Name: Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, C. elegans germ hattında protein-protein etkileşimlerini yerinde tespit etmek için yakınlık ligasyon tayini yöntemini. Bu teknik, gelişim süreçlerinin düzenlenmesi hakkında önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada kullanılan bazı nematod suşları NIH (P40OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Nih Ödülleri P20GM103546 ve S10OD021806'nın desteğiyle işletilen Montana BiyoSpektroskopi Çekirdek Araştırma Laboratuvarı'nda konfokal mikroskopi yapıldı. Bu çalışma kısmen NIH'nin GM109053'ü E.V.'ye, American Heart Association Fellowship 18PRE34070028'i X.W.'ye ve Montana Academy of Sciences ödülü ile X.W.'ye desteklenmiştir. Fon çalışmaları tasarımı veya rapor yazma dahil değildi. Tartışma için M. Ellenbecker'a teşekkür ederiz.

<ol><li>Berggård, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Nooren, I. M., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li>
<li>Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hub+promiscuity+in+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Hub promiscuity in protein-protein interaction networks.</a> International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).</li>
<li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).</li>
<li>Nousch, M., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).</li>
<li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+situ+protein-protein+complexes+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+using+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52139(2015).</li>
<li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+a+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45 (3), 185-191 (2008).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein%3A+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li>
<li>Erdős, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).</li>
<li>Navarro-Lérida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNLL%2FLC8%3A+a+light+chain+subunit+of+the+dynein+motor+complex+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond.</a> FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8%2FDYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818(2011).</li>
<li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+IDP+assemblies%3A+Unique+properties+of+LC8-associated%2C+IDP+duplex+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li>
<li>Jespersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+recognition+motifs+for+the+hub+protein+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8.</a> Life Science Alliance. 2 (4), (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+light+chain+DLC-1+promotes+localization+and+function+of+the+PUF+protein+FBF-2+in+germline+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells.</a> Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).</li>
<li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li>
<li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li>
<li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li>
<li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zinc+finger+proteins%2C+OMA-1+and+OMA-2%2C+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li>
<li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+in+C.+elegans+using+%22freeze-cracking%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Crittenden, S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunolabeling+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yok.

C. elegans germline PPIs çalışırken, ko-immünboyama ile karşılaştırıldığında PLA tarafından sunulan yüksek çözünürlük görselleştirme ve etkileşimleri germline meydana yerlerin nicel sağlar. Daha önce DLC-1'in IN vitro GST pulldown tetkik26kullanarak OMA-1 ile doğrudan etkileşime girdiği bildirilmiştir; ancak, bu etkileşim bir in vivo pulldown tarafından kurtarılamadı. Floresan ko-immünboyboya 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlines DLC-1 ve OMA-1 için ifade desenleri bir örtüşme göst...

Proteinlerin %80'inden fazlasının diğer moleküllerle etkileşimleri olduğu tahmin edilmektedir1, bu da PPI'ların hücre2'dekibelirli biyolojik fonksiyonların yürütülmesinde ne kadar önemli olduğunu vurgular. Bazı proteinler hücre sağkalım için gerekli olan büyük komplekslerin montajını kolaylaştıran hub'lar olarak işlevgörürler 1. Bu hub'lar birden çok PPI'ya aracılık eder ve proteinlerin hücre3'tekibelirli işlevleri kolaylaştıran bir ağ halinde organize etmeye yardımcı olur. Protein komplekslerinin oluşumu da biyolojik bağlam etkilenir, belirli etkileşimli ortakların varlığı veya yokluğu gibi4,hücre sinyal olayları, ve bir hücrenin gelişim evresi.
C. elegans yaygın geliştirme de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar için bir model organizma olarak kullanılır. Bu hayvanın basit anatomisi, solucan gelişiminin analizini kolaylaştıran gonad, bağırsak ve şeffaf mitikül de dahil olmak üzere çeşitli organlardan oluşur. Gonad'da yaşayan germin, germline kök hücrelerinin embriyolara ve sonunda yeni nesil singenlere dönüşengametler 5'e nasıl olgunlaştığını incelemek için harika bir araçtır. Germline distal uç bölgesi kendi kendini yenileyen kök hücrelerden oluşan bir havuz içerir(Şekil 1). Kök hücreler niş bırakın gibi, onlar meiyotik pachytene içine ilerleme ve sonunda genç yetişkin aşamasında yumurta içine gelişir (Şekil 1). Germline geliştirme Bu program sıkı rna bağlayıcı proteinler (RRB)6tarafından kolaylaştırılen bir post-transkripsiyonel düzenleyici ağ da dahil olmak üzere farklı mekanizmalar aracılığıyla düzenlenir. PpI'lar bu düzenleyici etkinlik için önemlidir, çünkü KP'ler işlevlerini yerine getirmek için diğer kofaktörlerle ilişkilendirilir.
Solucanda PPI'lar için sondalamak için kullanılabilecek çeşitli yaklaşımlar vardır, ancak her birinin benzersiz sınırlamaları vardır. In vivo immünopresipite (IP) protein-protein komplekslerini tüm solucan özlerinden ayırmak için kullanılabilir; ancak bu yaklaşım, ÜFE'nin solucanda nerede oluştuğunu göstermez. Buna ek olarak, geçici ve sadece gelişim belirli bir aşamada veya sınırlı sayıda hücre de form protein kompleksleri co-immünopresid ile kurtarmak zor olabilir. Son olarak, IP deneyleri lysis ve afinite matris proteinlerin non-spesifik tutma sonra protein kompleksi reassortment endişeleri ele almak gerekir.
PPI yerinde tespiti için alternatif yaklaşımlar ko-immünboyama, Förster rezonans enerji transferi (FRET) ve bimoleküler floresan kompleman (BiFC) vardır. Ko-immünboyama sabit solucan dokusunda ilgi iki protein eşzamanlı algılama ve sinyal kolokalizasyonu ölçüde ölçümü dayanır. Standart mikroskopi7daha fazla ayrıntı sunan süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımı, 200-300 nm8kırınım sınırlı bariyer ötesinde protein kolokalizasyonu daha sıkı test etmek için yardımcı olur. Ancak, hem konvansiyonel hem de süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak ko-immünboyama iyi tanımlanmış lokalizasyon desenleri olan proteinler için en iyi çalışır. Buna karşılık, yaygın olarak dağıtılan etkileşimli ortaklar için çok daha az bilgilendirici hale gelir. Örtüşmeye dayalı sinyallerin birlikte lokalizasyonu için ölçüm proteinlerin birbiriyle karmaşık olup olmadığı hakkında doğru bilgi sağlamaz9,10.
Ayrıca, protein-protein komplekslerinin ko-immünopresipitasyon ve ko-immünboyboyama kantitatif değildir, bu tür etkileşimlerin önemli olup olmadığını belirlemek zor hale. FRET ve BiFC floresan tabanlı tekniklerdir. FRET floresan proteinler ile ilgi proteinleri etiketleme dayanır (FPs) hangi bir FP enerji transfer spektral örtüşme var (donör) başka bir FP (alıcı)11aktarılır. Enerjinin bu radyatif olmayan transferi, kendi dalga boyunda tespit edilebilen alıcı FP'nin floresanlığına neden olur. BiFC in vivofloresan proteinin yeniden yapılandırılmasına dayanır. GFP'nin helikes 1-10 ve helix 1112gibi iki tamamlayıcı parçaya bölünmesini gerektirir ve bu parçalar daha sonra iki proteinle kaynaşır. Eğer bu iki protein etkileşirse, GFP'nin tamamlayıcı parçaları katlamak ve biraraya gelmek için yeterince yakınlaşır ve GFP floroforu yeniden kurar. Yeniden oluşturulan GFP daha sonra doğrudan floresan olarak gözlenir ve üfe'nin nerede oluştuğunu gösterir.
Bu nedenle, hem FRET hem de BiFC, etiketlenen proteinin işlevini bozabilecek büyük floresan etiketlere bağlıdır. Buna ek olarak, FRET ve BiFC doğru veri elde etmek için etiketli proteinlerin bol ve karşılaştırılabilir ifade gerektirir. FRET, bir ortağın diğerini aşan olduğu ve yüksek arka plan13'eyol açabilen deneyler için uygun olmayabilir. BiFC denemelerinde aşırı ifadeden de kaçınılmalıdır, çünkü bu, daha yüksek arka planla sonuçlanan nonspesifik derleme14'ü tetikleyebilir. Her iki teknik de, etiketli proteinlerin ekspresyonu ve görüntüleme koşullarının optimizasyonu gerektirir, bu da deneyleri tamamlamak için gereken süreyi uzatabilir.
Yakınlık ligasyon tsurju (PLA) yukarıda bahsedilen tekniklerin sınırlamalarını ele alabilecek alternatif bir yaklaşımdır. PLA, ilgi çeken proteinleri (veya etiketlerini) tanıyan birincil antikorlardan yararlanır. Bu primer antikorlar daha sonra 40 nm (veya daha kısa) mesafe15içinde birbirleriyle melezleşebilir oligonükleotid probları içeren ikincil antikorlar ile bağlanır. Ortaya çıkan melezdna, DNA'yı tamamlayan problar tarafından algılanan bir PCR reaksiyonu ile güçlenir. Bu bir mikroskop tarafından görselleştirilmiş foci sonuçlanır. Bu teknoloji, gelişim ve farklılaşmanın çeşitli aşamalarında hücreleri içeren bir montaj hattı olarak organize edilen karmaşık dokularda (yani solucan gonad) yerinde PPI'ları algılayabilir. PLA ile PPI'lar sabit solucan gonad'da doğrudan görselleştirilebilir, bu da PPI'ların gelişimin belirli bir aşamasında oluşup oluşmadığını araştırmak için avantajlıdır. PLA, kesin ölçümler yapmak için ideal olan eş-lokalizasyon tabanlı tahliller yerine PPI'lerin daha fazla çözünürlüğü sunar. Kullanılırsa, süper çözünürlüklü mikroskopi bir hücre içinde PLA foci konumu hakkında ince ayrıntı sağlama potansiyeline sahiptir. Başka bir avantajı pla reaksiyonları kaynaklanan foci bir ImageJ tabanlı analiz iş akışı ile sayılır olabilir, bu tekniği nicel hale.
Dynein Hafif Zincirleri LC8 ailesi ilk dynein motor kompleksi16 bir alt birim olarak tanımlanan ve bir kargo adaptörü olarak hizmet hipotezi. İlk keşfinden bu yana, LC8 dynein motor kompleksi ek olarak birden fazla protein kompleksleri bulunmuştur17,18,19,20. LC8 etkileşim motifi içeren protein dizileri için tarama19 LC8 farklı proteinlerin geniş bir dizi ile birçok etkileşimleri olabileceğini düşündürmektedir17,18,19,20,21,22. Sonuç olarak, LC8 aile proteinleri şimdi daha büyük protein kompleksleri montaj teşvik yardımcı hub olarak kabul edilir19,22, özünde düzensiz proteinlerin meclisleri gibi21.
Bir C. elegans LC8-aile protein, dynein ışık zinciri-1 (DLC-1), yaygın birçok dokular arasında ifade edilir ve belirli hücre altı yapılarda zenginleştirilmiş değil23,24. Sonuç olarak, C. elegans DLC-1 biyolojik olarak ilgili in vivo ortaklarının belirlenmesi çeşitli nedenlerle zor: 1) co-immünoprepitasyon etkileşimoluşur doku kaynağı göstermez; 2) belirli ortakların sınırlı ekspresyonu veya geçici etkileşimleri co-immünoprepitasyon ile bir etkileşimi tespit etme yeteneğini engelleyebilir; ve 3) DLC-1 diffüz dağılımı co-immünboyama tarafından potansiyel ortak proteinler ile non-spesifik örtüşme yol açar. Bu zorluklara dayanarak PLA, DLC-1 ile in vivo etkileşimlerini test etmek için ideal bir yaklaşımdır.
Daha önce DLC-1 ile doğrudan etkileşim ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB) FBF-223 ve GLD-1 25 için bir kofaktör olarak hizmetbildirilmiştir. Çalışmalarımız dlc-1 bir hub protein olarak hizmet modeli destekler ve DLC-1 dynein ötesinde kapsayan bir etkileşim ağı kolaylaştırır düşündürmektedir19,22. GST pulldown tetkik kullanarak, OMA-1 adlı yeni bir DLC-1-etkileşen RBP26tespit edilmiştir. OMA-1 yumurta büyümesi ve meiyotik olgunlaşma27 için önemlidir ve bir dizi çevirisel baskılayıcı ve aktivatörlerle birlikte işlevler28. FBF-2 ve GLD-1 sırasıyla kök hücreler ve meyolitik pakiten bölgelerinde ifade edilirken, OMA-1 oositler27 ile meiyotik pachytenden mikropta yaygın olarak ifade edilir (Şekil 1). Bu, DLC-1 gonad farklı bölgelerde RbPs ile kompleksleri oluşturur düşündürmektedir. Ayrıca in vitro gözlenen DLC-1 ve OMA-1 arasındaki doğrudan etkileşim in vivo IP ile kurtarılamadı bulunmuştur. PLA başarıyla C. elegans germline bu etkileşimi daha fazla çalışma için alternatif bir yaklaşım olarak kullanılmıştır, ve sonuçlar PLA solucan diğer birçok PPIs araştırmak için kullanılabilir öneririz.

<table><tbody><tr><td>% 16 paraformaldehit çözeltisi</td><td>Elektron Mikroskobu hizmetleri</td><td>15710</td><td>% 4 çalışma çözeltisi yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>1M KH2PO 4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>1M çalışma stoğu</td></tr><tr><td>hazırlayın 1x M9</td><td>çeşitli</td><td></td><td>1x'te kullanılan 10x stok olarak hazırlanır;</td></tr><tr><td>1x PBS</td> protokolü için wormbook.org <td>bakın çeşitli</td><td></td><td>çeşitli bkz. Protokol için</td></tr><tr><td>wormbook.org 26.5 Ölçer İğne</td><td>Exel International</td><td>26402</td><td>Diseksiyon için kullanılan iğneler</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Lampire</td><td>7500802</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>05-529C</td><td>Senkronizasyon için kullanılan 50ml Meşe sırtı santrifüj tüpü</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Kavanoz</td><td>PolyLab</td><td>62101</td><td></td></tr><tr><td>Numune Küresini Dondurmak için Lamel</td><td>Scientific</td><td>1411-10</td><td>22x40mm, No. 1</td></tr><tr><td>Conta Slayt</td><td>Küresi</td> için Lamel Scientific <td>1404-15</td><td>22x22mm, No. 1.5</td></tr><tr><td>İmmünofloresan Vektör</td><td>H-1200</td><td></td>Ligaz için DAPI Montaj <td>Ortamı</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82029</td><td>Duolink 1x Ligaz, Duolink Yerinde Tespit Reaktifleri Kırmızı kitin bir parçası olarak gelir DUO92008</td></tr><tr><td>Amplifikasyon kırmızı tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82011</td><td>Duolink 5x Amplifikasyon Kırmızı tamponu, Duolink Yerinde Algılama Reaktifleri Kırmızı kitinin bir parçası olarak gelir DUO92008</td></tr><tr><td>Ligasyon Tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82009</td><td>Duolink 5x Ligasyon tamponu, Duolink Yerinde Tespit Reaktifleri Kırmızı kitinin bir parçası olarak gelir DUO92008</td></tr><tr><td>Antikor seyreltici</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82008</td><td>Duolink antikor seyreltici, DUO92004 ve DUO92002 ile birlikte gelir, Not: Antikoru seyreltmek için ikame olarak 1x PBS /% 1 BSA çözeltisi de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Engelleme Çözümü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82007</td><td>Duolink engelleme çözümü, PLA için DUO92004 ve DUO92002</td></tr><tr><td>Montaj Ortamı</td> ile birlikte gelir <td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td> DAPI MINUS Probu ile <td>Duolink Yerinde montaj ortamı</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Duolink Yerinde Prob Anti-Fare MINUS</td></tr><tr><td>PLUS Probu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Duolink Yerinde Probu Anti-Rabbit PLUS</td></tr><tr><td>Yıkama Tamponu A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink Yerinde Yıkama Tamponu A</td></tr><tr><td>Yıkama Tamponu B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Duolink Yerinde Yıkama Tamponu B</td></tr><tr><td>Polimeraz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82030</td><td>Duolink Polimeraz, Duolink Yerinde Tespit Reaktiflerinin bir parçası olarak gelir</td></tr><tr><td>Epifloresan Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td> <td>DUO92008 Kırmızı kitDFC300G kamera, DM5500B mikroskobu</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare Alexa 594</td><td>JacksonImmuno</td><td>115-585-146</td><td>1:500'de kullanın</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Alexa 488</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-545-144</td><td>1:200'de kullanın</td></tr><tr><td>Görüntü İşleme Yazılımı</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td></tr><tr><td>Cam Pipet</td><td>Corning</td><td>7095B-5X</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>ACROS Organikler</td><td>187870100</td><td>250mM çalışma stoğu hazırlayın</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>İmmünofloresan ve PLA için 1:1000'de kullanın, normal keçi serumu ile ön blok önerilir</td></tr><tr><td>Nailpolish</td><td>LA renkleri</td><td>CNP195</td><td></td></tr><tr><td>Nematod Büyüme Ortamı (NGM)</td> <td>çeşitli</td><td></td><td>wormbook.org bakınız protokol</td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>JacksonImmuno</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Pastör Pipet</td><td>Küresi Scientific</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>Suda% 0.1 stok çözelti olarak hazırlanır, -20C'de saklanır ve slaytları kaplamak için suda 1:100 oranında seyreltilir</td></tr><tr><td>Petri Kapları</td><td>Tritech</td><td>PD7060</td><td>60 mm çaplı</td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>G10362</td><td>İmmünofloresan için 1:200'de, PLA Slaytlar için 1:4000'de kullanın</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>30-2066A-Kahverengi</td><td>Çubuklu üç kare 14x14 mm otoklavlanabilir slaytlar Fisher Scientific aracılığıyla özel olarak sipariş edilir. Laboratuvardaki slaytlara eklenen Poli-L-Lizin</td></tr><tr><td>Sodyum Hipoklorit çözeltisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>görev mendilleri</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>4.4x8.4 inç görev mendilleri</td></tr><tr><td>Tepsiler (242x241x20mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>240845</td><td>Nemli oda yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf su</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>Milli-Q Entegre Su Arıtma Sistemi Watchglass</td></tr><tr><td></td><td>Carolina Biological</td><td>742300-20</td><td></td></tr> <tr>&den elde edilen ultra saf su<td>; C dondurucu-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>derece C dondurucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Folyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 suşu E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Bu çalışmada kullanılan nematod suşları (her ikisi de istek üzerine temin edilebilir)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; UNC-119 (ed3) III; teIs1 [pRL475]</td><td></td><td>UMT 376</td><td>dlc-1 balo::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 balo::oma-1::GFP; Referans 24</td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td><td></td><td>UMT 422</td><td>dlc-1 balo::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 balo::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Referans: bu çalışma</td></tr></tbody></table>

yakınlık ligasyon tayini kullanılarak c. elegans germline ribonükleoprotein kompleksi montaj yerinde algılama

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Protein-protein etkileşimlerinin (PPI) ne zaman ve nerede oluştuğunu anlamak, hücredeki protein işlevini ve gelişim gibi daha geniş süreçlerin ne kadar etkilendiğini anlamak için çok önemlidir. Caenorhabditis elegans germline kök hücrelerin düzenlenmesi ile ilgili PPIs eğitimi için harika bir model sistemidir, kekozis, ve gelişme. İlgi proteinlerin standart antikorlar tarafından tanınmak üzere etiketlenmelerine olanak tanıyan çeşitli iyi geliştirilmiş teknikler vardır, bu da bu sistemi yakınlık ligasyon testisi (PLA) reaksiyonları için avantajlı hale getirir. Sonuç olarak PLA, ppi'lerin germlines'de mekansal ve zamansal bir şekilde nerede oluştuğunu alternatif yaklaşımlardan daha etkili bir şekilde gösterebiliyor. Burada açıklanan uygulama ve c. elegans germline ppis araştırmak için bu teknolojinin niceliklendirme için bir protokoldür.

Her iki 3xFLAG co-immunostaining::DLC-1; GFP ve 3xFLAG::DLC-1; OMA-1:::BAYRAK ve GFP antikorları ile GFP mikropları germline ifade desenlerini ortaya koymuştur (Şekil 3Aii-iii,3Bii-iii). GFP germline boyunca ifade edilirken(Şekil 3Aiii),OMA-1:::GFP ekspresyonu geç pakimeten ve oositlerle sınırlandırılmıştır (Şekil 3Biii)27. BA...

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

Yakınlık ligasyon tsalimi, kullanıcıların protein-protein etkileşimlerini yerinde algılamalarını sağlar ve etkileşimlerin mekansal ve zamansal desenlerini ortaya çıkarır. Bu teknik, C.elegans gelişiminin düzenlenmesi ile ilgili önemli soruların cevaplanabiliyor. Bu teknik, FRET ve BiFC gibi diğer tekniklerin karmaşıklığı olmadan protein-protein etkileşimlerinin saptanması için karşılaştırılabilir duyarlılık sunar.Gonadları serbest bırakmak için solucanları hiç kesmemiş bireyler bu adımla mücadele edebilirler. Solucanları inceleme alıştırması yapın ve PLA'ya geçmeden önce kullanım ve diseksiyon tekniklerini mükemmelleştirmek için bunları immünororesans için kullanın. Başlamak için, 1x M9 ve levamisole 500 mikrolitre içeren bir saat cam çanak içine 30 ila 40 genç yetişkin solucanlar seçin.Solucanlar topladıktan sonra, dikkatle kaldırmak ve solucanlar ile birlikte transfer bakterileri kaldırmak için ortamın çoğunu atın. 1x M9 ve levamisole taze 500 mikrolitre ekleyin ve yavaşça çizmek ve solucanlar durulamak için medya dağıtmak için pipet kullanın. Ortamın çoğunu dikkatlice çıkarın ve atın.Yıkamayı 2-3 kez tekrarlayın. YıkTıktan sonra solucanları yaklaşık 100 mikrolitre lik bir ortamda sekiz dakikadan fazla bekletin. Bir cam veya polietilen pipet kullanarak, solucanları %001 poli-L-l-lizin ile kaplanmış 25 milimetrelik 75 milimetrelik mikroskop kaydıranına aktarın.Slaytta yaklaşık 15 mikrolitre ortam kalması için fazla ortamı kaldırın. Aşırı arabelleğin kaldırılması, parçalanmış solucanların ve gonadların slayta yapışmasını sağlamak için çok önemlidir. Bir diseksiyon mikroskop altında, iki 26 1/2-gauge iğneler ile, uçları makas bir çift oluşturacak şekilde diğer üzerinde bir iğne yerleştirin.Bu şekilde odaklı iğneler kullanarak, germlines serbest bırakmak için farinks arkasındaki solucanlar kesti. Beş dakika içinde tüm solucanları inceleyin. Tüm solucanlar kesildikten sonra, slamanın üzerine 22 milimetrelik 40 milimetrelik bir kapak kayması yerleştirin, böylece kaydırağa dik kalır.Kapak kaymasının uçları slayttan sarkmalıdır. En az 20 dakika kuru buz üzerinde muhafaza önceden soğutulmuş alüminyum blok slaytlar dondurun. Buz genişlemesi nedeniyle kapağın gevşemesini önlemek için kapağın üzerine soğutulmuş bir kalemi yavaşça yerleştirin.Fiksasyon için hazır olduğunuzda, bir kalem ile kapakları kapalı flick ve hemen bir dakika için taze, buz gibi metanol içeren bir kavanoza slayt daldırma. Daha sonra numuneyi çevreleyen slaytın kenarlarını hafifçe silin ve beş dakika boyunca düzeltmek için oda sıcaklığında 150 mikrolitre formaldehit fiksatif uygulayın. Fiksatif slayt kapalı çalıştırmak ve kağıt havlu içine absorbe izin dik 90 derecelik açıyla bir kağıt havlu slayt dokunun.50 mililitre PBT/BSA içeren coplin kavanozunda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca slaytları iki kez engelleyin. Daha sonra% 10 normal keçi serumu içeren bir PBT / BSA çözeltisi ile slaytlar blok. Slaydın çevreleyen kenarları yavaşça silin ve her slayta çözeltinin 100 mikrolitresini uygulayın.Ve yavaşça çözüm yayılmasına yardımcı olmak için slayt ajite. Nemli bir odada oda sıcaklığında bir saat kuluçka. Çözümün slayttan akmasını sağlamak için slaydı kağıt havlunun üzerine yerleştirin ve kenarları nazikçe silin.Slaytları engellemek için, 14 milimetreye 14 milimetrelik alana blokaj reaktifinin bir damlasını uygulayın. Kaydırakları nemli bir odada 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Engelleme reaktifinin slayttan akmasını sağlamak için slaytları kağıt havlunun üzerine yerleştirin ve kenarları nazikçe silin.Birincil antikorları seyreltmek için antikor dilüent kullanın. Slaytlara seyreltilmiş primer antikor çözeltisinin 40 mikrolitresini 14 ila 14 milimetrelik alana uygulayın. Bir nemli odaya slaytlar yerleştirin ve dört santigrat derece gecede kuluçka.Sabahları, slaytları beş dakika boyunca iki kez yıkayın, her biri Coplin kavanozundaki oda sıcaklığında 50 mililitre 1x yıkama tamponu A ile. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın. Kaydırma tamponunu kaydırağının akmasına izin vermek için slaytları kağıt havlunun üzerine yerleştirin ve kenarları nazikçe silin.Artı ve eksi problar içeren 40 mikrolitrelik bir çözelti hazırlayın. Çözümü her 14'e 14 milimetrelik alana ekleyin. 37 santigrat derece bir saat boyunca nemli bir odada slaytlar kuluçka.Kaydırakları her biri coplin kavanozunda oda sıcaklığında 50 mililitre 1x yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın. Ligasyon tamponunu 1-5'e kadar ultra saf su ile seyreltin.Ligasyon çözeltisi çalışan bir stok hazırlamak için ligaz 1 ila 40 seyreltmek için bu tampon kullanın. Yıkama arabellesinin yanlardan akmasını sağlamak için slaydı kağıt havlunun üzerine yerleştirin ve kenarları nazikçe silin. Her 14 ila 14 milimetrelik alana 40 mikrolitre ligasyon çözeltisi ekleyin.37 santigrat derece 30 dakika nemli bir odada slaytlar kuluçka. Slaytları daha önce açıklandığı gibi yıkayıp kuruttuktan sonra, her 14'e 14 milimetrelik alana ışıktan korunan 40 mikrolitre taze hazırlanmış amplifikasyon çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derece bir saat ve 40 dakika boyunca nemli, karanlık oda slaytlar kuluçka.Slaytları her biri 10 dakika boyunca 10'ar mililitre 1x yıkama tamponU B ile yıkayın ve slaytları bir dakika boyunca 50 mililitre 01x yıkama tamponU B.Slaytın epoksi kaplı çevresini kuruttuktan sonra, her numuneye 10 mikrolitre montaj ortamı ekleyin ve üzerine hafifçe bir kapak koyarak montaj ortamının yayılmasını bekleyin. Coverslip ve slayt mühür için oje ile coverslip kenarına boya. Kapak kaymasını hareket ettirmekten kaçının.Ojenin ışıktan korunduğu oda sıcaklığında en az 20 dakika sertleşsin. Flag ve GFP antikorları ile germlines co-immunostaining germline ifade desen ortaya. GFP germline boyunca ifade edilirken, OMA-1:GFP ekspresyonu geç pakimeten ve oositlerle sınırlıydı.BAYRAK immünboyama 3xFLAG:DLC-1 her iki suşlarda da germline boyunca ifade edildiğini göstermektedir. Germline PLA nicelleştirme için ilgi bölgesi tüm germlines yumurtayoluyla geç pachytene kapsamaktadır. Burası OMA-1 ifadesinin bulunduğu bölgedir.3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP germlines 3xFLAG:DLC-1, GFP mikropları ile karşılaştırıldığında bu bölgede PLA foci daha büyük miktarda olduğu ortaya çıktı. Haznedeki nemi yükseltmek için yeterli su olduğundan emin olun. Ayrıca, reaktiflerin akmasını önlemek için slaytların oda nın içinde eşit olduğundan emin olun.Yakınlık ligasyon testinin ardından, ekstrüde gondadlar konfokal mikroskop üzerinde görüntülenebilir ve Fiji, ImageJ iş akışı kullanılarak ölçülebilir. Bu niceleme etkileşimistatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için yardımcı olabilir. PLA bize nematod germline gelişimi kritik düzenleyiciler arasındaki yerinde etkileşimleri değerlendirmek için izin verdi.

in-situ-detection-ribonucleoprotein-complex-assembly-c-elegans

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Bu video, Yakınlık Ligasyon Testi (PLA) kullanılarak Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini göstermektedir. Vücut duvarlarını izole ettikten sonra, etkileşen proteinler birincil antikorlar ve PLA ile konjuge ikincil antikorlar ile incelenir. Etkileşen proteinlerin yakınlığı, probların konektör oligonükleotidleri ile bağlanmasını kolaylaştırır, dairesel DNA oluşturur ve bu daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu ile amplifiye edilir.

Drosophila Larvalarında Protein-Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testi Kullanılarak Saptanması

Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.

Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Tekrarlayan dizileri gözlemlemek ve ölçmek için Caenorhabditis elegans'ın gonadında ve embriyolarında kısa bir floresan in situ hibridizasyon (FISH) prosedürü rapor ediyoruz. Telomer tekrarları ve telomerlerin alternatif uzama şablonu (TALT) olmak üzere iki farklı tekrarlayan diziyi başarıyla gözlemledik ve ölçtük.

Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan<em&gt; In Situ</emPNA Sondalar&gt; ile hibridizasyon (FISH)<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Biz disseke C. aktif ERK mekansal ve zamansal lokalizasyonu için immünofloresan görüntüleme bazlı yöntem mevcut elegans gonad. Burada açıklanan protokol C herhangi bir sinyal görüntülenmesi veya yapısal protein için uyarlanabilir elegans yumurtalık, uygun bir antikor reaktifi kullanılabilir sağladı.

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

D-döngü yakalama (DLC) ve D-döngü uzatma (DLE) testleri, Saccharomyces cerevisiae'de indüklenebilir çift sarmallı bir kırılma yerinde D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve ürün oluşumunu ölçmek için kantitatif PCR ile birlikte yakınlık ligasyonu prensibini kullanır.

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

Öğrenin, C. elegans germ hattında protein-protein etkileşimlerini yerinde tespit etmek için yakınlık ligasyon tayini yöntemini. Bu teknik, gelişim süreçlerinin düzenlenmesi hakkında önemli bilgiler sağlar.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Daha fazla video keşfet