Name: Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Keşfedin, luciferaz tabanlı büyüme testiyle Toxoplasma gondii'ye karşı kimyasal inhibitörlerin etkinliğini nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, yüksek verimli tarama için ölçeklenebilir ve parazit çoğalma süresini hesaplar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plazmid ve anti-TgCPL ve TgActin antikorları paylaşımı için Dr Sibley ve Carruthers teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Clemson Startup fonu (Z.D.'ye), Knights Templar Eye Foundation Pediatrik Oftalmoloji Kariyer-Başlangıç Araştırma Hibesi (Z.D.'ye), NIH COBRE hibep20GM109094 (Z.D.'ye) ve NIH R01AI143707 (Z.D.'ye) tarafından desteklenmiştir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Toksoplazma gondii Risk Grubu 2'de sınıflandırılır ve Biyogüvenlik Düzey 2'de (BSL-2) kullanılmalıdır. Protokol Clemson Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.
1. Luciferase tabanlı Toxoplasma büyüme test
<ol><li>Tohum insan sünnet derisi fibroblastlar (HFFs) 1 hafta önce parazit aşısı ev sahibi hücrelerin tam olarak konca olduğundan emin olmak için. Parazitlerin değerlendirme süresi boyunca hücre içi kalmasını sağlamak için şeffaf bir plaka içinde sahte bir tetki gerçekleştirin. NOT: Burada, titreci 96 kuyu mikroplakasında yapılır. Deneysel ihtiyaçlara göre 384 veya 1536 kuyu mikroplakasına kadar ölçeklendirilebilir.</li>
	<li>Toxoplasma parazitlerini kullanımdan 2 gün önce ~ 0.3-0.4 mL tamamen lized edilmiş parazitleri T25 şişesine aktararak confluent HF'lere geçirin. Enfekte konak hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Şırınga 5 mL taze lized parazitler 21 G güvenlik iğnesi ile hücre içi parazitleri kurtarmak için 5x, sonra konak hücre enkaz kaldırmak için 3 μm filtre geçmek. 7 mL fenol kırmızısız D10 ortamı kullanarak şişeden kalan parazitleri durulayın, ardından tekrar filtreden geçirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dk (RT) için 1000 x g centrifuge parazitler. Supernatant dökün ve fenol kırmızı içermeyen D10 medya 10 mL pelet resuspend.</li>
	<li>Konsantrasyonu belirlemek için hemositometre kullanan parazitleri sayın.</li>
	<li>Yabani tip (WT) suşu için parazitleri 1 x 104 parazit/mL'ye seyreltin. Büyüme eksikliği parazit suşları için, buna göre luciferase sinyalleri önemli bir artış gözlemlemek için konsantrasyonu artırmak.</li>
	<li>Aspirasyon ortamı, HF'lerle önceden tohumlanmış 96 kuyu mikroplakasından dikkatlice asetin ve üç teknik çoğaltma ve beş zaman noktasını temsil eden üç sütun ve beş satırlık bir biçimde 150 μL parazit süspansiyonu kuyulara aşılayın.</li>
	<li>Mikro plakayı 37 °C'de ve %5 CO2'yi 4 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>İşgal edilmeyen parazitleri gidermek için kuyulardan ortam aspirasyon, ardından kuyuları her satırda RT fenol kırmızısız ortamla doldurun (ilk satır hariç).</li>
	<li>Eşit hacimlerde PBS ve 2x luciferase tsay tamponu karıştırın ve luciferase substratını 12,5 μM'ye seyreltin.</li>
	<li>Üst sıranın her bir kuyunun içine 100 μL seyreltik luciferase substrat ekleyin. Hücrelerin tamamen düzgün ceremesini sağlamak için mikroplakaları 10 dk boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bir mikroplaka okuyucu kullanarak luciferase aktivitesini ölçün. Plaka okuyucu ayarları Tablo 1'delistelenmiştir. Her okuma 4 saat sonrası enfeksiyon da işgal parazitlerin ilk sayısını temsil eder.</li>
	<li>Orta yı değiştirmeden her 24 saat boyunca her satır için 1,9-1,12 adımlarını 4 gün boyunca tekrarlayın. Bu ölçümler, 24 saat, 48 h, 72 h ve 96 saat enfeksiyon sonrası çoğalan parazitlerin toplam sayısını yansıtır.</li>
	<li>Her zaman noktasında ortalama okumaları hesaplayın ve zaman içinde parazit büyümesindeki kıvrım değişikliklerini belirlemek için 4 saat ortalama okumalara bölün.</li>
	<li>Grafik yazılımı kullanarak verileri çizin. Temsili büyüme okuma tablosu ve RHΔku80'inarsaları ::NLuc parazitleri Şekil 1A,B'degösterilmiştir.</li>
	<li>Katlama süresini hesaplamak için, kuluçka süresi boyunca tek tek zaman noktalarında kat değişikliklerinin log2 değerlerini çizin. Eğimi hesaplamak için doğrusal bir regresyon işlevi kullanın, bu da her türün iki katına çıkma süresini temsil eder(Şekil 1A,C).</li>
</ol>2. Toksoplazma büyümesine karşı kimyasal bileşik inhibisyonu etkinliğinin değerlendirilmesi
NOT: Burada Toxoplasma büyümesinde LHVS inhibisyonunun değerlendirilmesi örnek olarak sunulmuştur. Sekiz farklı LHVS konsantrasyonu test edilir ve her iki RHΔku80için üç biyolojik çoğaltmaların her biri için üç teknik kopya yapılır::NLuc ve RHΔku80Δcpl::NLuc suşları.
<ol><li>Parazit enfeksiyonundan önce, tohum HFF'leri her bir bileşim başına bir biyolojik çoğaltma için üç satır ve dokuz sütun biçiminde 96 kuyu mikroplakasına uğrama gelir. Ana bilgisayar hücrelerinin kullanılmadan önce en az 7 gün büyümesine izin verilir.</li>
	<li>PASS RHΔku80::NLuc ve RHΔku80Δcpl::NLuc parazitler kullanmadan önce 2 gün. Parazit arınması ve nicelleştirme için 1.2-1.6 adımlarını izleyin. Fenol kırmızısız ortamdaki parazitleri 1 x 104 parazit/mL'de yeniden askıya alın.</li>
	<li>Confluent HF'ler içeren bir plakadan aspirasyon ortamı ve her kuyuyu 150 μL parazit resuspension ile aşılayın. Mikro plakayı 37 °C'de ve %5 CO2'yi 4 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Seri seyreltme ile 12 kuyu rezervuarında sekiz farklı konsantrasyonda LHVS hazırlayın. Genellikle, konsantrasyonları seri seyreltme şekilde üç kat azalır. NOT: En düşük konsantrasyon en yüksek konsantrasyona göre 6.561 kat azalır. Seyreltmenin kıvrım değişimi, bileşiklerin farklı özelliklerine göre ayarlanabilir.</li>
	<li>4 saat enfeksiyon sonrası, aspire medya olmayan işgal parazitleri kaldırmak ve farklı konsantrasyonlarda LHVS ile desteklenen medya 150 μL ile sütun 2-9 her iyi doldurmak. Tedavi edilmeyen bir kontrol olarak hizmet vermek için normal ortam la dolu ilk sütunu bırakın.</li>
	<li>Mikro plakayı 37 °C ve %5 CO2'de ilave 96 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>1.9-1.11 adımlarını gerçekleştirin ve tek tek kuyuların luciferase aktivitesini ölçün.</li>
	<li>Her bir LHVS konsantrasyonunun kuyularından üç teknik kopyanın ortalama luciferase aktivitesi.</li>
	<li>Normalleştirilmiş luciferase aktivitesini yüzde olarak hesaplamak için her LHVS konsantrasyonu için ortalama luciferase aktivitesini işlenmemiş parazitlerden elde edilen ortalama luciferase aktivitesine bölün.</li>
	<li>Grafik yazılımı kullanarak tek tek LHVS konsantrasyonlarına karşı normalleştirilmiş luciferase etkinliklerini çizin (Şekil 2). Parazit büyümesine karşı pirimethamin inhibisyonu da bir kontrol olarak ölçülür. Pyrimethamine Toxoplasmafolik asit metabolizmasını inhibe ederek akut toksoplazmoz tedavisinde kullanılan bir klinik antibiyotiktir.</li>
	<li>"Doz-yanıt-inhibisyon" regresyon programı altında, grafik yazılımında gömülü yöntemi, normalleştirilmiş yanıt vs .[inhibitör], tek tek bileşikler için IC50 değerlerini hesaplayın. IC50 aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: Y = 100/(1 + X/IC50) Nerede: Y inhibitörü farklı konsantrasyonlarda enfekte hücrelerin normalleştirilmiş luciferase faaliyetlerini temsil eder, ve X inhibitör bireysel konsantrasyonları temsil eder.</li>
</ol>3. Toxoplazma parazitlerinde CRISPR-Cas9 bazlı gen delemesi
<ol><li>İlgi çekici bir geni silen bir plazmid yapının oluşturulması<ol>
<li><a href="http://www.ToxoDB.org/" target="_blank">www.ToxoDB.org</a> gidin ve 1.5 kb 5'-UTR ve 3'-UTR (çevrilmemiş bölgeler) ile birlikte intronlar ve ekonlar da dahil olmak üzere tüm gen kodlama dizisini alın. NOT: Burada, TgCPL (TGGT1_321530) temsili bir örnek olarak hedeflenmiştir.</li>
		<li>Alınan TgCPL sırasını sıra analizi yazılımına kopyalayın (ad ve sürüm için Malzeme Tablosu'na bakın) ve 5'- ve 3'-UTR bölgelerini etiketleyin.</li>
		<li>Üst menü çubuğundaki Araçlar simgesini seçin ve ardından Klonlama | CRISPR Siteleri bul.</li>
		<li>PAM site konumu için 3'(Cas9)' seçeneğini belirleyin ve özgüllük puanlama bölümünde Toxoplasma genom dizisini içeren klasörü seçin. Ayarların geri kalanını varsayılan olarak bırakın.</li>
		<li><li> <img src="/files/ftp_upload/60985/60985eq1.jpg"> </li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><ol><li><li><li> <img src="/files/ftp_upload/60985/60985eq2.jpg"></li></ol></li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li><li><li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li></li><li><li><li><li><li></li><li><li><ol><li><li><li></li><li></li></ol></li><li><li><li></li></ol></li></ol>

<ol><li>Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lytic+Cycle+of+Toxoplasma+gondii%3A+15+Years+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).</li>
<li>Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Seroprevalence+in+the+United+States+2009-2010+and+Comparison+with+the+Past+Two+Decades%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).</li>
<li>Kieffer, F., Wallon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+toxoplasmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Congenital toxoplasmosis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).</li>
<li>Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annual+cost+of+illness+and+quality-adjusted+life+year+losses+in+the+United+States+due+to+14+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens.</a> Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).</li>
<li>Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmosis.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).</li>
<li>Lindsay, D., Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+the+changing+paradigm+of+congenital+toxoplasmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis.</a> Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).</li>
<li>Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+on+anti-Toxoplasma+drugs+discovery%3A+Design%2C+synthesis+and+screening%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711(2019).</li>
<li>Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+toxoplasmosis+II%3A+clinical+features%2C+pathology+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).</li>
<li>Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Labeling+of+Intracellular+Toxoplasma+gondii+with+Uracil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).</li>
<li>Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+for+evaluation+of+Toxoplasma+gondii+growth+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).</li>
<li>Derouin, F., Chastang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+to+assess+effect+of+antimicrobial+agents+on+Toxoplasma+gondii+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).</li>
<li>McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li>
<li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Growth+Assay+for+Toxoplasma+gondii+Using+Yellow+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).</li>
<li>Touquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+imaging+assay+to+evaluate+Toxoplasma+gondii+infection+and+proliferation%3A+A+multiparametric+assay+to+screen+new+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds.</a> PLoS ONE. 13 (8), e0201678(2018).</li>
<li>Thornton, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ortholog+of+Plasmodium+falciparum+chloroquine+resistance+transporter+%28PfCRT%29+plays+a+key+role+in+maintaining+the+integrity+of+the+endolysosomal+system+in+Toxoplasma+gondii+to+facilitate+host+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775(2019).</li>
<li>Larson, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+cathepsin+L+is+the+primary+target+of+the+invasion-inhibitory+compound+morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl+sulfone+phenyl%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).</li>
<li>Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Ingests+and+Digests+Host+Cytosolic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins.</a> mBio. 5 (4), e01188-14(2014).</li>
<li>Cristina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+depends+on+lysosomal+consumption+of+autophagosomes+for+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17096(2017).</li>
<li>Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L+occupies+a+vacuolar+compartment+and+is+a+protein+maturase+within+the+endo%2Fexocytic+system+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).</li>
<li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+of+endogenous+genes+in+a+Toxoplasma+gondii+strain+lacking+Ku80%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80.</a> Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).</li>
<li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).</li>
<li>Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Genome+Engineering+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 9 (6), e100450(2014).</li>
<li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR%2FCAS9%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), e01114-14(2014).</li>
<li>Radke, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cell+cycle+for+the+tachyzoite+stage+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).</li>
<li>Ran, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nature Methods. 11 (2), 2812(2014).</li>
<li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuPaGDT%3A+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomics%22%5BJournal%5D)">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomics. 1 (4), e000033(2015).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

++Bu protokol, hücre içi Toksoplazma büyümesini değerlendirmek ve parazit büyümesine karşı kimyasal bileşiklerin inhibisyonu etkinliğini değerlendirmek için luciferase tabanlı bir protokolü tanımlar. Hücre içi Toksoplazma büyümesini ölçmek için mevcut stratejilerle karşılaştırıldığında, bu yöntem yüksek duyarlılık ve özgüllük sergiler. Parazit büyümesini izlerken, test edilen suşun değerlendirme süresinin bitiminden önce konak hücrelerini erken denemediğini doğrulamak için 96 kuyumikroplakasında sahte b...

Toksoplazma gondii insan nüfusunun yaklaşık üçte birini enfekte eden son derece başarılı bir hücre içi parazittir. Yüksek iletim hızı ağırlıklı olarak az pişmiş et tüketimi, memeli rezervuarlarına maruz kalma ve doğum sırasında konjenital iletim de dahil olmak üzere çeşitli iletim yolları kaynaklanmaktadır. T. gondii esas olarak immünazasyonlu bireylerde şiddetli morbidite ve mortaliteye yol açabilir fırsatçı enfeksiyonlara neden olur1,2,3,4,5,6. Şu anda akut toksoplazmoz tedavisinde kullanılan antibiyotikler konjenital ve gizli enfeksiyonların tedavisinde özellikle verimsiz ve bazı kişilerde şiddetli reaksiyonlara neden3,7,8. Böylece, acil bir ihtiyaç yeni terapötik belirlemek için var. Toxoplasma ve ev sahibi içindeki hücre altı süreçlerdeki farklılıkların anlaşılması potansiyel uyuşturucu hedeflerinin belirlenmesine yardımcı olacaktır. Bu nedenle, toxoplasmaiçinde bireysel genlerin rollerini incelemek için etkili ve uygun genom manipülasyon teknikleri gereklidir. Ayrıca, Toxoplasma phylum Apicomplexa aittir, Plasmodium spp. ve Cryptosporidium spp gibi diğer birçok önemli insan patojenleri içerir. Bu nedenle, Toxoplasma diğer apicomplexan parazitler temel biyoloji çalışmaya yardımcı olmak için bir model organizma olarak kullanılabilir.
Mikrobiyal patojenlere karşı yeni antibiyotikleri belirlemek için, mikrobiyal büyümenin bastırılmasında etkinliğini belirlemek için başlangıçta kimyasal bileşikler kütüphanesinin yüksek verim taraması yapılır. Şimdiye kadar, T hücre içi büyümesini ölçmek için çeşitli mikroplaka tabanlı büyüme tahlilleri geliştirilmiştir. gondii (yani, radyoaktif 3H-urasil kuruluş tabanlınicel9, t. gondii-spesifik antikorlar 10 kullanarak kantitatif ELISA tabanlı parazit tespiti10,11, β-galaktosidaz veya YFP ifade toksoplazma suşları12,13, ve son zamanlarda geliştirilen yüksek içerikli görüntüleme assay14).
Bu bireysel stratejilerin hepsinin benzersiz avantajları vardır; ancak, bazı sınırlamalar da uygulamalarını kısıtlar. Örneğin, Toxoplasma sadece çekirdekli hayvan hücrelerinde çoğalabildiği için, otofloresans veanti-T. gondii antikorlarının hücreleri barındırmak için spesifik olmayan bağlanması floresan bazlı ölçümlerde parazite neden olur. Ayrıca, radyoaktif izotopların kullanımı özel güvenlik uyumluluğu ve potansiyel güvenlik sorunları gerektirir. Bu tahlillerden bazıları, büyümeyi sürekli izlemek yerine büyümeyi tek bir zaman diliminde değerlendirmek için daha uygundur.
Burada sunulan hücre içi Toksoplazma büyüme nin nicelleştirilmesi için luciferase tabanlı bir protokoldür. Bir önceki çalışmada, NanoLuc luciferase geni Toxoplasma tubulin organizatörü altında klonlanmış ve bu luciferase ekspresyonu yapısı yabani tip (RHΔku80Δhxg suşu) parazitler içine bir RHΔku80Δhxgoluşturmak için transfeced oldu ::NLuc suşu (RHΔku80olarak anılacaktır ::NLuc afterafter)15. Bu suş bu çalışmada hücre içi büyüme tayini ve gen deletion için ebeveyn zorlanma olarak görev yaptı. RHΔku80kullanılarak ::NLuc suşu, insan sünnet derisi fibroblastlarında parazit büyümesi (HFF) parazit katlama süresini hesaplamak için 96 saatlik bir enfeksiyon sonrası dönemde izlendi.
Buna ek olarak, Parazit büyümesine karşı LHVS inhibisyonu etkinliği, IC50 değerini belirlemek için seri LHVS konsantrasyonlarına karşı Toxoplasma büyüme oranları çizilerek belirlenebilir. Önceki literatürtgCPL parazitlerde LHVS önemli bir hedef olduğunu ve LHVS ile tedavi akut ve kronik Toksoplazma enfeksiyonları16,17,,18,19gelişimini azalttığını bildirmiştir. Ayrıca, RHΔku80::NLuc bir TgCPL-eksik suşu oluşturmak için genom modifikasyonu için ebeveyn zorlanma olarak kullanılmıştır (RHΔku80Δcpl::NLuc), ve LHVS inhibisyonu bu mutant karşı ölçüldü. TgCPL-eksikparazitlerde LHVS için IC50 değerlerinin WT suşuna göre yükseltilerek, TgCPL'nin lhvs tarafından in vivo olarak hedeflendirildi.
Bu protokolde, RHΔku80::NLuc etkili bir homolog olmayan son birleştirme yolu (NHEJ) yoksun ebeveyn suşu olarak kullanılır, böylece çift crossover homoloji bağımlı rekombinasyon kolaylaştırmak (HDR)20,21. Ayrıca, 50 bp homolog bölgeler PCR tarafından bir ilaç direnci kaset her iki ucunda çevrilidir. PCR ürünü CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenleme araçları kullanarak HDR üzerinden tüm gen locus kaldırmak için bir onarım şablonu olarak hizmet vermektedir. Bu tür kısa homolog bölgeler kolayca astariçine dahil edilebilir, onarım şablonu üretimi için uygun bir strateji sağlayan. Bu protokol, evrensel gen silme ve endojen gen etiketleme gerçekleştirmek için değiştirilebilir.
Örneğin, en son yayınımızda, üç proteaz gen, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B benzeri proteaz) ve TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin benzeri proteaz 1), genetik olarak TgCRT (Toxoplasma kloroquine-direnç taşıyıcı) -bu yöntemi kullanarak eksik parazitler15. Ayrıca, TgAMN (bir putatif aminopeptidaz N [TgAMN, TGGT1_221310]) endojenetiketli 15. Lourido laboratuarı da benzer bir yöntem kullanarak Toxoplasma genomunda site yönelimli gen mutasyonu ve endojen gen etiketleme giriş için 40-43 bp aralığında kısa homolog bölgeler kullanılarak rapor22. Bu başarılı genom modifikasyonları, Toxoplasma gondii'dekigenom manipülasyonunu büyük ölçüde kolaylaştıran TgKU80-eksiksuşunda 40-50 bp homolog bölgenin verimli DNA rekombinasyonları için yeterli olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Agaroz jel ekstraksiyon kiti</td><td>New England BioLabs</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0316S</td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H1 Hibrit Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu</td><td>BioTek Cihazları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX Gemini İkiz Dalga Formu Elektroporasyon Sistemi</td><td>Harvard Aparatı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal olarak yetkin E. coli hücreleri</td><td>New England BioLabs</td><td>C29871</td><td></td></tr><tr><td>CloneAmp HiFi PCR ön karışımı</td><td>Takara Bio</td><td>639298</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine h</td><td>Prolume</td><td>301-10 hCTZ</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>Phire Doku Doğrudan PCR Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>F170L</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid mini hazırlık kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D4054</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Siteye Yönelik Mutajenez kiti</td><td>New England BioLabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sgRNA tasarımı için geneious yazılımı (sürüm: R11)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism yazılımı (8th sürümü)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moleküler klonlama için SnapGene (sürüm: 4.2.11)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

luciferase tabanlı büyüme testini kullanarak hücre İçi toksoplazma gondii büyümesine karşı kimyasal inhibitör verimliliğin belirlenmesi

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toksoplazma gondii yaygın insan popülasyonu etkileyen bir protozoon patojendir. Klinik toksoplazmoz tedavisinde kullanılan mevcut antibiyotikler sınırlıdır. Buna ek olarak, insanların bazı gruplarda yan etkiler sergilerler. Bu nedenle, klinik toksoplazmoz için yeni terapötik lerin keşfi zorunludur. Yeni antibiyotik gelişiminin ilk adımı, yüksek verim tarama stratejisi kullanarak parazit büyümesinin inhibisyonunda yüksek etkinlik gösteren kimyasal bileşikleri belirlemektir. Zorunlu bir hücre içi patojen olarak, Toxoplasma sadece konak hücreleri içinde çoğalabilir, bu da büyümenin hızlı bir göstergesi olarak optik emici ölçümlerin kullanımını yasaklar. Burada luciferase tabanlı büyüme test için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Örnek olarak, bu yöntem yabani tip Toxoplazma parazitlerinin iki katına saatini hesaplamak ve parazit intrasellüler büyümein inhibisyonu ile ilgili morolinurea-lucyl-homophenyl-vinil sülfone fenilin (LHVS, bir sistein proteaz hedefleme siper-hedefleme bileşiği) etkinliğini ölçmek için kullanılır. Ayrıca, homolojiye bağımlı rekombinasyon (HDR) için 50 bp homolog bölgeler kullanılarak Toxoplasma'da CRISPR-Cas9 tabanlı gen deletion protokolü de tanımlanmıştır. Yabani tip ve TgCPL (Toxoplasma cathepsin L benzeri proteaz) -eksik parazitlerde LHVS inhibisyon etkinliğini ölçerek, LHVS'nin Δcpl büyümesine göre yabani tip parazit büyümesini daha verimli bir şekilde engellediğini ve TGCPL'nin Toxoplasma'daLHVS'nin bağlanan bir hedef olduğunu düşündürmektedir. Bu luciferase bazlı büyüme testinin yüksek hassasiyeti ve kolay çalışması, Toxoplasma proliferasyonunun izlenmesi ve ilaç etkinliğinin yüksek verim li bir şekilde değerlendirilmesi için uygundur.

Şekil 1, RHΔku80için bir büyüme eğrisi örneğini temsil eder::NLuc gerinim ve iki katına çıkarma süresi için türetilmiş hesaplama. Genel olarak, titreşme luciferase aktivite okumalarının varyasyonları için hesap üç biyolojik çoğaltmaher biri için üç teknik çoğaltmalar gerçekleştirilir. Parazit büyümesinin normalleştirilmiş kıvrım değişimini hesaplamak için, enfeksiyon sonrası 24-96 h'deki her okuma, ilk okuma ile 4 saat sonrası enfeksiyon aya...

Burada sunulan bir luciferase tabanlı büyüme tsay kullanarak Toxoplasma gondii in vitro hücre içi büyümeye karşı kimyasal bileşiklerin inhibisyon etkinliğini değerlendirmek için bir protokoldür. Bu teknik, ilgili hedef genin genetik olarak silinmesi ile inhibisyon özgüllüğünü doğrulamak için kullanılır. LHVS'nin TgCPL proteaza karşı inhibisyonu örnek olarak değerlendirilmektedir.

Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

Bu hassas stratejiler, kimyasal inhibitörlerin inhibisyon etkinliğini değerlendirmek ve ilaç hedeflerini araştırmak için CRISPR-Cas9 gen delemesi ile birlikte kullanılabilir. Bunun yerine bir uç nokta tetkik kullanarak, parazit büyüme hassas bir muhabir protein kullanarak parazit iki katına zaman hesaplama sağlamak için zaman içinde izlenebilir. Bu test potansiyel olarak 384 veya 1, 536 iyi mikroplakalar birden fazla bileşiklerin test etmek veya yüksek iş kadar bir şekilde kütüphanelerin taranması için ölçeklenebilir.Bu strateji, diğer hücre içi mikrobiyal patojenlerin büyümesini ve bunların ilgi çekici ilaca verdikleri yanıtları ölçmek için değiştirilebilir. Luciferase tabanlı Toxoplasma büyüme testini gerçekleştirmek için, insan sünnet derisi fibroblastlarının önceden tohumlanmış 96 kuyulu mikroplaka kültürlerinden ortayı dikkatlice uyararak başlayın ve 150 mikrolitre parazit B süspansiyonunu üç sütun-beş sıra biçiminde kuyulara aşılayın. Hücre kültürü kuluçka dört saatlik kuluçka sonra, dikkatle işgal edilmeyen parazitleri kaldırmak ve oda sıcaklığında fenol kırmızı serbest orta ile her ama ilk satır da kuyuları doldurmak için her kuyudan orta aspire.Daha sonra PBS'deki 12,5 mikromolar luciferase substrat çözeltisinin 100 mikrolitresini üst sıranın her kuyusuna ekleyin ve tam hücre lisisine izin vermek için mikroplakaları oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, bir mikroplaka okuyucu üzerinde luciferase aktivitesini ölçün. Her okuma, enfeksiyon dan sonra dört saat içinde işgal edilen parazitlerin ilk sayısını temsil eder.Orta sını değiştirmeden önümüzdeki dört gün boyunca her 24 saatte bir analizi tekrarlayın. Parazit büyümesinin normalleştirilmiş kat değişimini hesaplamak için, her okuma enfeksiyon sonrası dört saatlik ilk okumaile bölünebilir. Parazit büyümesinin normalleştirilmiş kıvrım değişiminin günlük 2'si her zaman noktasına karşı çizilebilir ve katlama süresini temsil eden eğimi elde etmek için doğrusal bir regresyon işlevine tabi tutulabilir.Toxoplasma büyüme ilgi bir bileşik inhibisyonunetkinliğini değerlendirmek için, kültür insan sünnet derisi fibroblastlar en az yedi gün boyunca 96-iyi mikroplakalar için parazitlerin her iyi aşılama önce 150 mikrolitre parazitler ile dört saat boyunca gösterdi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit. Kuluçka sırasında, seri seyreltme ile 12 kuyulu bir rezervuar sekiz farklı konsantrasyonlarda faiz bileşik hazırlamak. Bileşikleri 12 kuyuluk bir rezervuardaki bire üç seyreltmede, her karışımı bir mililitrelik pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı boruhaline vererek seyreltin.Enfeksiyon sonrası dört saat olarak, her kuyuda iki ila dokuz sütunlar arasında orta yerine 150 mikrolitre orta bileşik her seyreltme ile takviye, tedavi edilmeyen kontrol olarak hizmet etmek için düzenli orta ile dolu ilk sütun bırakarak. Daha sonra hücre kültürlerini hücre kültürünü 96 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve bileşiklerin her konsantrasyonundaki kültürlerdeki büyüme inhibisyonunun yüzdesini belirlemek için her kuyu için luciferase aktivitesini ölçün. Normalleştirilmiş luciferase aktivitesini bir yüzde olarak hesaplamak için, her bileşik konsantrasyoniçin ortalama luciferase aktivitesini, tedavi edilmeyen parazitlerden elde edilen ortalama luciferase aktivitesine bölün.Daha sonra normalleştirilmiş luciferase aktivitelerini tek tek bileşiğin karşısına çıkarmak ve her bileşik için yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu hesaplamak için uygun bir grafik yazılım programı kullanın. İlgi çeken bir geni silebilmek için tek kılavuzlu RNA ve Cas9'u ifade eden plazmid bir yapı oluşturmak için Toxoplasma Genomics Resource sayfasına gidin ve 1,5 kilobase beş ve üç ana çevrilmemiş bölgeyle birlikte intronlar ve ekonlar da dahil olmak üzere tüm gen kodlama dizisini alın. Alınan TgCPL sırasını sıra analizi yazılımına kopyalayın ve çevrilmemiş beş ve üç asal bölgeyi etiketleyin.Toxoplasma Genomics Kaynak sayfasında İndir, Veri Dosyaları ve Current_Release'yi tıklatın. T.gondii GT1 klasöründe FASTA'yı seçin. Veri klasöründen Toxoplasma gondii GT1 strain genom dizi dosyasını indirin.Daha sonra DNA dizi analizi yazılımında Toxoplasma Genom adlı yerel bir klasör oluşturun ve Toxoplasma genom dizi dosyasını klasöre aktarın. CrispR Sitelerini Bul araçları, Klonlama ve Bul'u seçin ve PAM site konumu için üç ana Cas9 prime ayarlayın. Yüksek özgüllük puanı gösteren, genellikle %98'den büyük ve NGG'den sonra G'den yoksun tek bir kılavuzLu RNA seçin.Seçilen tek kılavuzlu RNA genellikle ilgi geninin başlangıç ve durdurma kodonları yakın yerlerde yer alır. Ardından, TgUPRT genini hedefleyen önceden varolan plazmid ifade eden tek kılavuzlu RNA'yı değiştirmek için bir PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için tabloda belirtilen ayarları içeren bir PCR premixkullanın. Toxoplasma transfeksiyonu için, iki mikrogram onarılmış şablon DNA'yı tek kılavuzlu RNA Cas9 ekspresyonu plazmidlerinin 20 mikrogramı ile karıştırın ve 1,5 mililitrelik bir santigrat tüpünde 200 milimolar ATP 500 milimolar azaltılmış glutatyon olmak üzere 400 mikrolitre parazit resuspension, DNA ve beş mikrolitreyi karıştırın.Gerektiğinde toplam hacmi 500 mikrolitreye çıkarmak için sitomix tampon ekleyin ve parazit DNA karışımını elektroporasyon cuvette ile dört milimetrelik bir boşluğa aktarın. Sonra parazitleri iki kilovolt ve 50 ohm dirençle elektroporate. Nakavt parazitleri klonlamak için, ilk uygun antibiyotik konsantrasyonu ile desteklenen D10 orta mililitre başına 10 parazit elde etmek için parazitlerin iki adımlık seyreltme gerçekleştirin.Daha sonra, 150 mikrolitre resuspended saflaştırılmış parazitleri, sünnet derisi fibroblastları ile önceden tohumlanmış 96 kuyulu bir mikroplakanın her kuyusuna aktarın ve mikroplakayı 7 gün boyunca 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle inkümal edin. Kuluçka sonunda, tek bir plak içeren kuyuları belirleyin ve 96 kuyulu mikroplaka kültürünün her kuyusundan yeniden askıya alınan Toksoplazma enfekte insan sünnet derisi fibroblastlarının 75 mikrolitresini tek tek 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Hücreleri santrifüj ile toplayın ve DNA salınım katkı sında seyreltme tamponu içeren 10.25 mikrolitre lysis tamponundaki peletleri yeniden askıya alın.Daha sonra ilaç direnci kasetinin entegrasyonunu test etmek ve ilgi geninin kaybını test etmek için PCR'yi yapmadan önce numuneleri oda sıcaklığında dört dakika ve 98 santigrat derecede iki dakika kuluçkaya yatırın. Delta CPL suşlarındaki LHVS ve yabani tipin inhibisyonu, farklı inhibitör konsantrasyonlarına karşı luciferase aktivitelerinin çizilmesi yle belirlenebilir. PCR sonra, mutasyona uğramış plazmid doğrusalize edilir ve başarılı bir amplifikasyon doğrulaması için% 1 agarose jel içine yüklenir.Jel ekstraksiyonu ve E.coli dönüşümünden sonra, beklenen plazmidleri içeren klonlar DNA diziliminde restriksiyon endokleaz sindirimi ile tarayabılabilir. Onarım şablonu amplifikasyonundan sonra, AGAROSE jel elektroforez pcr ürünün doğru boyutunu doğrulamak için kullanılabilir. Genellikle, yedi ila sekiz klonlar ilgi geninin kodlama dizisinin silinmesini kontrol etmek için ilk tarama için seçilir, ardından beş ve üç asal kol tespiti ile taranacak toplam klon sayısını en aza inmeye yardımcı olmak için.Hedef proteini tanıyan herhangi bir antikor varsa immünoblotlama ile daha fazla doğrulama yapılabilir. Luciferase aktivite ölçümleri almadan önce, parazitlerin konak hücreleri tam olarak kontrol etmemeleri için sahte enfeksiyonlu net bir mikroplaka mikroskop altında kontrol edilmelidir.

determination-chemical-inhibitor-efficiency-against-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir...

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Bu videoda, hücre içi patojen Toxoplasma gondii'nin büyümesini ölçmek için lusiferaz testini gösteriyoruz. Konakçı hücreleri enfekte ettikten sonra lusiferaz enzimini eksprese eden bir Toksoplazma suşu kullanılarak, parazitin başarılı bir şekilde üremesini belirlemek için enfekte hücre kültüründe lusiferaz aktivitesi tespit edilir.

Hücre İçi Parazit Üremesini Ölçmek için Luciferaz Bazlı Büyüme Testi

Video, hücre içi patojen Toxoplasma gondii'ye  karşı bir antiparaziter kimyasal inhibitörün etkinliğini belirlemek için kullanılan lusiferaz testini göstermektedir.Çalışma, çoğalmak ve hayatta kalmak için konakçı hücreleri istila eden lusiferaz eksprese eden parazitleri içerir. Kimyasal inhibitör, parazitin sistein proteazlarına bağlanır ve replikasyonu inhibe eder. Tespit edilen lusiferaz aktivitesi, ilacın parazite karşı etkinliğini belirleyen, parazit büyümesindeki kıvrım değişiklikleri ile...

Antiparaziter Kimyasalların Parazitlere Karşı Etkinliğini İncelemek İçin Lusiferaz Testi

Bu videoda, β-galaktosidaz enzimini eksprese eden bir parazit olan Trypanosoma cruzi'ye karşı tripanosidal bir ilacın sitotoksik potansiyelini belirlemek için basit ve sağlam bir yöntemi açıklıyoruz. β-galaktosidaz bir hücre lizis göstergesi olarak hizmet eder ve aktivitesi ilacın etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Parazitlerde İlaca Bağlı Sitotoksisiteyi Değerlendirmek için β-Galaktosidaz Testi

Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi'nin üç yaşam döngüsü aşamasında β-galaktosidaz aktivitesini ölçen yüksek verimli bir kolorimetrik tahlil tanımladık. Bu tahlil, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

Plasmodium cinsel gelişimi sivrisinek orta bağırsağında meydana gelir. Parazitin cinsel aşamalarını hedeflemek, bulaşmayı engellemek için umut verici bir stratejidir. Zigot oluşumundan sonra nanolusiferaz eksprese eden transgenik bir P. berghei olan Ookluc'u geliştirdik ve iletim bloke edici bileşiklerin yüksek verimli taramasını sağladık. Bu makale, Ookluc kullanarak tarama yöntemlerini detaylandırmaktadır.

Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı

Keşfedin, luciferaz tabanlı büyüme testiyle Toxoplasma gondii'ye karşı kimyasal inhibitörlerin etkinliğini nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, yüksek verimli tarama için ölçeklenebilir ve parazit çoğalma süresini hesaplar.

Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal

Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet