Name: Teleostların Koku Sinirinden Ekstrasellüler Çok Birimli Kayıt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Keşfedin deniz balıklarında ekstrasellüler çok birimli kayıt yöntemiyle koku duyarlılığını değerlendirme tekniğini. Bu hassas yöntem, farklı türlerde ve çevre koşullarında tekrarlanabilir duyusal yanıtlar ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların laboratuvarındaki çalışmalar Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portekiz, PTDC/BIA-BMA/30262/2017 projeleri ve UID/Multi/Multi/04326/2019 ve Sözleşme Programı DL57/2016/CP1361/CT0041 ile ZV tarafından desteklenir.

Hayvan bakım ve deneyleri sertifikalı deneysel tesislerde gerçekleştirildi ve Portekiz Ulusal Mevzuatı (DL 113/2013) veterinerlik genel müdürlüğü, Tarım, Kırsal Kalkınma ve Balıkçılık Bakanlığı tarafından 'grup-1' lisansı altında takip edildi. Bu protokol hayvan işlemeyi içerdiğinden, bilimsel deneylerde kullanılan hayvanların refahını düzenleyen yerel ve/veya ulusal organ tarafından onaylanması gerekir, buna ek olarak araştırmacıların bu tür prosedürleri gerçekleştirmek için uygun eğitim ve lisanslara sahip olması gerekir.
1. Uyarıcı hazırlama
NOT: Çoğu balık son derece hassas koku alma sistemine sahiptir, bu nedenle deneyde kullanılacak koku uyaranları hazırlanırken büyük özen gerekir. Uyarıcıları oluşturan cam eşyalar %5 çamaşır suyu (sodyum hipoklorit) içinde yıkanmalı, musluk suyu ile iyice durulanmalı ve kurutulmalıdır. Hemen önce kullanmak için deniz suyu (aynı su uyarıcı seyreltme yapmak için kullanılan) ile iyice cam durulayın. Bu suyun hiçbirinin çıplak deriyle temas olmamasına dikkat edin.
<ol><li>10-2 M L-glutamin, L-lösin ve L-serine 100 mL olun; kullanıma kadar her biri -20 °C'de 1 mL aliquots saklayın.</li>
	<li>Deney günü, hem kontrol hem de yüksek CO2 deniz suyu kullanarak 10-3 M ila 10-7 M çözeltisi (x10 seyreltme adımlarında) hazırlayın. NOT: L-serine (10-3 M) pozitif kontrol veya standart olarak kullanılacaktır. Su uyaranların seyreltme makyaj için kullanılan ve uyaranlar gibi tam olarak aynı şekilde tedavi ama herhangi bir odorant eklenmeden, negatif kontrol veya boş olarak kullanılacaktır.</li>
</ol>2. Kontrol ve yüksek CO2 su hazırlanması

<ol><li>Kömür filtrelenmiş deniz suyu 1 L toplayarak kontrol suyu hazırlayın.<ol>
<li>Bir pH prob kullanarak, pH kontrol edin; 8.2 civarında olmalıdır. Değilse, bu pH ulaşılına kadar atmosferik hava ile kabarcık.</li>
		<li>Bir alkalinite titratör kullanarak suyun alkalinitesini ölçer.</li>
		<li>Su sıcaklığını ve tuzluluk ölçün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deniz suyunun 1 L'sini filtreleyerek yüksek CO2 suyu hazırlayın, ardından istenilen pH'a ulaşılına kadar CO2 kabarcığı kabarcığı.<ol>
<li>Bir pH prob kullanarak, pH kontrol edin; 7.7 civarında olmalı.</li>
		<li>Bir alkalinite titratör kullanarak, suyun alkalinitesini ölçün.</li>
		<li>Su sıcaklığını ve tuzluluk ölçün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sudaki CO2 parametrelerini hesaplamak için tasarlanmış bir yazılım kullanarak hem kontrolde hem de yüksek CO2 suyunda CO2 basıncını belirleyin (örn. CO2Calc yazılımı13).<ol>
<li>Giriş penceresinde su pH, sıcaklık, tuzluluk ve toplam alkalinite değerlerini ekleyin (Şekil 1).</li>
		<li>Sabitleri, birimleri ve ölçekleri seçin (Şekil 2'deönerilen değerlere bakın).</li>
		<li>CO2 basıncını belirlemek için düğme işlemine basın. NOT: Şekil 3 bir sonuç sayfası nın örneğini gösterir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Balığın hazırlanması
NOT: Bu protokolde 200−400 g'lık bir çipura kullanılır.
<ol><li>MS222 (etil-3-aminobenzoat metansülfonat tuzu) içeren havalandırılmış doğal deniz suyunda balık byimmersion anestezik. Bir kuyruk kıskacına yanıt durduğunda, yan kas içine nöromüsküler bloker gallamine triethiodide enjekte (10 mg·kg-1 fizyolojik tuzlu). NOT: Kullanılan anestezi konsantrasyonu türler arasında farklılık gösterir; 200−400 g'lık bir çipura için 200 mg· L-1 400 mg ile tamponlu· L-1 NaHCO3.</li>
	<li>Anestezili balığı yastıklı bir desteğe yerleştirin. Tam şekli ve boyutu model türlerine bağlıdır; çipura (200−400 g) için, evde yapılan yastıklı V şeklinde destek kullanın.</li>
	<li>Ağıza bir silikon tüp (çap = 10 mm) yerleştirin, tüpü anestezi içeren bir rezervuardaki dalgıç pompaya bağlayın, deniz suyu temizleyin ve ~100 mL·dk-1·kg-1'desolungaçların üzerine su pompalayın. NOT: Kullanılan silikon tüpün büyüklüğü balığın büyüklüğüne bağlıdır.</li>
	<li>Topraklama iğnesini yan kas içine takın ve amplifikatörün baş aşamasına bağlayın).</li>
	<li>Balığı nemli bezle (veya kağıt havluyla) üzerini sadece baş açıkta, kaplamanın solungaçlardan su çıkışını engellememesini sağlamak için üzerini örtün. NOT: Gözler nemli kağıt/bez veya siyah plastik parçaları ile kaplanabilir.</li>
	<li>Uyarıcı iletim sisteminin tüpünü, yani arka plan deniz suyuna bağlı cam tüpü burun deliğe yerleştirin. NOT: Mikro-hematokrit tüpleri kullanılabilir (uzunluk = 75 mm, ID = 1,15 mm, OD = 1,55 mm); bu küçük balık ile kullanılmak üzere bir elektrot çekmece üzerinde ince bir noktaya çekilebilir. Koku epitelinin ameliyat sırasında ıslak tutulmasını sağlamak önemlidir (aşağıda açıklanmıştır).</li>
	<li>Bir diş (ideal) veya hobi (örneğin, Dremel) matkap veya kuyumcu parlatıcı (diş matkap uçları ile) bir kesişen mikroskop altında (Faraday kafes içinde) yardımı ile gözler arasında kafatası deri ve kemik kaldırarak koku sinirleri ortaya çıkarmak (koku sinirleri genellikle gözler arasında birlikte çalıştırın).<ol>
<li>Çipura, sadece arka onlara, dairesel bir testere ile, gözlerin sadece arka kafatası parçası kaldırın. Daha sonra, bir matkap biti kullanarak, gözler arasındaki kemiği çıkarın; koku sinirleri gözlerin arasında yatıyor.</li>
	</ol></li>
	<li>Yeterli kemik temizlendikten sonra, ince forceps kullanarak sinirleri örten yağ ve bağ dokusu kaldırın; sinirlere zarar vermemeye veya kan damarlarını delmemeye özen. NOT: Deneyim diseksiyon rafine yardımcı olacaktır; diseksiyon ne kadar küçükse, hazırlık o kadar kararlı olur. Ancak, yeterli doku temizlenmelidir; deneyimsiz için, koku ampuller sadece görünür olduğunda, elektrotların doğru konumlandırma sağlamak için ampuller katılmak gibi sinirlerin kısmını ortaya çıkarmak için biraz daha ön açık.</li>
	<li>Elektrotları kullanmadan önce 3V DC kaynağının negatif direğine bağlayarak (örn. seri olarak iki AA pil) ve ucu fizyolojik tuzluya (veya tatlı suda 1:3 seyreltilmiş deniz suyuna) 20−30 s süreyle yerleştirerek temizleyin; küçük kabarcıklar sürekli bir akış ucu gelen görülmelidir.</li>
	<li>Koku alma sinirleri açığa çıktıktan sonra, kayıt elektrotlarını (mikro manipülatörler üzerinde tutulan) standarda maksimal bir yanıt veren bir konuma (örn. 10-3 M L-serine) ve boşa minimum yanıt veren bir konuma yerleştirin. Alternatif akım (AC) preamplifikatörün baş aşamasına bağlı parylene kaplı tungsten elektrotlar(Malzeme Tablosu)kullanın. NOT: Çipurada, amino asitlere en güçlü tepkiler genellikle sinirin lateral tarafına yerleştirilen elektrotlarla, koku ampulünün birleştiği yere yakın olarak görülür. Bu ampul glomerüler organizasyon türler arasında geniş benzer olduğu gibi, diğer türler için geçerli olabilir. Ancak, deneyim her zaman en iyi öğretmendir.</li>
</ol>4. Elektrofizyolojik kayıt
NOT: Çoğu elektrofizyolojide olduğu gibi faraday kafes içinde çok üniteli kayıt yapılması gerekmektedir. Ancak, hücre dışı kayıt genellikle bir anti-titreşim tablosu gerektirmez; çoğu hareket balık gelecektir. Bununla birlikte, mikro manipülatör standlarının manyetik tabanlarını sabitlemek için metal bir yüzeyle güçlü ve kararlı bir tablo gereklidir.
<ol><li>Solenoid tarafından işletilen üç yönlü bir vana kullanarak temiz arka plan suyundan uyarıcı içeren suya hızlı geçiş sağlamak için bir uyarıcı dağıtım sistemi kurun. Ortak prizi koku rozetine su taşıyan tüpe bağlayın ve bir hattı deniz suyu rezervuarına, diğerini de test çözümüne yerleştirin. NOT: Vana değiştirildiğinde (DC akımıgeçerek), su akışı arka plan suyundan koku yumuşu içeren suya geçer. Uyarıcı, entegre tepkide net bir zirve görecek kadar uzun süre verilmelidir, ardından bir konaklama dönemi; geçerli protokolde kullanılan süre 4 s'dir, ancak türe bağlı olarak daha uzun süre gerekebilir.</li>
	<li>Valf sürücüsünü analog-dijital dönüştürücünün tetiğine bağlayın (örneğin, Digidata); valf arka plandan uyarıcı içeren çizgiye geçtiğinde, bu verilerin kaydını başlatacaktır. Yazılımı tetikleyici olayda kayda başlamak ve önceden belirlenmiş bir süre boyunca devam edecek şekilde yapılandırın (örn. 10 s). NOT: On saniye yeterli olmalıdır, ancak bu kısaltılabilir veya uzatılabilir, deneysel soruya bağlı olarak.</li>
	<li>Bu durumda standart olan 10-3 M L-serine ile tekrar tekrar test ederek (entegre yanıtın genliğini kaydederek ve ölçerek) ve ardışık uyaranlar arasında 1 dk'nın atmasını sağlayarak preparatın stabilitesini kontrol edin. NOT: Türlere ve kokukarıncaya bağlı olarak, yanıtların %10'u içinde bir genlik olmalıdır (başparmak kuralı olarak) ve hızlı bir başlangıç olmalı, maksimum aktiviteye yükselmeli ve uyarıcı yok olduktan sonra taban çizgisine geri dönmelidir (Şekil 4).</li>
	<li>Kontrol deniz suyu amino asitlere koku sinir yanıtları kaydedin (en düşükten en yüksek konsantrasyona) ve 1 dk ardışık uyaranlar arasında elapse sağlar. NOT: Bazı türler ve/veya bazı kokular için daha fazla zaman alabilen bir şey olabilir. Ama amino asitler ve çipura için, 1 dk yeterlidir.</li>
	<li>10-3 M serine ve kontrol suyu boş çözeltisine yanıtı kaydedin.</li>
	<li>Arka plan çizgisini yüksek CO2 deniz suyu ile şişeye yerleştirerek arka2 plan suyunu kontrol deniz suyundan yüksek CO 2 deniz suyuna çevirin. NOT: Suya dokunmamak ve tüpün ucunun suda kalmasını sağlamak için uyarıcı ve arka plan hatlarının ucuna başka bir hematokrit tüpü (veya eşdeğeri) takmanız tavsiye edilir.</li>
	<li>Koku sinirinin yüksek CO2 deniz suyundaki amino asitlere tepkisini test edilmeden önce, koku epitelini yüksekCO 2 suyu yla, koku epitelinin üzerinde birkaç dakika takip ederek yüksek CO2 su ile koşullandırma. NOT: Deneyim, çipura için 5 dk yeterli olduğunu göstermiştir.</li>
	<li>Yüksek CO2 deniz suyunda amino asitlere koku sinir yanıtları kaydedin (en düşükten en yüksek konsantrasyona).</li>
	<li>Yüksek CO2 su boş çözeltisine yanıtı kaydedin.</li>
	<li>10-3 M serine ve kontrol suyu boş çözeltisine yanıtı kaydedin. NOT: Ham sinyal (sinir aktivitesi) filtre edilmeli (2.000−5.000 Hz civarında düşük geçiş, 50−300 Hz yüksek geçiş) ve analog-dijital dönüştürücüye geçilmelidir (Malzeme Tablosu). Sinir aktivitesinin daha kolay ölçülmesi için ham sinyal, sızdıran bir entegratör(Malzeme Tablosu)kullanılarak entegre edilebilir ve analog-dijital dönüştürücüye aktarılabilir ve oradan da uygun yazılımı çalıştıran bir bilgisayara hem ham hem de entegre sinyaller (örneğin, Aksoskop) aktarılabilir.</li>
</ol>5. Veri analizi
<ol><li>Tümleşik yanıtların tüm uyaranlara verdiği genlikten boşa (mV)'ye tümleşik yanıtın genliğini çıkarın.</li>
	<li>Önceki yanıtın genliğini standarda bölerek uyaranlara verilen yanıtları normalleştirin (10-3 M serine); bu da balıklar arası ve balık içi değişkenliği azaltır.</li>
	<li>Toplama-yanıt eğrilerinin doğrusal regresyonu ile algılama eşiklerini hesaplayın (yarı logaritmik bir çizim üzerinde), formül günlüğüne göre(N + 1.5) = C+ Bloginetiği, C'nin molar konsantrasyonu olduğu yerde, N normalleştirilmiş yanıt genliğidir ve a ve b sabitleri7,14. NOT: Algılama eşiği sonra x değeri nerede y = 0.1761 (yani, günlük 1.5; N = 0); bir yanıt (yani, balık kokusunu alabilirsiniz) görülecektir yukarıda konsantrasyon. Bazı kokular yarı logaritma (örneğin, kalsiyum15,16; bu durumda, normalleştirilmiş veriler maksimum yanıt genliği ve EC50 (yani, [odorant] verecek üç parametrelik Hill arsa monte edilebilir yarı logaritma çizildiğinde sigmoidal konsantrasyon-yanıt eğrileri uyandırmak yarı maksimum yanıt verir; ayrıca duyarlılık ölçüsü).</li>
	<li>Algılama ve/veya maksimum tepki genliği eşiklerini ve kontrol suyunda test edilen ve yüksek CO2 suyunda test edilen EC50 uyaranlarını karşılaştırın.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mevcut çalışma da çok birimli kullanımı açıklar (hücre dışı) çipura koku sinirkayıt(S. aurata),kültür balıkçılığında büyük önem taşıyan bir deniz sparid. Ancak, bu deneysel yaklaşım geniş diğer balık uygulanabilir; elektrotların cerrahisi ve tam yerleşimi açıkça koku sisteminin anatomisine bağlıdır ve anestezi seçimi ve konsantrasyonu incelenen türe bağlı olabilir. Örneğin, japon balığı koku siniri(Carassius auratus)kısa; Bu durumda, koku ampul EEG kayıt daha kolay olacaktır. Koku seçimi de, bir dereceye kadar, türlere bağlı olabilir. Mevcut çalışmada amino asitler kullanılmıştır. Bildiğim kadarıyla yazarlar farkında olarak, bugüne kadar araştırılan tüm balık türleri amino asitlere koku hassasiyeti var1,18. Bu duyarlılık gıda konumu, kimyasal iletişim ve doğum sularının tanınması19,20,2121,22,23gibi çeşitli süreçler karıştığı olmuştur. Ancak, farklı türlerin hassasiyetleri, genel olarak, oldukça benzer konuşma ve yaşam tarzı veya habitat bağlı değildir. Onlar da iyi tanımlanmış moleküller ve ucuz ve kolayca kullanılabilir. Bu nedenler onları balıklarda olfaction çalışmaları için ideal bir test uyarıcı yapmak, özellikle antropojenik bozuklukların etkilerini araştıran (örneğin, asitleşme veya kirlilik), sonuçlar kolayca türler arasında karşılaştırılabilir24.
Söz konusu türe bağlı olarak, çok üniteli kayıt için hazırlıklar birkaç saat boyunca sabit kalabilir; dahili standarda verilen yanıtın genliği (mevcut çalışmada 10-3 M L-serine) ardışık testler arasında %10'dan fazla değişmemelidir. Başparmak bu kural herhangi bir önemli sapma nedeniyle olabilir: (i) balık hareketi, ve bu nedenle elektrotlar ve / veya burun tüpü deplasman; (ii) örneğin, deneycinin elleriyle temas ederek suyun kirlenmesi (özellikle belirli bir kokutunun daha düşük konsantrasyonları daha yüksek konsantrasyonlardan daha büyük tepkiler veriyorsa); veya (iii) hazırlık sağlığının bozulması). Durumda (i), balık taşınmış olup olup yok olmalıdır; eğer öyleyse, yeniden konumlandırmak ve suya daha fazla anestezi katmak ve / veya gallamine triethiodide başka bir doz vermek. 5 dk bekleyin ve standardı yeniden test edin. Yanıt hala daha küçükse, yeterince büyük bir yanıt kaydedilene kadar elektrotları ve/veya burun tüpünü yeniden konumlandırın. Durumda (ii), sadece temiz cam ve su kullanarak, odorant taze bir seyreltme serisi yeniden. Durumda (iii), balığın solungaçları üzerinde su akışının yeterli olup olmadığını, suyun solungaçların üzerinden aktığını (yani ağız yerine opercula dan çıkarak) ve suyun iyi havalandırıldığını kontrol edin. Farklı balık türlerinin sıcaklık tercihleri çok farklıdır; laboratuvar sıcaklığının (ve balıkla temas eden suyun) balığın mümkün olduğunca tutulduğu sıcaklığa yakın olmasını sağlayın. Balığın stresli olmadığından da emin olun ve kayıttan en az bir hafta önce balıkları (bir tanktan diğerine bile) taşımaktan kaçının. Elektriksel gürültü, tabii ki, bir elektrofizyolog hayatının felaketidir; ancak, mevcut makale bu üstesinden gelmek / azaltmak için nasıl tartışmak için uygun bir ortam değildir. Yine de, 'Akson Kılavuzu' (üreticinin web sitesinden indirmek için bir pdf olarak serbestçe kullanılabilir) gürültü en aza indirmek pratik tavsiyeler kaynağıdır. Bir kez büyük, istikrarlı bir tepki standart uyarıcı tarafından uyarılır, ve bir konsantrasyon serisi genlik bir konsantrasyon bağımlı artış verir, boş en az yanıt ile, test uyaranları için yanıt kayıt başlayabilirsiniz. Bazı yazarlar aynı uyarıcıyı üç kez verir ve sonraki veri analizi için aritmetik ortalamayı hesaplar. Ancak, bunlar teknik çoğaltmalardır ve bu yaklaşım, bir kayıt oturumunun üç kat aldığı süreyi artırır. Mevcut yazarlar belirli bir koku yutmasını bir kez test etmeyi tercih, ama her zaman bir konsantrasyon-tepki eğrisinin bir parçası. Bu sadece algılama veya EC50 (açıklandığı gibi) eşiğinin hesaplanmasına izin vermekle kalmıyor, aynı zamanda balığın doğal ortamında deneyimlenenesahip olacaklarına yakın konsantrasyonların test edilmesini de sağlar (bu her zaman bilinmemektedir). Ayrıca, herhangi bir aykırı yanıtları, örneğin kontaminasyon nedeniyle, tespit etmek daha kolaydır; gerekirse taze yapılmış bir numune kullanılarak tekrarlanabilir.
Koku sinirinden çok üniteli kayıt invaziv olabilir, ancak deniz suyunda kaydedildiğinde EOG'den daha hassastır7, dış tuzluluktan bağımsız olduğu için. Bu nedenle koku alma hassasiyetini değerlendirmek için kullanılabilir, kalsiyum ve sodyum gibi, konsantrasyonlarında değişiklikler de iletkenlik ve dolayısıyla kaydedilen voltajlar15. Belirli bir kokuya yanıt veren ORN sayısının tahmini olarak (yani, koku epitelinden ampule kadar ORN aksonu boyunca seyahat eden aksiyon potansiyelleri), ham, işlenmemiş bir sinyali temsil eder (koku girişinin ilk işlenmesi ampullerde başlar). Bu nedenle, ağır metaller gibi kirleticilerin doğrudan etkilerini değerlendirmek için daha iyi bir parametre, ve çevresel değişiklikler, pH gibi, Koku sistemi üzerinde EOG veya EEG24daha,25. Yüksek PCO2 (ve bu nedenle düşük pH) ile deniz suyunda koku ampul kayıt nöral işleme pH merkezi etkileri nden etkilenebilir; okyanus asitleşme 'GABABir reseptör teorisi'26, su pH azalma cl bir yeniden dağıtım neden olur- ve HCO3- BOS iyon ve inhibitör GABAerjik aktivasyon sonucu bir kayma (hiperpolarizasyon) uyarıcı (depolarizasyon). Ayrıca, bu tür çalışmalarda, balığın doğal ortamında karşılaşabildiği gibi koku konsantrasyonları kullanarak asitleşme veya kirleticilerin etkilerini değerlendirmek önemlidir. Amino asitler için, bu mikromolar aralığı27nano olduğunu,28,29; balık bu bileşiklerin tespit eşiğine yakın1,18. Belirli bir koku tacı için tespit eşiğinin tahmini koku hassasiyetinin önemi ve/veya biyolojik rolü hakkında fikir verebilir. Örneğin, deniz lamprey(Petromyzon marinus)10-13 M30bir eşik aşağı larvalar tarafından yayımlanan belirli safra asitleri yüksek koku hassasiyeti vardır; Bu duyarlılık yetişkinlerin uygun yumurtlama alanlarını bulmasını ve belirlemesini ve bu nedenle uzun mesafelerde göçmen feromon olarak hareket etmesini sağlar. Benzer şekilde, olgun dişi deniz lamprey spermine yüksek koku hassasiyeti var (eşik 10-14 M), erkekler tarafından milt yayımlanan bir poliamin, daha sonra spermiating erkeklerin yuvaları onları çekiyor31. Diğer balıklar da poliaminler32koku hassasiyeti var,33,34,35, ama benzer bir feromonal rolü desteklemek için algılama yeterince düşük eşikleri ile; bunun yerine, çürüyen balıklardan kaçınılması önerilmektedir. Bununla birlikte, bu kadar yüksek koku alma hassasiyetleri ile, bu duyarlılık hafif bir azalma (yani, eşik artış), yanıt genliği önemli ölçüde azaltılmış olmasa bile, balık24için ciddi sorunlara neden olabilir hayal etmek mümkündür.
Yarı logaritmatik olarak çizildiğinde, kokulara konsantrasyon-tepki eğrileri üstel, doğrusal veya sigmoidal18olabilir. Amino asitler söz konusu olduğunda, bu tür yarı logaritmik konsantrasyon-yanıt eğrileri ya doğrusal (yani, logaritmik), sigmoidal veya güç fonksiyonları7. Yanıtın doygunluğu görülmediğini (yani, konsantrasyon-tepki eğrisinde plato olmaması, hatta supra-çevresel konsantrasyonlarda bile) muhtemelen belirli bir reseptöre bağlanan her amino asit yerine, konsantrasyonlarına bağlı olarak, bireysel amino asitlere bağlanan birkaç reseptörden kaynaklanmaktadır; belirli bir amino asit konsantrasyonu arttıkça, daha fazla reseptörleri bağlamak ve bu nedenle yanıt edebiliyoruz. Bununla birlikte, balık amino asit karışımları arasında ayırt edebilirsiniz36,37,38,39; Bu koku ampuller 12uyarılmışaktivite kombinatoryal desenler nedeniyle muhtemeldir12,40; aynı reseptör proteinini ifade eden tüm ORN'lerin aksonları koku ampulleri41,,42,aynı glomeruli de sonlandırmak ve bir amino asit birden fazla glomerulus aktive edebilir.
Ancak, feromonlar gibi son derece spesifik kokular, sigmoidal veya yarı-sigmoidal konsantrasyon-yanıt eğrileri uyandırmak olabilir43,44. Çıkarım, ampirik olarak test edilmemiş olsa da, bu koku yanıtları feromon molekülü ve çok az başka bağlamak son derece spesifik reseptörleri nedeniyle olmasıdır. Bu nedenle, belirli bir konsantrasyon yukarıda, tüm reseptörleri işgal edilir, ve daha fazla artışlar diğer ORNs daha fazla yanıt uyandırmak olacaktır. Bu nedenle, bu veriler üç parametrelik Bir Tepe çizimine takılabilir ve maksimal yanıt, EC50 ve Hill co-efficient15,,45,46hesaplanabilir. Bu, doğrusal veya üstel konsantrasyon-yanıt eğrilerinin veremeyeceği, görünür afinite ve görünür reseptör numarası gibi değerli bilgiler verebilir.

Balık gıda bulma da dahil olmak üzere hayatlarının birçok yönü için koku ağır güveniyor, yırtıcı kaçınarak, potansiyel eşleri ve göç değerlendirme, diğerleri arasında1,2,3. Bu nedenle, balıkkoku duyarlılığı değerlendirme (Ne koku? Bu bileşiklere karşı ne kadar hassaslar?) bu süreçleri tam olarak anlamak için hayati önem taşımaktadır. Ayrıca, çevre üzerindeki antropojenik etkileri, okyanus asitleşme ve kirlilik gibi, koku sistemi üzerinde derin etkileri olabilir, hatta öldürücü seviyelerde, mutlaka çevreleyen su ile samimi temas çünkü4. In vivo elektrofizyoloji balıklarda koku duyarlılığını değerlendirmek için tercih edilen deneysel bir yaklaşımdır. Üç ana teknik mevcuttur: elektro-olfactogram (EOG), koku ampul kaydedilen elektro-ensefalogram (EEG), ve koku sinir çok birimkayıt5.
EOG en yaygın olarak bu üç6kullanılır. Koku epitelinin üzerinde kaydedilen doğrudan akım (DC) alan potansiyelidir ve bu koku reseptör nöronların (ORN'ler) belirli bir koku antresine yanıt veren toplam jeneratör potansiyeli olduğuna inanılmaktadır. Ancak, balık içinde değil, suda kaydedildiği gibi, tepki genliği sadece balık tarafından üretilen sinyale değil, aynı zamanda çevredeki suyun iletkenliğine de bağlıdır; iletkenlik ne kadar yüksekse (veya direnç ne kadar düşükse), genlik de o kadar düşük olur. Bu, EOG'nin deniz suyunda tatlı su7'yegöre daha az hassas bir yöntem olduğu anlamına gelebilir.
Koku ampul kaydedilen EEG de yaygın balık kokualma soruşturmasında kullanılır. Ancak, koku ampul koku duyusal giriş için birinci sipariş işlememerkezidir 8; glomerruli olarak son derece organize edilir ve sonuç olarak kaydedilen yanıt büyük ölçüde kayıt elektrotlarının konumuna bağlıdır. Örneğin, amino asitleri tespit ORNs gelen giriş koku ampuller lateral bölgede glomeruli tarafından işlenir, konspesifik kaynaklı kimyasallar medial bölgeye yönlendirilir ise9,10,11,12. Feromonal giriş koku ampul içinde son derece lokalize glomerülize yönlendirilebilir. Söz konusu türün anatomisine de bağlı olarak, belirli bir koku için ideal kayıt pozisyonuna kolayca erişilemeyebilir.
Koku sinirinden gelen çok üniteli kayıt, yukarıda özetlenen EOG ve EEG ile ilgili ana sorunları atlatmaktadır. Orn'ların aksonlarından ampule geçen eylemleri kaydederken, birincil duyusal bir sinyaldir. Ve balığın içinde kaydedildiği gibi, tepki genliği dış tuzlululundan bağımsızdır. Yine de, tabii ki bazı dezavantajları vardır. İlk olarak, türün anatomisine bağlı olarak, koku sinirini ortaya çıkarmak için EOG'ye göre daha kapsamlı bir ameliyat gereklidir. İkinci olarak, sinyal EOG daha küçük olduğundan, biraz daha sofistike gerektirir, ve bu nedenle pahalı, ekipman. Diğer deneysel yaklaşımların genel bir açıklama John Caprio5tarafından verilir. Bu makalenin amacı, bu tekniğin bir örneği olarak çipuranın(Sparus aurata)koku sinirinden amino asit kokularına kadar hücre dışı çok birimli yanıtların nasıl kaydedilebildiğini ve böyle bir deneyde karşılaşılan daha yaygın sorunlardan bazılarının nasıl tanımlanacağını ve üstesinden gelincesini ana hatletmektir.

<table><tbody><tr><td>AC ön amplifikatör</td><td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, İngiltere)</td><td>NL104</td><td>Bu tür kayıtlar için özel olarak tasarlanmış nörolog ön amplifikatör.</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, ABD)</td><td>1440A</td><td>Analog-dijital dönüştürücü.</td></tr><tr><td>EMG Entegratörü</td><td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, İngiltere)</td> <td>NL703</td><td>Sinirin ham aktivitesini entegre etmek için Leaky' elektrik entegratörü.</td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td>Elektriksel gürültüyü azaltmak için</td> şirket <td></td><td>içinde üretilmiştir</td>.</tr><tr><td>Filter</td><td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, İngiltere)</td> <td>NL125 / 6</td><td>Elektrofizyolojik kayıt için filtre modülü.</td></tr><tr><td>Gallamin trietiyodür</td><td>Sigma-Aldrich (Portekiz)</td><td>G8134</td><td>Nöromüsküler bloker</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma-Aldrich (Portekiz)</td><td>G3126</td><td>Koku verici</td></tr><tr><td>L-lösin</td> olarak kullanılan amino asit <td>Sigma-Aldrich (Portekiz)</td><td>L80000</td><td>Koku verici olarak kullanılan amino asit</td></tr><tr><td>L-serin</td><td>Sigma-Aldrich (Portekiz)</td><td>S4500</td><td>Koku verici olarak kullanılan amino asit</td></tr><tr><td>Metalik taban plakası</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td>mikro manipülatörler için temel sağlar.</td></tr><tr><td>Mikro-hematokrit tüpleri</td><td>Herhangi Koku</td><td></td><td>alma epiteline su kaynağını konumlandırmak için</td></tr><tr><td>Mikro manipülatörler</td><td>Narishige International Ltd (Londra, İngiltere)</td><td>M-152</td><td>Pozisyon elektrotları</td></tr><tr><td>MS222 (etil-3-aminobenzoat metansülfonat tuzu)</td><td>Sigma-Aldrich (Portekiz)</td><td>E10505</td><td>Anestezik</td></tr><tr><td>pH probu</td><td>Hanna aletleri (P&oakut; voa de Varzim, Portekiz)</td><td>HI12302</td><td>Suyun pH değerini ölçmek için prob.</td></tr><tr><td>Refraktometre,</td><td>Hanna aletleri (P&oakut; voa de Varzim, Portekiz)</td><td>HI96822</td><td>Su tuzluluğunu ölçmek için refraktometre</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich (Portekiz)</td><td>746398</td><td>Tuzlu su çözeltisi için</td></tr><tr><td>Solenoid valfler</td><td>The Lee Co. (Essex, CT, ABD)</td><td>LFAA1201618H</td><td>Arka plan suyu ve stimuus çözeltileri arasında geçiş yapmak için (artık mevcut değil)</td></tr><tr><td>Stereo-mikroskop</td><td>Zeiss, Leica, Olympus</td><td>Herhangi bir uygun model.</td><td>Elektrotların diseksiyonu ve yerleştirilmesi için.</td></tr><tr><td>Titratör</td><td>Hanna cihazları (P&oacute; voa de Varzim, Portekiz)</td><td>HI84531</td><td>Su alkalinitesini, pH'ını ve sıcaklığını ölçmek için titratör.</td></tr><tr><td>Tungsten mikro elektrotlar 0.1 M & Omega;</td><td>Dünya Hassas Aletleri (Hitchin, İngiltere)</td><td>TM31A10</td><td>Hücre dışı elektrotlar.</td></tr><tr><td>Valf Sürücüsü</td><td>Solenoid</td> valfleri çalıştırmak için şirket <td></td> içi <td>12 V DC kaynak yapılmıştır.</td></tr><tr><td>Su pompası (dalgıç)</td><td>Herhangi biri</td><td></td><td>Balığın solungaçlarına anestezik içeren su sağlamak için.</td></tr></tbody></table>

teleostların koku sinirinden ekstrasellüler Çok birimli kayıt

Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts

Son çalışmalar okyanus asitleşmesinin balıklarda koku alma odaklı davranışları etkilediğini göstermiştir. Bunun nedeni kısmen yüksek PCO2/lowpH sudaki koku alma hassasiyetinin azalması olabilir. Okyanus asitleşmesinin veya genel olarak deniz balıklarında koku alma hassasiyetinin etkilerini değerlendirmek için, koku sinirinden hücre dışı çok birimli kaydın tercih edilen yöntem olduğunu öneriyoruz. İnvaziv olmasına rağmen hassas, sağlam, tekrarlanabilir ve dış tuzluluktan bağımsızdır (örneğin elektro-olfactogramın [EOG]'den farklı olarak). Ayrıca, herhangi bir merkezi işlem den önce CNS'ye birincil duyusal girdi kaydeder. Bu yöntemin, konsantrasyon-tepki eğrileri oluşturmak ve algılama eşiklerini hesaplamak için bir dizi amino asit kullanarak hem geçici hem de kokuya bağımlı koku hassasiyetinde bir azalma gösterebileceğini gösteriyoruz.

Pozitif kontrole tipik bir yanıt (10-3 M L-serin; Şekil 4A) ve negatif kontrol (boş; Şekil 4B) bir çipuranın koku sinirinden kaydedilen Şekil 4'tegösterilmiştir. Uyarıcının varlığında (siyah yatay çubuk; koku boşluğunda, koku epiteli ile temas halinde), aktivitedeki hızlı artışa (entegre sinyalin yukarı doğru sapmasıyansıtılır) uyarıcı başlangıcının yaklaşık bir saniye içinde zirveye ulaştığına, ardından bir konaklama süresinin (uyarıcı hala mevcutken) ve uyarıcı sona erdikten sonra temel aktiviteye geri dönüşüne dikkat edin. Yanıtın mutlak genliği elektrot pozisyonuna son derece bağlıdır; düşük genlikli bir yanıt kaydedilirse, elektrot konumlarını değiştirmeyi deneyin. En yüksek aktiviteye daha yavaş bir artış, uyarıcı içeren suyu epitelden çok uzağa yerleştirilen koku epiteline taşıyan tüpün nedeniyle olabilir; burun tüpünü epitelin yakınına (ama dokunmamaya) yaklaştırmayı deneyin. Bunun aksine, boş çok az veya hiç yanıt çağrıştırıyor unutmayın. Boş alakadar önemli bir olumlu tepki (yani aktivite artışı) uyaranların seyreltmelerini yapmak için kullanılan suyun kirlenmesine işaret edebilir; temiz su (ve cam) ile taze seyreltme yapma bu çözmelidir. Değilse, su sisteminin daha kapsamlı bir şekilde temizlenmesi (aktif kömür filtreleri dahil) gerekebilir. Negatif bir yanıt (yani, aktivitedeki azalma) valf, örneğin vanadaki tıkanıklık nedeniyle açıldığında akış hızında hafif bir değişime işaret edebilir.
Tipik bir konsantrasyon-yanıt eğrisi (yarı logaritma tiksintisi çizilmiştir), bu durumda L-lösin (10-7 M ila 10-3 M), Şekil 5A'dagösterilmiştir. Koku antlerinin artan konsantrasyonlarının aktivitede ve dolayısıyla entegre yanıtların genliğinde giderek daha büyük artışlara neden olduğunu unutmayın. Normalleştirilmiş verilerin bir çizimi ve buna karşılık gelen doğrusal regresyon Şekil 5B'degösterilmiştir. Tahmini algılama eşiği, y = 0,1761 (yani log1.5; nerede N = 0) olduğunda x değerinden hesaplanabilir. Bu durumda, bu değer -7.48; diğer bir deyişle, bu balıkl l-lösin için hesaplanan eşik 10-7.48 M'dir. Üs α benzer şekilde bir günlük-günlük çizim üzerinde normalleştirilmiş verilerin doğrusal gerileme tahmin edilebilir; logN = αlog[odorant] + sabit. Faktör γ daha sonra bir günlük birimi tarafından tepki genliğini artırmak için gerekli koku konsantrasyonu artış verir; yani, konsantrasyon-tepki eğrisi17diklik bir tahmindir. Bu örnekte α = 0.277 ve γ = 3.61; bu nedenle, yanıt genliğini on kat artırmak için (yani, bir günlük birimi; log10 = 1), uyarıcı konsantrasyonu 103,61-kat (4,074-kat) artırılmalıdır.
Tipik bir sigmoidal konsantrasyon-yanıt eğrisi(Şekil 6A) yarı logaritma tiksintisi çizildiğinde, bu durumda L-glutamin, Şekil 6B'degösterilmiştir . Yanıt genliğinde benzer bir konsantrasyona bağlı artış görülür; ancak, yüksek konsantrasyonlarda, bu artış daha az böylece yanıt genliği maksimum(Nmax)ulaşır olur. Bu, verilerin üç parametreli Tepe denklemine takılmasını sağlar: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60962/60962eq1.jpg">
Bu şekilde, EC50 (P maksimal bir yanıtın uyarıldığı koku konsantrasyonu) ve Hill co-verimli (sigmoidal eğrinin doğrusal kısmının eğiminin dikliğinin bir ölçüsü) hesaplanabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig1.jpg"> Şekil 1: CO2Calc programından giriş penceresini gösteren yazılım ekran görüntüsü. Vurgulanan (kırmızı kutular) karbonat parametre hesaplaması için gerekli alanlardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig2.jpg"> Şekil 2: Uygun sabitler, birimler ve ölçekler için giriş penceresini gösteren yazılım ekran görüntüsü. Gösterilen değerler, açıklanan deneylerin gerçekleştirildiği koşullar için önerilir; değişebilirler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig3.jpg"> Şekil 3: Sonuç penceresini gösteren yazılım ekran görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig4.jpg"> Şekil 4: 10-3 M L-serine (A) ve boş (B) yanıt olarak in vivo'nun koku sinirinden hücre dışı olarak kaydedilen tipik çok birimli tepkiler. Üst izler entegre yanıtları gösterir ve alt izleri ham (sinir) sinyali gösterir. Koku epiteline (yatay çubuklar) uyaranlar uygulandı. Maruz kalma 1 s sırasında aktivite hızlı artış, aktivite bir zirve, konaklama bir süre takip (odorant hala epitel teslim edildi) ve koku teslim sona erdikten sonra temel seviyelerine bir dönüş unutmayın. Herhangi bir koku (boş) ekleme dışında, koku seyreltmeleri ile aynı şekilde tedavi su ile stimülasyon sonrasında aktivitede çok az veya hiç artış görülür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig5.jpg"> Şekil 5: L-lösin için tipik konsantrasyon-yanıt eğrisi in vivo koku sinirinden ekstrasellüler olarak kaydedildi. (A) Koku epiteline (yatay çubuklar) uygulanan L-lösin konsantrasyonu 10-7 M'den 10-3 M'ye yükselirken, sinirde eşlik eden bir aktivite artışı görülür. Üst izler entegre yanıtları gösterir ve alt izleri ham (sinir) sinyali gösterir. (B) Normalleştirilmiş verilerin doğrusal regresyonu (R2 = 0,97) yarı logaritmik olarak çizilirken,[L-lucine] günlük değeri olarak algılama eşiğini hesaplarken(N + 1.5) = 0,1761 (yani N = 0) olur. Bu örnekte, bu değer -7,48; Bu balıkL-lösin için tespit tahmini eşik bu nedenle 10-7.48 M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig6.jpg"> Şekil 6: L-glutamin için tipik konsantrasyon-yanıt eğrisi in vivo koku sinirinden ekstrasellüler olarak kaydedildi. (A) Koku epiteline (yatay çubuklar) uygulanan L-glutamin konsantrasyonu 10-7 M'den 10-3 M'ye yükselirken, sinirde eşlik eden bir aktivite artışı görülür. Üst izler entegre yanıtları gösterir ve alt izleri ham (sinir) sinyali gösterir. (B) Üç parametreli Tepe denklemine (R2 = 0,99) monte edilmiş normalleştirilmiş verilerin yarı logaritmik çizimi. Bu örnekiçin, hesaplanan EC50 = 3,11 μM ve Hill co-efficient = 0,565). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Koku sinirinden ekstrasellüler çok üniteli kayıt, deniz balıklarında koku alma hassasiyetini değerlendirmek için hassas, sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Birincil duyusal girişi kaydeder ve dış tuzluluktan bağımsızdır.

Teleostların Koku Sinirinden Ekstrasellüler Çok Birimli Kayıt

Recent studies have shown that ocean acidification affects olfactory-driven behavior in fish. This may be due in part to a reduction in olfactory ...

Bu, CNS tarafından herhangi bir işlem den önce tamamen duyusal bir sinyal kaydeder gibi deniz balıklarında koku hassasiyetini değerlendirmek için en sağlam ve hassas yöntemdir. Bu tekniğin en önemli avantajları duyarlılığı ve dış tuzluluktan bağımsız olarak farklı bir ortamdan farklı bir türe kolayca aktarılabildiğidir. Kontrol suyunu hazırlamak için, bir litre kömür filtreli deniz suyu toplayın ve pH'ı kontrol etmek için bir pH sondası kullanın.pH 8.2 civarında olmalıdır. Değilse, 8.2 pH ulaşınkadar atmosferik hava ile deniz suyu kabarcık. Daha sonra, suyun alkalinitesini ölçmek için bir alkalinite titratör kullanın, sonra su sıcaklığını ve tuzluluk ölçmek.Yüksek karbondioksitli su hazırlamak için, istenilen pH ulaşılAna kadar karbondioksit ile köpüren önce partikül inaktive kömür filtreleri ile deniz suyu bir litre filtre. 7.7 civarında olmalıdır pH kontrol etmek için bir pH prob kullanın, sonra suyun alkalinitesini ölçmek ve su sıcaklığı ve tuzluluk ölçmek için bir alkalinite titratör kullanın. Hem kontrol hem de yüksek karbondioksit lisanlı sudaki karbondioksit basıncını belirlemek için, sudaki karbondioksit parametrelerini hesaplamak ve giriş penceresine su tuzluluğu, sıcaklık, basınç, toplam alkalinite ve pH değerlerini eklemek için tasarlanmış bir yazılım programı açın.Ardından sabitleri, ölçekleri ve birimleri seçin ve karbondioksit basıncını belirlemek için işlemi tıklatın. Kuyruk kıskacına yanıt verilmemesi nedeniyle uygun bir sedasyon seviyesini doğruladıktan sonra, anestezili balığı model için özelleştirilmiş bir yastık desteğine yerleştirin ve balığın ağzına uygun büyüklükte bir silikon tüp yerleştirin. Tüp bir dalgıç pompa ve anestezik içeren bir rezervuar gazdeniz suyu ve su solungaçları üzerinde kilogram başına dakikada yaklaşık 100 mililitre pompalanır bağlı.Daha sonra, yan kas içine bir topraklama pimi takın ve amplifikatör baş aşamasına pin bağlayın. Sadece baş maruz nemli bezle balık kapağı ve burun deliği içinde uyarıcı iletim sistemi ile tüp konumlandırmak. Koku sinirlerini ortaya çıkarmak için, gözler arasında kafatasıderi ve kemik kaldırmak için bir matkap ve bir diseksiyon mikroskop kullanın.Bir çipura kullanırken, sadece gözleri posterior ve gözler arasında kemik kaldırmak için matkap kullanmak için gözlerin hemen üzerinde kafatası parçası kaldırmak için dairesel bir testere kullanın. Yeterli kemik temizlendikten sonra, sinirlere veya damarlara zarar vermeden koku sinirlerini örten yağ ve bağ dokusunu çıkarmak için ince çalgılar kullanın. Elektrotları kullanmadan önce üç voltluk dc kaynağın negatif direğine bağlayarak ve ucu fizyolojik tuzluya 20-30 saniye süreyle yerleştirerek temizleyin.Küçük kabarcıklar sürekli bir akış ucu gelen görülmelidir. Parilene kaplı tungsten elektrotları alternatif akım AC preamplifikatörünün baş aşamasına bağlayın. Koku alma sinirleri maruz kaldıktan sonra, standart ve boş minimum yanıt maksimum yanıt veren bir pozisyonda uygun koku sinir içine elektrotlar eklemek için mikro-manipülatörler kullanın.Diseksiyonun sorunsuz geçmesini sağlamak, kritik adım elektrotları doğru konuma sokmaktır. Bu zaman alabilir ve deneme yanılma belirli bir dereceye kadar içerir. Elektrofizyolojik ölçümler elde etmek için, temiz arka plan suyundan su içeren uyarıcıya hızlı geçişsağlamak ve ortak çıkışı koku rosetinde su taşıyan tüpe bağlamak için bir uyarıcı dağıtım sistemi kurmak için bir solenoid işletilen üç yönlü valf kullanın.Bir satırı arka plan deniz suyuna, diğerini de test çözümüne yerleştirin. Valf sürücüsünü analog dijital dönüştürücünün tetikleyicisine bağlayın ve yazılımı tetikleyici olayda kayda başlamak ve önceden belirlenmiş bir süre devam edecek şekilde yapılandırın. Hazırlığın kararlılığını kontrol etmek için, tekrarlanan uyaranlar arasında bir dakika nın akmasını sağlayan standartla birlikte tümleşik yanıtın genliğini tekrar tekrar kaydedin ve ölçün.Daha sonra, kontrol deniz suyunda amino asitlere koku sinir yanıtları kaydedin ve ardışık uyaranlar arasında bir dakika elapsına izin, sonra bir kontrol su boş çözeltisi negatif üçüncü azı serine bir kez 10 yanıtı kaydedin. Sonra yüksek karbondioksit deniz suyunda amino asitlere koku sinir yanıtları kaydedin. Yüksek karbondioksitli su boş çözeltisine verilen tepki ve bir kez 10'a verilen yanıt, kontrol suyu boş çözeltisindeki negatif üçüncü azı azı nabiyosu.Burada, bir çipuranın koku sinirinden kaydedilen pozitif ve negatif kontrol uyaranlarına tipik tepkiler gösterilmiştir. Uyarıcı uygulamasının yaklaşık bir saniye içinde, uyarıcı hala mevcut iken bir konaklama dönemi ve uyarıcı sona erdikten sonra temel aktiviteye dönüş gibi hızlı bir aktivite artışı gözlemlenebilir. Buna karşılık, boş bir uyarıcı çok az veya hiç yanıt çağrıştırır.Bu tipik konsantrasyon yanıt eğrisinde, bir kokunun artan konsantrasyonlarının aktivitede giderek daha büyük artışlara ve dolayısıyla entegre yanıtların genliğini uyandırabildiği gözlenebilir. Normalleştirilmiş verilerin çizilmesi ve buna karşılık gelen doğrusal regresyon, her bir hayvanın veya bir grup hayvanın konsantrasyon yanıtları için algılama eşiğinin tahmin inmesine olanak tanır. Sigmoidal konsantrasyon yanıt eğrileri yarı logaritma çizilebilir, bu da %50 maksimal yanıtta çağrıştıran koku konsantrasyonunun hesaplanmasına olanak sağlar.Bu mümkün olduğunca sağlıklı balık tutmak için önemlidir. Örneğin, solungaçların yeterince sulandırıldığından ve koku epitelinin kayıt sırasında ıslak tutulduğundan emin olun. Amaçlarımızdan biri beyindeki sinir yollarının izini duyusal bilgilerin aktarıldığı yere kadar takip etmek.

extracellular-multi-unit-recording-from-olfactory-nerve

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Multielectrode array (MEA) kayıtları nöronların büyük nüfus elektriksel aktivite eğitimi için bir yöntem sağlar. Burada, aynı anda doku uyarıcı fare vomeronasal epitel kayıt MEA hazırlanması ayrıntılar mevcut.

Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Electroolfactogram (EOG) kayıt koku epiteli düzeyinde koku alma fonksiyonu değerlendiren bir bilgilendirme yapmak için kolay ve güvenilir bir yoldur. Bu protokol bir kayıt kurulum, fare doku hazırlanması, veri toplama ve temel veri analizi açıklar.

Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.

Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Floresan boya retrograd taşıma anatomik projeksiyona dayalı nöronların bir alt-nüfus etiketler. Etiketli akson görsel olarak...

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

Bu video, farelerde koku alma duyusal nöronlarının (OSN'ler) delikli bir yama kelepçesi tekniği kullanılarak elektrofizyolojik kaydını göstermektedir. Florofor etiketli koku reseptörlerine sahip OSN'leri içeren koku alma epiteli, bir fareden izole edilir ve bir kayıt odasında sabitlenir. Bir kayıt pipeti, bir OSN'nin dendritik topuzuna kenetlenir ve pipet içindeki nistatin, hücre ile elektriksel bağlantı oluşturmak için zarı deler. Son olarak, bir koku uyarıcısı vermek için başka bir pipet...

Farelerde Koku Alma Duyu Nöronlarının Delikli Yama-Kelepçe Kaydı

Biz omurgasız koku yolunun ilk üç aşamada koku-uyarılmış yanıtlar karakterize etmek ekstraselüler çoklu ünite kayıt tekniği varyasyonları göstermektedir. Bu teknikler kolayca başka sinir sistemlerinin topluluk etkinliği incelemek için adapte edilebilir.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

İki farklı beyin neuropiles veya iki farklı anatomik yolları eşzamanlı dışı uzun süreli kayıtları arıları kuruldu. Bu kayıtlar farklı beyin bölgelerinde tek nörona yanı sıra davranıyor hayvanda topluluk düzeyinde karşısında nöronal işleme zamansal açıdan soruşturma izin.

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

Nöronal morfolojiyi ve zaman içindeki gelişimini görselleştirmek için koku alma duyu nöronlarının elektroporasyon ve ardından konfokal lazer tarama veya çoklu foton mikroskobu ile in vivo olarak etiketlenmesi için bir protokol açıklıyoruz.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için In Vivo

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Burada, Xenopus laevis'in  koku soğancığındaki sıcaklık tepkilerini ölçmek ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.Koku alma reseptörü nöronları ve mitral hücreler diferansiyel olarak boyanır, daha sonra kalsiyum değişiklikleri kaydedilir, bu da ampuldeki bazı sinir ağlarının burunda indüklenen sıcaklık düşüşlerine duyarlılığını yansıtır.

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus kurbağa yavrularını içinde vivo sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Biz metodolojileri yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için tarif Xenopus larva normal yetiştirme koşullarında veya yaralanma sonra.

Fonksiyonel yaşam Xenopus kurbağa yavrularını koku yollar değerlendirilmesi

Keşfedin deniz balıklarında ekstrasellüler çok birimli kayıt yöntemiyle koku duyarlılığını değerlendirme tekniğini. Bu hassas yöntem, farklı türlerde ve çevre koşullarında tekrarlanabilir duyusal yanıtlar ölçer.

Teleostların Koku Sinirinden Ekstrasellüler Çok Birimli Kayıt

Daha fazla video keşfet