Name: Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Keşfedin, Drosophila melanogaster hemositlerinde fagositoz yeteneğini değerlendirmek için in vivo fagositoz analizi yöntemini. Bu teknik, bireysel hücrelerde fagositik olayları nicelendirmeyi ve genotipler arası varyasyonları tespit etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R03 AG061484-02 ve UMBC Doğa ve Matematik Bilimleri Fakültesi Becton Dickinson Fakültesi Araştırma Fonu'ndan gelen hibelerle desteklenmiştir.

<ol><li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+DNA%2FRNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).</li>
<li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+and+aging%3A+the+enemy+within%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li>
<li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).</li>
<li>Panda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+innate+immunosenescence%3A+causes+and+consequences+for+immunity+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age.</a> Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).</li>
<li>Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosenescence%3A+emerging+challenges+for+an+ageing+population%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population.</a> Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).</li>
<li>Min, K. -J., Tatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+mechanism+of+immunosenescence+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472(2018).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+fly%3A+a+primer+on+the+Drosophila+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for hematopoiesis.</a> Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li>
<li>Garschall, K., Flatt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+immunity+and+aging+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">The interplay between immunity and aging in Drosophila.</a> F1000Research. 7, (2018).</li>
<li>Brennan, C. A., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%3A+The+genetics+of+innate+immune+recognition+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response.</a> Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+a+fundamental+process+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: a fundamental process in immunity.</a> BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).</li>
<li>Stuart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+analysis+of+the+Drosophila+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A systems biology analysis of the Drosophila phagosome.</a> Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).</li>
<li>Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+of+the+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).</li>
<li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li>
<li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).</li>
<li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html">https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html</a> (2019).</li>
<li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+food+quality+affects+adult+%28but+not+larval%29+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Goto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+haemocyte-specific+protein%2C+hemolectin%2C+similar+to+human+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor.</a> Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).</li>
<li>Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardin%2C+a+Drosophila+collagen%2C+facilitates+accumulation+of+hemocytes+at+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart.</a> Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).</li>
<li>Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+proliferation+of+adult+hemocytes+in+Drosophila+by+BrdU+incorporation+and+PH3+expression+in+response+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection.</a> Wellcome Open Research. 3, (2018).</li>
<li>Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95(2018).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li>
<li>Gyoergy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+allowing+independent+visualization+and+genetic+manipulation+of+Drosophila+melanogaster+macrophages+and+surrounding+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).</li>
<li>Bosch, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+of+adult+Drosophila+do+not+expand%2C+but+control+survival+after+bacterial+infection+by+induction+of+Drosocin+around+their+reservoir+at+the+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia.</a> BioRxiv. 578864, (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan protokol, fagositözün farklı yönlerini kontrollü deneysel koşullar altında ölçmenin güvenilir bir yoludur. Biz sadece gram negatif bakteriyel parçacıklar ile bu prosedürü test ettik ve gram pozitif bakteriyel parçacıklar kullanılırsa sonuçları farklı olabilir unutmayın. Gerçekten de, farklı deneysel koşullarda hem gram negatif hem de gram pozitif bakterilere fagositik yanıtları karşılaştırmak ilginç olacaktır. Nano-enjektör kullanımı enjeksiyon hacimleri üzerinde hassas kontrol sağlar, her sinek parçacıkların aynı hacimde enjekte edilmesini sağlamak. Protokole sınırlama bir parçacık preparatları tutarsızlıklar geliyor. Parçacıklar dondurulduktan sonra toplanır, bu yüzden seyreltme hacimleri veya girdap eksikliğindeki küçük değişimler deneyler arasındaki parçacık konsantrasyonunu etkileyebilir. Yaşlar arasındaki partikül konsantrasyonlarında olası değişimleri en aza indirmek için, aynı iğne ve parçacık solüsyonu kullanarak aynı gün 1-5 haftalık sinekler enjekte etmek yararlıdır. Başka bir potansiyel dezavantajı diseksiyon sırasında, sırt damarı ve / veya mite kolayca pimleri düzgün ele değilse zarar görebilir. Dorsal damarı bozmamak için, diseksiyon başına kullanılan pim sayısını en aza indirin. Bu diseksiyon yönteminin avantajı, diseksiyon plakasında tüm fiksasyon, yıkama ve boyama adımlarının yapIlebilmektedir. Cuticles aşağı sabitlenmiş olduğundan, bu basamaklar arasında kaybolan cuticles önler.
Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında18,19,25,26,27,28,29, açıklanan protokolün avantajları ve sınırlamaları vardır. Dorsal damarı inceleyerek, bu konumdaki tek tek hemositleri görselleştirebilir ve ölçebiliriz. Bu, deney grupları arasındaki fagositik aktivitedeki ince varyasyonları algılamayı mümkün kılar. Diğer yöntemler bir Bleed / Kazıma titre19kullanarak hemositler toplayarak floresan etiketli parçacıklar görselleştirmek19,25,26,27, veya bozulmamış ventral cuticle18,19,28,29; ancak dorsal miteile görüntülendiğinde bireysel hemositler değerlendirilemez. Bu protokolün avantajı, Bleed / Kazıma yöntemi ile karşılaştırıldığında bizim yöntem bize sadece dorsal damar ile ilişkili hemositler değerlendirmek için izin verir, ve dolaşım hücreleri veya vücut duvarı boyunca olanlar için hesap yok, hangi fonksiyonel olarak farklı olabilir. Dorsal damar diseksiyon da bir floresan quencher ile enjeksiyonlar ikinci bir tur dahil etmek ihtiyacını ortadan kaldırır, Trypan mavi gibi19,26. Bunun nedeni, bir hücreye bağlı olmayan veya yutulmayan parçacıkların yıkama adımları sırasında yıkanmasıdır. Tersine, diseksiyon gerektirmedikleri için alternatif yöntemlerin yapılması daha kolay olabilir. Dorsal damar diseksiyon öğrenmek kolay olsa da, bu adım bazı deneysel tasarımlarda mümkün olmayabilir karmaşıklık düzeyi ekler.
Bu in vivo fagositoz testinin açıklanan kullanımı farklı yaşlar arasındaki fagositik olayları değerlendirmek ve ölçmek için olsa da, bu protokol son derece uyarlanabilir ve genotip, cinsiyet veya doku tipi arasındaki fagositozun farklı yönlerini analiz etmek için kullanılabilir. Fagositozun çoğu hücreli hayvan için merkezi öneme sahip olması nedeniyle, bu sürecin yaşla birlikte nasıl azaldığını anlamak yaşlanan popülasyon için daha iyi tedavi edici tedavilere yol açabilir. Bu yaklaşım, fagositöz özel olarak, bağışıklık yanıtındaki yaşa bağlı değişikliklerin yönlerini açıklamak için uzun vadeli bir potansiyel sunmaktadır.

Enfeksiyona karşı fiziksel ve kimyasal engellerin yanı sıra hücresel bileşenlerden oluşan doğuştan gelen bağışıklık sistemi, çok hücreli organizmalar arasında korunmuş evrimsel dir1,2. Savunma ilk satırı olarak, doğuştan gelen bağışıklık sistemi tüm hayvanlarda işgal patojenler mücadelede kritik bir rol oynar1,2,3. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bileşenleri, özgüllük ve immünolojik bellekeksikliği2,3,4temelinde sınıflandırılır hücre tipleri geniş bir yelpazede içerir. İnsanlarda, Bu hücre tipleri fagositik monositler ve makrofajlar, nötrofiller ve sitotoksik doğal katil hücreleriçerir 4,5. Fonksiyonel bir bağışıklık sistemine sahip olmak konak sağkalım için zorunlu olmakla birlikte, bağışıklık hücrelerinin işlevini yaşla birlikte azalır açıktır, immünosenescence olarak bilinen bir fenomen5,6. Fagositoz sürecinin farklı yönleri de dahil olmak üzere bağışıklık yanıtıyaşa bağlı değişiklikleri değerlendirmek için güçlü olmak, immünosenescence anlayışımızda yardımcı olabilir. Burada tanımladığımız prosedür, Drosophila melanogaster'deki hemositler tarafından fagositik olayları değerlendirmek ve ölçmek için etkili ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar.
Drosophila birçok nedenden dolayı bağışıklık yanıtı eğitimi için ideal bir modeldir. Birincisi, mümkün bir doku bağımlı bir şekilde gen ekspresyonu işlemek için yapmak genetik araçlar geniş bir dizi mevcuttur7. Bu araçlar mutantlar bir koleksiyon içerir, RNA girişim stokları, GAL4/UAS stokları, ve drosophila Genetik Referans Paneli hangi içeren 205 farklı inbred hatları hangi tüm genom dizileri kataloglanır8. Drosophila kısa yaşam döngüsü ve bireylerin üretilen çok sayıda araştırmacılar kontrollü bir ortamda birden fazla kişi test etmek için izin, kısa bir süre içinde. Bu büyük ölçüde genotipler arasında enfeksiyona bağışıklık yanıtları ince farklılıkları belirlemek için yeteneğini geliştirir, cinsiyetler arasında veya yaşlar arasında. Daha da önemlisi, birçok genetik bileşenleri ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı fonksiyonları, fagositoz da dahil olmak üzere, evrimsel Drosophila ve memeliler arasında korunur1,2.
Drosophila'da, enfeksiyonu takip eden fagositoz süreci, memeli makrofajlarına eşdeğer olan plazmatosit adı verilen fagositik hemositler tarafından gerçekleştirilir9. Hemositler parçacıkların geniş bir yelpazede tanımak ve mikrobiyal patojenler9,10,11,,12,13temizlenmesi için gereklidir. Bu hücreler, benlik olmayan kendini ayırt etmeli reseptörleri çeşitli ifade ve fagositik süreci10,11,12,13,14,15yürütmek için gerekli sinyal olayları başlatmak . Bir parçacık bağlandıktan sonra, bir fagositik fincan 11 oluşturan, bir fagositik fincan11,12,13,14oluşturarak, parçacık etrafında genişletmek için plazma membranı yeniden yapılanma ve plazma membran remodeling tarafından içselleştirilmeye başlar. Bu işlem sırasında, sinyallerin başka bir dizi daha fagositik fincan kapatarak parçacık içselleştirmek için hücre söyler, bir membran bağlı fagozom oluşturan11,12,13,14,15. Fagozom sonra bir olgunlaşma sürecinden geçer, farklı proteinler ile ilişkilendirme ve lizozomlar ile eritme, asidik fagojik oluşan11,12,13,14,15. Bu noktada, parçacıklar verimli bir şekilde bozulabilir ve11, 12,13,1314,,15ortadan kaldırılabilir. Drosophila çalışmaları yaşlı sinekler (4 yaş 4 hafta) genç sinekler (1 haftalık) ile karşılaştırıldığında bir enfeksiyon temizlemek için azaltılmış bir yeteneği olduğunu ortaya koymuştur , muhtemelen nedeniyle, en azından kısmen, fagositoz bazı yönleriyle bir düşüşiçin 16,17.
Burada açıklanan yöntem, fagositozun iki farklı yönünü değerlendirmek için biri standart florofor, diğeri pH duyarlı olan iki ayrı floresan etiketli ısı lı E. coli parçacığı kullanmaktadır: parçacıkların ilk yutulması ve fagolyzozomdaki parçacıkların bozulması. Bu töplinde, floro-parçacık floresan, parçacıklar hemositler tarafından bağlanıp yutulduğunda gözlemlenebilirken, pH'ya duyarlı parçacıklar sadece fagozomun düşük pH koşullarında floresan. Floresan olaylar daha sonra dorsal damar boyunca lokalize hemositler görülebilir. Biz dorsal damar lokalize hemositler odaklanmak, hangi bakteriyel açıklığa katkıda bulunduğu bilinen hemositler bulmak için anatomik bir dönüm noktası sağlamak, ve sürekli onları izole etmek için. Ancak, vücudun diğer bölgelerinde hemositler ve hemolenf de açıklık için önemlidir. Bu hücre popülasyonu üzerinde çalışmamış olmamıza rağmen, genel prosedürümüz bu hücrelerin fagositik tahlilleri için de geçerli olabilir. Yaklaşımımızın bir avantajı, fagositik olayları tek tek hemositler içinde ölçebilmektir, bu da fagositik süreçlerdeki ince değişimi tespit etmemize olanak sağlar. 18 ,19 18küttürüile floresan olayları görselleştiren diğer çalışmalar, toplam hemosit sayısı nın17yaşla birlikte değişmesi beklendiği için bizim olgumuzda özellikle dikkate alınması gereken hemosit sayısındaki farklılıklara dikkat etmemaktadır.

<table><tbody><tr><td>0,10 mm Böcek pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-10</td><td>Burada: pimler ikiye kesilir ve keskin uç</td></tr><tr><td>kullanılır 1 mL steril şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>İğne yüklemek için mineral yağ ile doldurulmuş</td></tr><tr><td>Diseksiyon ortamı için</td><td>%15 Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td>EM sınıfı, %4 çalışıyor, 1X PBS'de seyreltilmiş</td></tr><tr><td>1x Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Trasnfer Pipet</td><td>Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>3.5" Cam Kılcal Damarlar</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td>1.14mm OD X 3.5" uzunluk X 0.53" ID</td></tr><tr><td>35x10 mm Petri kapları</td><td>Becton Dickinson</td><td>351008</td><td>Diseksiyon plakası olarak kullanılır, yarıya kadar doldurulur Diseksiyon ortamı için Sylgard</td></tr><tr><td>6x penisilin / streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr>% <tr><td>70 Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Analog Vorteks karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik nokta forseps, Dumont No. 5</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D1306</td> 1x PBST Drosophila suşu <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>w[*]'de 1:1000 seyreltilmiş; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 suşu) BioParticles & trade;, Alexa Fluor & trade; 594 eşlenik</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>E23370</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Premiere</td><td>D17026102</td><td></td></tr><tr><td>Canlı hücre görüntüleme çözümü</td><td>Life Technologies</td><td>A14291DJ</td> partikül <td>hazırlama ve seyreltme için tercih edilen tampon</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Mpbio</td><td></td><td></td>194836</tr><tr><td>Nanoject II otomatik nanolitre enjektör</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Dar Polistiren Süper Toplu Drosophila Şişeleri</td><td>Genesee</td><td>32-116SB</td><td>Boyut: 25 X 95 mm</td></tr><tr><td>Nutating Mikser</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td>Kullanılan hız: 20 rpm</td></tr><tr><td>pHrodo ve ticaret; Kırmızı E. coli Biyopartiküller ve ticaret; Fagositoz Yaşam Teknolojileri için Konjugat</td><td></td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>Schneider'in Drosophila hücre kültürü ortamı (1x)</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td>Diseksiyon ortamı, birleştirin: Schneiders, FBS ve kalem/strep; filtre sterilize</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>2mM (veya% 20) çalışan</td></tr><tr><td>Yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon elastomer Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>24236-10</td><td>Sağlanan protokole göre hazırlayın</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>PBS için + %0.1 ara</td></tr><tr><td>Dikey Pipet Çektirme Modeli 700C</td><td>David Kopf Aletleri</td><td>812368</td><td>Isıtıcı: 55? Solenoid: 45</td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager.Z1 floresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Here: Zeiss Zen görüntüleme yazılımı ile apotom yapısal girişim sistemi</td></tr></tbody></table>

erişkin drosophila melanogaster hemositlerin yaşa Özgü fagositik yeteneğinin in vivo fagositoz islımı ile değerlendirilmesi

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Fagositoz doğuştan gelen bağışıklık yanıtının önemli bir fonksiyonudur. Bu işlem, birincil işlevi çok çeşitli parçacıkları tanımak ve mikrobiyal patojenleri yok etmek olan fagositik hemositler tarafından gerçekleştirilir. Organizmalar yaşlandıkça, bu süreç azalmaya başlar, henüz altta yatan mekanizmalar veya immünosenescence genetik temeli hakkında çok az bilinmektedir. Burada, erişkin Drosophila'da Drosophila hemositlerde fagositik olayları ölçerek fagositozun farklı yönlerindeki yaşa bağlı değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan bir enjeksiyon, birçok nedenden dolayı bağışıklık fonksiyonundaki yaşa bağlı değişiklikleri araştırmak için ideal bir model haline gelmiştir. İlk olarak, fagositoz da dahil olmak üzere doğuştan gelen bağışıklık yanıtının birçok genetik bileşeni ve fonksiyonları, Drosophila ve memeliler arasında evrimsel olarak korunur. Bu nedenle, bu protokolü kullanarak elde edilen sonuçlar organizmaların çeşitli yaşa bağlı değişiklikler anlamak için yaygın olarak ilgili olması muhtemeldir. Ayrıca, bu yöntemin hemosit fagositik yeteneğin nicel tahminlerini sağladığını ve çeşitli araştırma konuları için yararlı olabileceğini ve yaşlanma çalışmalarıyla sınırlı kalmaması gerektiğini unutmayın.

Açıklanan enjeksiyon yöntemlerini göstermek için Şekil 1A, Drosophila melanogaster'deki enjeksiyon bölgesini ve gıda boyasının sineğin enjekte edildiğinin görsel bir teyidine nasıl izin verdiğini göstermektedir (Şekil 1B). Gıda boyası eklenmesi de tıkanmış bir iğne tanınmasına yardımcı olur. Enjeksiyonlar karın içinde yapılabilir, ancak enjeksiyon alanı deneyler arasında tutarlı tutun. Bu, her deneme arasındaki olası varyasyonları en aza indirmeye yardımcı olur.
Dorsal damar boyunca yerleşik hemositler içinde floresan etiketli parçacıkları görselleştirmek için, dorsal damar ve bağlı karın mitesi diseksiyon. Şekil 2A-F diseksiyon yöntemlerini özetler.
Genç ve yaşlı sineklerin fagositoz yapma kabiliyetini değerlendirmek için, dorsal damar boyunca hemositler floresan mikroskop kullanılarak görselleştirilmektedir. Sadece dorsal damar boyunca hücrelerin sayıldığından emin olmak için, bazı kan hücresi belirteçleri veya kalp spesifik kollajen için antikorlar veya GFP etiketli genler, Hemese ve Hemolectin gibi, veya Pericardin (Şekil 3), sırasıyla, kullanılabilir22,23,24. Floresan olarak etiketlenmiş E. coli partikülleri 1 mm uzunlukta, hemositler ise 10 mm çapında17mm'dir. Sadece DAPI pozitif bir çekirdek üzerinde ortalanmış 10 mm çapında bulunan floresan olaylar sayılır(Şekil 4). Floresan olayları ölçmek için ImageJ yazılımı kullanılır (Şekil 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> Şekil 1: Enjeksiyon yeri ve görsel doğrulama. (A) Toraksın lateral tarafı pull-kılcal iğne ile delinmiş. (B) Enjeksiyonlar parçacık çözeltisine yeşil gıda boyası eklenerek görsel olarak doğrulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> Şekil 2: Dorsal damar diseksiyonu. (A) Pinler toraks ve arka karın (siyah oklar) yerleştirilir. (B-C) Karın arka ucunda(B)ve ön uçta(C)iki yatay kesi (yeşil ok) yapılır. (D) İki yatay kesiği birbirine bağlayan, karın ortasından aşağı doğru dikey bir kesi (yeşil ok) yapılır. (E) İsteğe bağlı iğneler (*) karın boşluğunu açmak için kullanılır, iç doku açığa. (F)İç doku (kırpma, bağırsak, rahim, yumurtalıklar, yağ organları) çıkarılır, dorsal damar açığa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> Şekil 3: Perikardin(A) karşı yönlendirilmiş antikor ile boyanmış, pH duyarlı parçacıklar enjekte 5 haftalık bir kadın dan diseksiyon lu dorsal damar Ventral görünümü . Noktalı beyaz çizgi ön bölgeye işaret eden ok ile, sırt damarının yan tarafında özetliyor. (B) (A) (A) (A)genişlemiş görüntüsü: dorsal kabın ilk aort odası içinde, aktif olarak bakterileri alçaltan hemosit (mavi ok) kümeleri. (C) (A) ekstrasellüler matris özetleyen genişletilmiş görüntü (ECM) kollajen benzeri protein, Pericardin (yeşil ok), yerinde dorsal damar tutan24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> Şekil 4: PH'a duyarlı parçacıklar veya floro-parçacıklar enjekte edilen dişi sinekten kesilen dorsal damar ve ilişkili hemositler. (A) Dorsal damar ve ilişkili hemositler ile yuttu pH hassas etiketli E. coli parçacıkları (kırmızı), veya (E) floro etiketli E. coli parçacıkları (kırmızı), 1 haftalık bir sinek izole, 60 dakika için kurtarma sonra (B,F) Büyütülmüş inset (A) ve (E) (beyaz kutu), sırasıyla, tek tek iki hemosit sayısı ile sayım ile iki hemosit. (C) Dorsal damar ve ilişkili hemositler ile yuttu pH hassas etiketli E. coli parçacıkları (kırmızı), veya ( G) floro etiketli E. coli parçacıkları (kırmızı), 5 haftalık bir sinek izole, 60 dakika için kurtarma sonra (D,H) Büyütülmüş inset (C) ve (G) (beyaz kutu), sırasıyla, tek tek iki hemosit sayısı ile sayım ile iki hemosit. Noktalı beyaz çizgi ön bölgeye işaret eden ok ile, sırt damarının yan tarafında özetliyor. Dapi (mavi) ile boyanmış çekirdekler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> Şekil 5: ImageJ'deki hücre sayacını kullanarak 10 mm hemosit içindeki fagositik olayların ölçülmesi. (A) ImageJ'de görüntü(ler) açıldıktan sonra, Hücre Sayacı Bildirimi aracı hücre başına fagositik olayları izlemek için kullanılabilir. (B) Bu araç, sayılmak üzere seçilen her hücreye farklı bir renk atayacaktır ve her nokta o hücre içindeki floresan olaya karşılıkgelir. 'alt+y' tuşuna basıldığında, hücre başına sayılan olay sayısını gösteren bir tablo görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, genç ve yaşlı Drosophila melanogaster hemositlerin fagositoz bakterilere yeteneğini değerlendirmek ve ölçmek için kullanılan fagositozun in vivo testinitanımlar.

Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Protokolümüz hemositlerde fagositik olayları değerlendirmek ve ölçmek için etkili ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek tek sineklerde genotipler arasındaki fagositik süreçlerdeki değişimleri tespit etmemizi sağlayan fagositik olayları tek tek hemositler içinde ölçebilmektir. Diseksiyon yapmak zor olabilir, bu nedenle bu tekniği ilk kez uygularken, tam prosedürü gerçekleştirmeden önce mümkün olduğunca diseksiyonlar yapın.Enjeksiyon için cam iğneler hazırlayarak başlayın. Bir milimetrelik şırıngayı mineral yağla doldurun ve nano-enjektörle birlikte verilen 30 göstergeli hipodermik iğneyi takın. 30 gauge iğneyi çekilen kılcal iğnenin künt ucuna yerleştirin ve mineral yağla doldurun.30 gauge iğneyi yavaşça çıkarın ve hava kabarcıklarının oluşmadığından emin olun. Kolluğu çıkarın ve mühürlü O-halkasını girintinyukarı bakacak şekilde yerleştirin. Metal piston üzerine büyük O-halka yerleştirin, sonra sıkma olmadan collet yeniden.Metal pistonu yağ dolu cam iğnenin künt ucuna takın ve yavaşça daha büyük O-halkasına sokarak aşağı doğru itin. Sonra güvenli kadar kollet sıkın. İğneyi floro veya pH'ya duyarlı parçacıklarla doldurduktan sonra, sinekleri toraksın sternopleural plakasında enjekte edin.Yeşil boya sinek gidiyor eğer enjeksiyon başarılı olur. Enjekte edilen sinekleri ilk ve son sineğin enjekte edildiği zamanı belirterek yeni bir besin şişesine yerleştirin. Tüm sinekler yiyeceklere sıkışmalarını önlemek için iyileşene kadar şişeyi yan tarafına yatırın.Sinek ventral tarafını bir diseksiyon stereomikroskopu altında yönlendirin. Sonra toraks içine bir böcek iğnesi yerleştirin ve başka bir genital yakın karın en arka ucundan. Tüm sinekler sabitlendikten sonra, sinekleri kapsayacak kadar diseksiyon ortamı eklemek için bir transfer pipeti kullanın.Mitelik makasla başı çıkarın ve karın daki arka pimin hemen üzerinde yatay bir kesi yapın, sonra da karının en ön ucunda başka bir kesi yapın. Karın boşluğunu açacak iki yatay kesiyi birbirine bağlayan dikey bir kesi yapın. Dorsal damar önlemek için emin olun, iç organları ve doku kaldırmak için forceps kullanın.Gerekirse, miğkül kesme uçlarını sabitlemek için ek iğneler kullanın. Sonra mığla makas ile toraks çıkarın. Diseksiyon ortamını atın ve bir mililitre %4 PFA ile değiştirin, bu da diseksiyonları mümkün olduğunca ışıktan koruyarak.20 rpm sallanan oda sıcaklığında 15 dakika diseksiyon düzeltin. Sonra fiksatif kaldırın ve 1X PBST bir mililitre ekleyin. İstenirse, diseksiyonları antikorlarla lekeleyin.Bir mikroskop slayt üzerinde cuticles monte ettikten sonra, onları ventral tarafı yönlendirmek için forceps kullanın, ve sırt damarı görünür olduğundan emin olun. Genç ve yaşlı sinekler dorsal damar boyunca hemositlerin floresan görüntüleme siperatile fagositoz yapabilme yeteneği açısından değerlendirildi. Perikardin karşı bir antikor sadece dorsal damar boyunca hücrelerin sayılır sağlamak için kullanılmıştır.Floresan etiketli E.coli partiküllerinin uzunluğu bir mikrometre ve hemositlerin çapı 10 mikrometre olduğundan, sadece DAPI pozitif çekirdeğin ortalanmış 10 mikrometre çapındaki floresan olaylar sayılmıştır. ImageJ yazılımı daha sonra olayları ölçmek için kullanılmıştır. Bu yordamı denerken, sineğin gerçekten enjekte edildiğini görselleştirmek ve zamanlamanın çok önemli olduğunu hatırlamak önemlidir.Enjeksiyon ve diseksiyonları zamanında tamamlamak deneysel hatayı ve fagositik hızdaki olası değişimleri en aza indirmeye yardımcı olacaktır. Bu teknik, araştırmacıların hücresel bağışıklık, farklı kan hücrelerinin popülasyonları veya başarılı bir bağışıklık yanıtı sırasında fagositoyu AMP üretiminden ayırt etme gibi çeşitli araştırma konularını keşfetmelerine olanak sağlayacaktır.

assessing-age-specific-phagocytic-ability-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Drosophila hemolenf, larva ve yetişkin aşamalarında vücutta dolaşan hem kan hem de interstisyel sıvı görevi görür. Bu video, dolaşımdaki hücreleri ölçmek için larva hemolenfini toplamak için bir protokolü açıklamaktadır.

Kütikül Bozulması: Drosophila Larvalarından Hemolenf Toplamak İçin Bir Yöntem

Bu video, Drosophila melanogaster'in homojenize embriyonik hücrelerinde apoptotik hücre yutulmasını görselleştirmek için bir immün boyama tekniğini göstermektedir. Bu yöntem, apoptotik hücre yutulmasının derecesini belirleyerek hücresel fizyoloji hakkında bilgi sağlar.

Fagositoz Testi: Drosophila melanogaster'in Embriyonik Hücrelerinde Apoptotik Hücre Yutulmasını Görselleştirmek İçin Bir İmmün Boyama Tekniği

Bu video, yetişkin Drosophila sineklerinde bakteriyel fagositozu ölçmek için tasarlanmış bir in vivo testi göstermektedir. Floresan işaretli bakterilerin yetişkin sineklerin karnına enjekte edilmesini takiben, sırt damarı ile ilişkili hemositler fagositoza girer. Tripan mavisi boyanın eklenmesi, hücre dışı, fagositozlu olmayan bakteriler tarafından yayılan floresanı söndürmeye hizmet eder. Bu su verme işlemi, bir floresan mikroskobu altında gözlemlendiğinde fagositozlu bakterilerin...

Yetişkin Drosophila Sineklerinde Bakteriyel Fagositozu Ölçmek için İn Vivo Bir Test

Drosophila kan hücreleri veya hemositler, yerleşik bölgeler ve dolaşım arasında döngü yapar.  Larvada, yerleşik (sapsız) hemositler indüktif mikro ortamlara, Hematopoetik Ceplere lokalize olurken, dolaşımdaki hemositler hemolenf içinde serbestçe hareket eder. Bu protokolün amacı, davranışsal olarak farklı ancak birbirini değiştiren bu iki hemosit popülasyonunun standartlaştırılmış izolasyonu ve miktarının belirlenmesidir.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi Drosophila

Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

Bu protokol, Drosophila'nın embriyodan yetişkine kadar her gelişim aşamasındaki canlılığını değerlendirmek için tasarlanmıştır. Yöntem, farklı genotiplerin veya büyüme koşullarının canlılığını belirlemek ve karşılaştırmak için kullanılabilir.

Drosophila Melanogaster'In Embriyodan Yetişkine Canlılığını Değerlendirmek Için Doğrudan ve Basit Bir Yöntem

Keşfedin, Drosophila melanogaster hemositlerinde fagositoz yeteneğini değerlendirmek için in vivo fagositoz analizi yöntemini. Bu teknik, bireysel hücrelerde fagositik olayları nicelendirmeyi ve genotipler arası varyasyonları tespit etmeyi sağlar.

Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet