Name: Mikroakışkan Odacıksistemi Kullanılarak Motor Nöron Kültürlerinde Organellerin Aksonal Taşınması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Keşfedin mikroakışkan odacık sistemini kullanarak motor nöronlarda aksonal taşımayı izleme yöntemini. Bu protokol, nörodejeneratif hastalıklarda taşıma bozukluklarını araştırmak için gerçek zamanlı görüntüleme olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (ISF, 561/11) ve Avrupa Araştırma Konseyi 'nin (ERC, 309377) bağışları ile desteklenmiştir.

<ol><li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitostasis+in+Neurons%3A+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li>
<li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
<li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373(2019).</li>
<li>Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li>
<li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+acidic+intracellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li>
<li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li>
<li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport%2C+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li>
<li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li>
<li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311(2018).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li>
<li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li>
<li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death & Disease. 10 (3), 210(2019).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Bu protokolde motor nöronlarda mitokondri ve asidik kompartmanların aksonal naklini takip edecek bir sistem tanımlıyoruz. Bu basitleştirilmiş in vitro platform hassas kontrol sağlar, izleme, ve subsellüler nöronal bölmelerin manipülasyon, motor nöron yerel fonksiyonların deneysel analizi sağlayan. Bu protokol, als gibi MN hastalıklarının incelenmesinde yararlı olabilir, hastalıkta aksonal taşıma disfonksiyonunun altında yatan mekanizmayı anlamaya odaklanmak için10,16</...

MN'ler uzun aksonlarla yüksek oranda polarize hücrelerdir ve yetişkin insanlarda bir metreye kadar uzundur. Bu fenomen, MN bağlantısının ve işlevinin sürdürülmesi için kritik bir sorun yaratır. Sonuç olarak, MN'ler aksonlar boyunca bilgi, organel ve malzemelerin hücre gövdesinden sinapsa ve sırta doğru şekilde taşınmasına bağlıdır. Proteinler, RNA ve organeller gibi çeşitli hücresel bileşenler aksonlar aracılığıyla düzenli olarak mekiklenir. Mitokondri rutin MNs taşınır önemli organeller vardır. Mitokondri UYGUN aktivite ve MNs fonksiyonu için gerekli olan, ATP sağlanması sorumlu, kalsiyum tamponlama, ve sinyalizasyon süreçleri1,2. Mitokondri aksonal taşıma iyi çalışılmış bir süreçtir3,4. İlginçtir, mitokondriyal taşıma kusurları çeşitli nörodejeneratif hastalıklarve özellikle MN hastalıklarında dahil olduğubildirilmiştir 5. Asidik bölmeler MN akson boyunca hareket içsel organeller için başka bir örnek olarak hizmet vermektedir. Asidik bölmeler arasında izozomlar, endozomlar, trans-Golgi cihazları ve bazı salgı vezikülleri6bulunmaktadır. Asidik kompartmanların aksonal taşıma kusurları çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda da bulundu7, ve son kağıtları MN hastalıklarında önemini vurgulamak8.
Aksonal taşımayı verimli bir şekilde incelemek için somatik ve aksonal bölmeleri birbirinden ayıran mikroakışkan bölmeler 9,10sıklıklakullanılmaktadır. Mikroakışkan sistemin iki önemli avantajı ve aksonları bölme ve izolasyon, hücre altı süreçlerin çalışması için ideal hale11. Nöronal hücre organları ve aksonları arasındaki mekansal ayrım, farklı nöronal bölmelerin hücre dışı ortamlarını (örn. aksonların soma'ya karşı) manipüle etmek için kullanılabilir. Biyokimyasal, nöronal büyüme/ dejenerasyon ve immünofloresan tsays tüm bu platformdan yarar. MFCs da diğer hücre tipleri ile nöronların koculturing hücre-hücre iletişimi çalışmalarında yardımcı olabilir, iskelet kasları gibi12,13,14.
Burada, motor nöronlarda mitokondri ve asidik kompartman naklinin izlenmesi için basit ama kesin bir protokol uyguluyoruz. Ayrıca retrograd ve anterograd hareketli organellerin göreceli yüzdesini ve taşıma hızının dağılımını karşılaştırarak bu yöntemin kullanımını da gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>35mm Fluodish &ndash; cam alt çanak</td><td>Dünya Hassas Aletler WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>50mm Fluodish &ndash; cam alt çanak</td><td>Dünya Hassas Aletler WPI</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon DU-897 EMCCD kamera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARA-C (Sitozin ve beta;-D-arabinofuranosid)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>filtrelenmiş 2mM stoğu DDW</td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td>10 & mikroya seyreltin; % 0.01 BSA ile filtrelenmiş ddw'de g / mL)</td></tr> <tr><td>Biyopsi punch 1.25mm</td><td>Dünya Hassas Aletler WPI</td><td>504530</td><td>Büyük MFC</td></tr><tr><td>Biyopsi punch hazırlanması için 6mm</td><td>Dünya Hassas Aletler WPI</td><td>504533</td><td>Küçük MFC</td></tr><tr><td>Biyopsi punch hazırlanması için 7mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504534</td><td>Büyük MFC</td></tr><tr><td>Bitplane Imaris yazılımının hazırlanması için - sürüm 8.4.1</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>#A3311-100G</td><td>ddw</td></tr><tr><td>Klorotrimetilsilan</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 386529-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Alomone Labs</td><td>C-240</td><td>10 & mikroya seyreltin; % 0.01 BSA ile filtrelenmiş ddw'de g / mL</td></tr> <tr><td>Yoğunluk Gradyan Ortamı - Optiprep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz I (DNAse)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td>stoku 10mg / mL nörobazal</td></tr><tr><td>Dow Corning Yüksek vakumlu silikon gres</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td>Epoksi kalıp hazırlama için</td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Thermo Fisher</td> <td># 14200-067</td><td>DDW'de 1:10 oranında seyreltin</td></tr><tr><td>Dumont ince forseps # 55 0.05 & kez; 0.02 mm</td><td>FST 1125520</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epoksi Sertleştirici</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>IPE 743</td><td>Epoksi kalıp hazırlama için</td></tr><tr><td>Epoksi Reçine</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>RP 026UV</td><td>Epoksi kalıp hazırlama</td></tr><tr><td>için FIJI yazılımı</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>G-240</td><td>10 & mikroya seyreltin; %0.01 BSA ile filtrelenmiş ddw'de g/mL)</td></tr><tr><td>Glutamax 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HB9:GFP fare suşu</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14185-045</td> %<td>1 P/S ilavesiyle ddw'de 1:10 seyreltin ve iQ yazılımını filtreleyin</td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İris makas, kavisli, 10 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-441-10</td><td></td></tr><tr><td>İris makası, düz, 9 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-440-09</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 Orta Boy</td><td>Thermo Fisher</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Kırmızı</td><td>Thermo Fisher</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Koyu Kırmızı FM</td><td>Thermo Fisher</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (P / S) Çözeltisi</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>03-031-1</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitin (PLO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8638</td><td>1:1000 oranında seyreltin 1X PBS</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikon elastomer kiti</td><td>DOW Corning Corporation</td><td># 3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td>stoğu 25 mg / mL 1XPBS</td></tr><tr><td>Vannas yaylı mikrodiseksiyon makası, 3 mm bıçak</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU X-1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroakışkan odacıksistemi kullanılarak motor nöron kültürlerinde organellerin aksonal taşınması

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor nöronlar (MNs) çok uzun aksonlar ile yüksek polarize hücrelerdir. Aksonal ulaşım MN sağlığı için önemli bir mekanizmadır, nöronal büyüme katkıda, gelişme, ve sağkalım. MN aksonları floresan etiketli organellerin aksonal naklini izlemek için mikroakışkan odaların (MFCs) kullanımı için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem hızlı, nispeten ucuz, ve uzay ve zaman hücre içi ipuçları izlenmesi için izin verir. Biz için adım protokolü bir adım açıklar: 1) Polidimethylsiloxane imalatı (PDMS) MFCs; 2) MCD'lerde ventral omurilik eksplandisi ve MN ayrıştırılmış kültürün kaplaması; 3) Mitokondri ve asidik bölmelerin etiketlenmesi ve ardından canlı konfokal hayal; 4) Manuel ve yarı otomatik aksonal taşıma analizi. Son olarak, sistem geçerliliğinin bir kanıtı olarak MITOKONDRİ ve HB9 asidik bölmelerinin taşınmasında bir fark gösteriyoruz::GFP ventral omurilik ekstrkül aksonları. Bu protokol, çeşitli aksonal bileşenlerin aksonal taşımasını incelemek için etkili bir araç ve mekansal deneysel olasılıkları keşfetmeye yardımcı olmak için MFC kullanımı için basitleştirilmiş bir kılavuz sağlar.

Açıklanan protokolütaki şekliyle fare embriyonik HB9::GFP omurilik ekslekları MFC'de kültürlenmiştir (Şekil 4A). Eksteseler 7 gün boyunca büyüdü, aksonlar tamamen distal bölmeye geçti. Mitotracker Deep Red ve Lysotracker Red boyaları distal ve proksimal bölmelere mitokondri ve asidik bölmeleri etiketlemek için eklenmiştir(Şekil 4C). Distal oluklarda akson lar görüntülendi ve filmler aşağıdaki gib...

Aksonal taşıma motor nöron sağlığı için çok önemli bir mekanizmadır. Bu protokolde mikroakışkan odacıklar kullanılarak motor nöron aksonlarında asidik bölmelerin ve mitokondrinin aksonal naklinin izlenmesi için ayrıntılı bir yöntem sağlıyoruz.

Mikroakışkan Odacıksistemi Kullanılarak Motor Nöron Kültürlerinde Organellerin Aksonal Taşınması

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Aksonal taşıma nöronal sağlık ve canlılık için hayati önem taşımaktadır. Protokolümüz aksonal taşımayı izlemek ve analiz etmek için zarif bir yöntem tanımlar. Ve çeşitli nöronal hastalık modelleri için adapte edilebilir.Mikroakışkan odaların kullanımı aksonal biyoloji eğitimi için çok önemli olan kesin mekansal zamansal kontrol sağlar. Aksonal ulaşım anormallikleri ALS gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarile karışır. Mikroakışkan platform, aksonal taşıma kusurlarını onarmak için temel mekanizmaların incelenmesini ve terapilerin test edilmesini sağlar.Mikroakışkan oda platformu aksonal araştırmanın farklı yönlerine uyacak şekilde kolayca uyarlanabilir, aksonal büyüme ve çeşitli nöral alt tiplerin dejenerasyonu da dahil olmak üzere. Bu yöntem karmaşıktır ve genellikle uygulamalı olarak öğretilir. Görsel gösteri aksonal ulaşım eğitimi ile ilgilenen herhangi bir bilim adamı için bu prosedürün erişilebilirliğini artıracaktır.Birincil kalıplarda PDMS döküm ile başlayın. Gofret platformundaki kirleri gidermek için basınçlı hava yı kullanabilirsiniz, devam etmeden önce gofretlerin pürüzsüz ve net görünmesini sağlar. Daha sonra, sıvı nitrojen ile bir kap doldurun ve 23 gauge iğne ile 10 mililitrelik şırınga hazırlamak.Kimyasal bir duman başlığında, plaka içeren gofreti sızdırmaz bir kapta yerleştirin ve şırıngayı her gofret için iki mililitre sıvı nitrojen içeren plaka ile doldurun. Klorotrimtilsilane şişesi açın. Kauçuk kapağı şırıngayla delin ve nitrojeni şişeye enjekte edin.İğneyi çekmeden, şişeyi ters çevirin ve her gofret içeren plaka için iki mililitre klorotrimethylsilane çekin. Klorotrimethylsilane'i kapta yayın, ancak doğrudan içeren kofret üzerinde değil. Kabı kapatın.Ve gofret başına beş dakika kuluçkaya yat. Sonraki 50 mililitrelik bir tüp PDMS baz 47,05 gram tartmak ve toplam 50 gram kür ajan 16-1 baz oranında PDMS kür ajan ekleyin. DÜŞÜK hızlı bir rotatör üzerinde 10 dakika boyunca PDMS karıştırın, sonra istenilen yüksekliğe plaka içeren her gofret içine dökün.Plakaları iki saat boyunca vakum lu bir kurutucunun içine yerleştirin. Bu da PDMS'de sıkışıp kalan havayı ortadan kaldıracak ve temiz bir üniforma kalıbı oluşturacak. Daha sonra 70 Santigrat üç saat veya gece boyunca bir fırında plakaları kuluçka.Mikroakışkan hazne veya MFC oluşturmak için. PDMS kalıplarını neşterle plakadan kesin ve çıkarın, kırılgan oldukları için kalıpları zorlamamaya özen. Deneysel kuruluma bağlı olarak, odaları yumruklamak ve kesmek için metin el yazmasındaki talimatları izleyin.Omurilik ekstrüzyon kültürü için, büyük bir MFC distal tarafında iki yedi milimetrelik kuyu yumruk, onlar kanal kenarları ile örtüşecek emin olun. Proksimal tarafta, en az çakışma ile kanalın ortasında bir yedi milimetre iyi yumruk, böylece ekspertize için yeterli alan bırakılır. Proksimal kanalın iki kenarına iki ek bir milimetre delik delin.Ve PDMS'yi tek bölmeye böl. Daha sonra MFC'yi yukarı doğru çevirin ve delikli yedi milimetrelik kuyunun üzerine üç küçük ekstrüzyon mağarasına oymak için 20 kalibrelik bir iğne kullanın. Ayrık motor nöron kültürü için, küçük bir MFC iki kanal kenarlarında dört altı milimetrelik kuyuyumruk ve tek odalar halinde PDMS kesti.MFC sterilize etmek için, bankta 50 santimetre uzunluğunda yapışkan bantları yayıldı. Sonra kasetteki odanın iki yüzünü de bastırın ve geri çekin. Temiz odaları yeni bir tabağa yerleştirin ve 10 dakika boyunca orbital shaker üzerinde %70 etanol, analitik kalitede kuluçkaya yatırın.Etanol atın ve bir doku kültür başlık veya 70 santigrat derece bir fırında odaları kuru. Sonra bir doku kültürü sınıf cam alt hendek merkezine oda yerleştirin ve çanak alt PDMS bağlamak için kenarlarında küçük kuvvet uygulayın. 70 santigrat derece 10 dakika boyunca çanak kuluçka.Sonra bağlılığı güçlendirmek için odalara basın. 10 dakika UV altında çanak kuluçka, sonra MFC kodlama devam edin. Her iki bölmeye de mililitre PLO başına 1,5 nanogram ekleyin.FKÖ'nün kanallarda olduğundan emin olmak. Kaplama ortamını doğrudan kanal girişine borulayarak. Kabarcıkları kontrol etmek için MFC'yi ışık mikroskobu altında inceleyin.Hava kabarcıkları mikro olukları engelliyorsa, MFC'yi iki dakika boyunca vakumlu kurutuculara yerleştirin. MFC kanallarından fazla havayı çıkarın. Sonra plo ile bir gecede kuluçka.FKÖ'yü lamininle değiştirin ve ek bir gece için MFC'yi kuluçkaya yatırın. Kaplamadan önce laminini kültür ortamıyla yıkayın. ICR E12.5 gebe fareyi inceleyin ve embriyoları amniyotik keseden ayırın.Embriyoyu HBSS Silikon kabına koyun. Başını ve kuyruğunu çıkar ve karnına çevir. Yavaşça geri embriyolar yüzeysel deri soyma, omurilik açığa.Nazik cımbız kullanarak, kafadan kuymak için vücuttan omurilik ayırın. Menenjler çıkarın, sonra dorsal boynuzları kaldırmak ve bir milimetre kalınlığında enine bölümler halinde omurilik kesti. MFC'nin proksimal bölmesinden tüm ortamları atın.Dört mikrolitre toplam hacmi, bir pipet ile tek bir omurilik ekstrbitki pick up. Ve mağaraya mümkün olduğunca yakın enjekte edin. Lateral çıkışları ile proksimal kuyudan herhangi bir aşırı sıvı çekin.Önceki adımı iki kez daha tekrarlayın ve ekskalanların proksimal kanala yerleştirdiğinden emin olun. Yavaşça proksimal kuyuya, SCEX orta 150 mikrolitre ekleyin. Kaplamadan bir gün sonra.Proksimal bölmedeki SCEX ortamını değiştirin ve distal bölmeye zengin SCEX ortamı ekleyin. Distal ve proksimal kuyular arasında kuyu başına en az 15 mikrolitre hacim degradesi bakımı. Dört ila altı gün sonra, aksondistal bölmeye geçmek ve aksonal taşıma görüntüleme için hazır olmalıdır.Mitokondri ve asidik bölmeleri etiketlemek için, 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM ve 100 nanomolar LysoTracker Kırmızı ile taze SCEX orta hazırlamak. Ve mikroakışkan odalara ekleyin. 37 santigrat derecede 30-60 dakika kuluçkaya yat.Daha sonra sıcak SCEX orta ile üç kez yıkayın. Aksonal taşımanın canlı görüntülemesi ile devam edin. Üç saniye aralıklarla 100 zaman atlamalı görüntü serisi edinme.Film başına toplam beş dakika. Mikroakışkan odalarda yedi gün kaldıktan sonra. Fare embriyonik HB9 GFP omurilik eksgelentisi.Biz MitoTracker Deep Red ve LysoTracker Kırmızı boyalar ile lekeli konum. Mitokondri ve asidik bölmeleri etiketlemek için. Distal oluklarda akson lar görüntülenmiş ve genel hareket dağılımını belirlemek için Kymograph analizi kullanılmıştır.Bu sadece asidik şehir bölmelerinde retrograd yönde bir önyargı ortaya, ama mitokondriyal taşıma değil. Parçacık yoğunluğu da ölçüldü, HB9 GFP omurilik ekstrbitki akson asidik bölmeleri ile karşılaştırıldığında mitokondriyal parçacıkların daha yüksek sayıda ortaya. Daha sonra, tek parçacık taşıma analizi yarı otomatik yazılım ve ardından şirket içi kod kullanılarak yapılmıştır.Bu analiz, asidik komponentler ve mitokondribenzer parçacık hızlarına sahip olduğunu ortaya koymuştur. Ama sadece asidik bölmeler retrograd harekete karşı bir önyargı gösterir. Embriyonik omuriliği izole etmek ilk başlarda zor olabilir.Doğru embriyonik yaş ve uygun diseksiyon araçları kullandığınızdan emin olmak, bu prosedürü birkaç kez uygulayın. Mikroakışkan odaların kullanımı aksonal biyoloji çalışma şeklimizi değiştirir. Bir zamanlar sadece hücre vücudunda meydana geldiği varsayımıyla karşımıza çıkan lokalize aksonal süreçleri görselleştirmemizi sağlıyor.

axonal-transport-organelles-motor-neuron-cultures-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video kültür nöronlar için mikroakışkan bir cihaz farbricate için kullanabileceğiniz Polidimetil siloksan (PDMS) ile yumuşak litografi tekniği göstermektedir.

Nöron Soma ve Aksonlar compartmentalization mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

Burada dorsal kök gangliyon kültür duyusal nöronlar için kompartman odaları hazırlanması ve bakımı tekniği açıklar.

Kompartman Kültürleri Dorsal Kök Ganglia Nöronlar hazırlanması ve Bakım

In vitro MSS akson glia etkileşim araştırmaları için bir roman çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platformu geliştirdi. Platform altı paralel olarak bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahiptir ve yeni geliştirilmiş bir makro / mikro hibrid imalat yöntemi kullanılarak imal edildi.

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Bu video, bir mikroakışkan oda sistemi kullanarak motor nöronlarda aksonal taşımayı izlemek için bir yöntemi göstermektedir. Aksonal büyümeyi indüklemek için fare embriyonik omurilik dokularının polimer kaplı kuyucuklarda besleyici ortamla kültürlenmesini içerir. Floresan boya lekeli organellerin canlı görüntülemedeki hareketi, çift yönlü aksonal taşımayı doğrular.

Mikroakışkan Bir Cihaz Kullanarak Motor Nöronlarda Organellerin Aksonal Taşınımının İzlenmesi

Drosophila S2 hücreleri ve kültürlenmiş nöronların in vivo olarak motor tahrikli bir organel taşıma görüntüleme için büyük sistemlerdir. Burada, her iki hücre kültür tipleri için, görüntüleme ve taşıma analiz protokolleri ayrıntılı tarif etmektedir.

Kültürlü organel Ulaşım Drosophila Hücreler: S2 Hücre Hattı ve İlköğretim Nöronlar.

Tek bir nöron mikroakışkan arraying ve biyomalzeme kaplamaların içinde-çip plazma desenlendirme için su maskeleme için protokoller anlatılmıştır. Yüksek birbirine eş hücre kültürleri en az girişler kullanılarak hazırlanabilir.

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Veziküller veya organeller gibi yüklerin hücre içi taşınması, polarize mikrotübüller üzerinde izlenen moleküler motor proteinler tarafından gerçekleştirilir. Bu protokol, nöronların içinde hareket eden bireysel kargo parçacıklarının taşınma yönlülüğünün, ilişkili motor proteinlerin nispi miktarı ve türü ile korelasyonunu tanımlar.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Bu protokol, bir doku kültürü çipinde bir sferoidden uzatılan sağlam bir akson demetinin kendiliğinden montajı yoluyla insan iPS hücre türevi motor sinir organoidini imal etmek için kapsamlı bir prosedür sağlar.

Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi

fonksiyonel olarak aktif nöromüsküler kavşakların oluşumuyla sonuçlanan insan primer mezoangioblast türevli miyotüplerle birlikte insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi motor nöronları birlikte kült haline getirmekle ticari olarak mevcut mikroakışkan cihazlarda insan motor üniteleri üretmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mikroakışkan Cihazlarda Fonksiyonel Nöromüsküler Kavşaklara Sahip İnsan Motor Ünitelerinin Üretimi

Mevcut protokol, nöronal mitokondrinin mikroakışkan odalarda tohumlanmasını ve boyanmasını tanımlamaktadır. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, aksonlardaki mitokondrilerin, hücre gövdesi bölmesini etkilemeden farmakolojik zorluklara yanıt olarak özelliklerini analiz etmek için seçici tedavisine izin verir.

Aksonal Mitokondrinin Mikroakışkanlar Yardımlı Seçici Depolarizasyonu

Keşfedin mikroakışkan odacık sistemini kullanarak motor nöronlarda aksonal taşımayı izleme yöntemini. Bu protokol, nörodejeneratif hastalıklarda taşıma bozukluklarını araştırmak için gerçek zamanlı görüntüleme olanağı sunar.

Mikroakışkan Odacıksistemi Kullanılarak Motor Nöron Kültürlerinde Organellerin Aksonal Taşınması

Daha fazla video keşfet