 milimetrelik bir kapak kayması yerleştirin. Coverslip yerleşmek için izin ve montaj orta coverslip altında yaymak için. Gerekirse, fazla montaj ortamını sıkmak için kapak kaymasına hafif basınç uygulayın ve örtü kaymanın testislerin yüzeyinde dinlenmesine izin verin.Bu protokol başarıyla yürütüldüğünde, testislerin hücresel organizasyonu korunur ve hücre farklılaşmasının testisin bir ucundan diğer ucuna ilerlemesi görünür. Meyozis ve metafazdaki spermatositler tespit edilebilir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan testislerde canlı görüntüleme analizi, spermatositlerin bölünmesinde endoplazmik retikulum ve mikro tübüllerin dinamik olarak yeniden yapılandırıcılığı göstermektedir.Protokolde açıklandığı gibi, testislerin patlamasına neden olan basıncı uygulamamaya özen gerekir. Spermatosit kistleri yırtık bir testisten hızla dışarı akar ve bu da canlı zaman atlamalı görüntülemeyi zorlaştırır. Bu protokol, spermatositlerin canlı, bozulmamış dokuda bölünmesini görüntülemek için optimize edilebiyi optimize edemeye yöneliktir.Bu nedenle, testislerin diseksiyon veya montaj sırasında zarar görmemesi esastır. Yöntemimiz aynı zamanda, hücre bölünmesini yöneten dinamik alt hücresel süreçlere yeni bakış açısı sağlayan yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu gibi süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri için de uygun olmalıdır.

preparation-drosophila-larval-pupal-testes-for-analysis-cell-division

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, canlı hücre görüntüleme asimetrik sağlam duyu organı progenitör hücreleri ve epidermal hücrelerin bölünmesi için bir metodu...

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Yetişkin hazırlamak için standart bir...

Yetişkin hazırlanması Drosophila Gözler İnce Kesit ve Mikroskobik Analizi

Canlı hücre döngüsü analizi için bir...

Canlı Hücre Döngüsü Analizi<em&gt; Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometreyi ve Vybrant DyeCycle Violet DNA Leke kullanarak&gt; Dokular

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Bu protokol, Drosophila melanogaster pupalarından elde edilen sağlam testislerin ve germ hattı kistlerinin diseksiyonunu ve kültivasyonunu tanımlar. Bu yöntem, spermatogenezin ex vivo mikroskobik olarak gözlemlenmesine izin verir. Ayrıca, inhibitörlerin pupa testislerde germ hücresi gelişiminin belirli aşamaları üzerindeki etkisinin farmakolojik bir analizini tarif ediyoruz.

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

Drosophila yumurtalık kök hücre niş geliştirme eğitim için mükemmel model bir sistemdir. Larva ve yetişkin yumurtalık dissekan için yöntemleri yayımlanmış olsa, Pupa yumurtalık diseksiyonlarının ayrıntılı olarak yayınlanmamıştır farklı teknikler gerektirir. Burada diseksiyon, boyama ve pupa yumurtalık montaj için bir protokol anahat.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, Drosophila larva ve pupa testislerinin canlı, sağlam dokuda hücre bölünmesi analizi için floresan mikroskopiyle nasıl hazırlandığını. Bu yöntem, hücrelerin fizyolojik ortamını koruyarak canlı görüntüleme sağlar.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Daha fazla video keşfet