Name: Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Keşfedin böbrek organoidlerinin vaskülarizasyonunu geliştiren yeni bir kültür protokolünü. Tavuk embriyosu koryoallantoik membranı üzerinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan bu yöntem, gelişim biyolojisi araştırmalarında kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Suomen Akatemia (Finlandiya Akademisi) (206038, 121647, 250900, 260056) tarafından finansal olarak desteklenmiştir; Mükemmellik Merkezi hibe 2012-201314), Munuaissäätiö - Finlandiya Böbrek ve Karaciğer Derneği, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Finlandiya İsveç Kültür Vakfı, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Finlandiya Kanser Derneği), Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013; FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) ve H2020 Marie Sklodow-Curie Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 642997. Yazarlar teknik yardım için Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias ve Hannele Härkman teşekkür ederiz.
Şekil 3, 4 ve Film 2 Geliştirmeizni ile yeniden yazdırılır.

Hayvan bakımı ve prosedürleri, laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin Finlandiya ulusal mevzuatı, deneysel ve diğer bilimsel amaçlarla kullanılan omurgalı hayvanları koruma için Avrupa Konvansiyonu (ETS 123) ve 86/609/EEC AB Direktifi'ne uygun olarak uygulanmıştır.
1. Tavuk CAM fare embriyonik böbrekler ve böbrek organoidler ekimi için minirezervuarlar imalatı ve ksenotransplantasyon deneyleri kurma
<ol><li>6 kuyu veya 12 kuyu plakası için tasarlanmış transwell hücre kültürü kesici uçlarını kullanın. NOT: Belirli bir deneye bağlı olarak büyük veya küçük minirezervuarlar kullanılabilir. Sekiz embriyonik böbreklere kadar ksenogreftleme veya aynı tavuk embriyosuna birkaç minirezervuar yerleştirildiğinde (örneğin, aynı tavuk CAM'de deney ve kontrol örnekleri) küçük minirezervuarlar kullanmak en iyisidir.</li>
	<li>Dairesel testere bıçağı veya el testeresi ile döner bir çok alet kullanarak kesici uçların kenarlarını kesilerek geçirilmeye bilen 2 mm yüksekliğinde plastik bir halka oluşturun.</li>
	<li>Bir neşter veya keskin bir bıçak ile bu minirezervuarların kenarları parlatmak.</li>
	<li>Minirezervuarları en az 1 saat boyunca %70 etanol ile sterilize edin.</li>
	<li>Minirezervuarları otoklavlı çift distile suda yıkayın ve laminar bir başlıkta kurutun.</li>
	<li>PBS ve kültür ortamındaki minirezervuarları durula (yüksek glikozlu DMEM/%10 FBS/1% penisilin-streptomisin).</li>
	<li>Rezervuarı petri kabına yerleştirin, bir damlanın üzerine (600 μL/400 μL) membran yukarı bakacak şekilde kültür ortamının üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Bir pipet veya cam kapiller tüp yardımı ile membran üzerinde eşit olarak diseksiyon ex vivo embriyonik böbrekler veya böbrek organoidler düzenleyin. Böbreklerin etrafında çok fazla sıvı bırakmaktan kaçının.</li>
	<li>37 °C ve %5 CO2'debir hücre kültürü kuluçka makinesinde numuneler 2-24 saat membrana bağlansın. NOT: En fazla sekiz E11.5 embriyonik fare böbrekler veya böbrek organoidler küçük eklemek üzerinde düzenlenebilir. Büyük kesici uç, ksenotransplant için daha büyük embriyonik doku parçaları veya CAM'in daha geniş bir alanında bir hücre-hidrojel karışımı için kullanılacaksa önerilir.</li>
	<li>Hücre kültürü kuluçka12,13daha önce yayınlanmış yöntemlere göre hazırlanan 8 günlük eski ovo kültürlü embriyonik tavuk alın.</li>
	<li>Minirezervuarları CAM'e aktarın, böylece greftler CAM'e bakacak ve membran onları büstü eder. Minirezervuarları CAM'in çevresine yerleştirin, böylece tavuk embriyosu üzerini örtmesinler. NOT: Transwell uçlarından 12 kuyu plakası için imal edilen küçük minirezervuarlar kullanılarak, bir CAM'a en fazla üç minirezervuar yerleştirilebilir.</li>
	<li>Minirezervuarlara 500°L (6 iyi kesici uç) veya 300°L (12 iyi kesici uç) ekleyin.</li>
	<li>En fazla 9 gün boyunca tavuk CAM üzerinde örnekleri yetiştirmek. Minirezervuarlarda günlük kültür ortamını değiştirin. NOT: Örneklerin vaskülarizasyonu transplantasyon dan sonra 24-48 saat olarak görülebilir.</li>
</ol>2. Özel tasarlanmış plakaların imalatı ve FiZD kültürleri kurulması
<ol><li>6 kuyu plakasının altında 20 mm çapında delikler delin. NOT: FiZD deneyleri için, 16 mm derinlikte 6 kuyu plakası kullanın (Malzeme Tablosu'ndabelirtilmiştir).</li>
	<li>Bir karşı lavabo matkap ucu, bir neşter veya keskin bir bıçak ile elektrikli bir matkap kullanarak deliklerin jantlar (özellikle üst tarafta) Lehçe.</li>
	<li>En az 1 saat boyunca% 70 etanol plakaları sterilize.</li>
	<li>Plakaları otoklavlı çift distile suda yıkayın ve steril koşullarda kurumasına izin verin.</li>
	<li>22 mm x 22 mm cam kapakları %70 etanol ile iyice yıkayın veya Saarela ve ark.11tarafından yayınlanan protokole göre temizleyin.</li>
	<li>Bir toksik olmayan doku tutkal kullanarak 6 kuyu plakaları deliklerin üst tarafına kapakları tutkal. Deliğin etrafına tutkal uygulayın ve kapağını hafifçe örtmek için yerleştirin. Tutkal kurusun.</li>
	<li>Plakaları stereomikroskop altında inceleyin ve gerekirse fazla kurutulmuş tutkalları kapak kapaklarının yüzeyinden çıkarın. NOT: Numunelerin eşit şekilde sıkıştırIlmesini sağlamak için kapak lının üzerinde tutkal olmadığından emin olun.</li>
	<li>Polistiren boncukları (70 μm partikül boyutu) eşit hidrojel hacmiyle karıştırın. Kuyu başına 50-100 μL hacim yeterlidir. NOT: Buz üzerinde hidrojel ve polistiren boncuk karışımı tutun.</li>
	<li>Membran yukarı bir diseksiyon mikroskobu altında bir transwell eklemek yerleştirin.</li>
	<li>Örnekleri (örn. ex vivo embriyonik böbrekler veya böbrek organoidleri) membran üzerinde eşit olarak düzenleyin.</li>
	<li>Kırılgan dokuların zarar görmesini önlemek için numunelerin yanına hidrojel/polistiren boncuk karışımını dikkatlice ekleyin.</li>
	<li>Transwell kesici uç, üzerinde biraraya getirilen numuneler ile membranAşağı bakacak şekilde çevirin.</li>
	<li>Yavaşça değiştirilmiş 6 iyi plaka bir kuyu içine eklemek yerleştirin ve hafifçe aşağı bastırın böylece örnekler boncuk seviyesine sıkıştırılır. NOT: Mikroskop kullanarak sıkıştırmanın ilerlemesini takip edin.</li>
	<li>Bir elinizle kuyuya hafifçe bastırArak kesiciye basılı tutun ve kesici ucun çevresinde üç noktada lehimleme demiri ile plastik eriterek plakaya sabitle.</li>
	<li>Kesici uç tabağa sabitlendiğinde, kuyuya 2 mL kültür ortamı (DMEM/%10 FBS/1% penisilin-streptomisin) ekleyin ve kalan kuyuları aynı şekilde plakada biraraya getirin.</li>
	<li>Bitmiş plakayı hızlandırılmış görüntüleme için ters bir mikroskobun sahnedeki kuvöze aktarın.</li>
	<li>Uygun deneysel ayarları kullanarak numunelerin hızlandırılmış görüntülemesini gerçekleştirin. NOT: Hızlandırılmış deneyler sırasında plaka kuyularında kültür ortamının değiştirilmesi gerekli değildir, ancak kesici uç taki yan larında ki deliklerden kolayca yapılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Klasik renal organotipik kültür yöntemini hassaslaştıran, vaskülarizasyon, uzlaşı gelişimi ve ex vivo embriyonik böbreklerin ve organoidlerin optimal 4D (yani 3D görüntü ve zaman) görüntülemesini sağlayan iki ayrıntılı protokol sunulmuştur. Bu bölümde yöntemlerdeki kritik adımlar vurgulanır ve sorun giderme konuları anlatılmaktadır.
Diğer CAM kültür yöntemleri ve bu gelişmiş tavuk CAM kültür yöntemi arasındaki önemli fark CAM embriyonik böbrekler ve böbrek organoidlerin ksenografting özel yapı...

Embriyonik böbreklerin organotipik kültür on yıllar önce nefrogenez çalışma için önemli bir model oldu1,2,3. Böbrek organoidleri sağlıklı ve hastalıklı böbreklerin gelişimini incelemek için gelişmiş bir model sistemi temsil4. Ancak her iki yöntemin de ana dezavantajı, her iki yöntemin de böbreğin ana işlevini yeniden özetlemesidir: kan filtrasyonu. Nefronlar ve renal vaskülatür renal organoidlerde ve organotipik kültürlerde gelişimin erken evresine benzer şekilde gelişir; ancak, in vitro oluşan glomeruli avaskülerkalır 5. Ex vivo embriyonik böbreklerin ve renal organoidlerin vaskülarizasyonu daha önce sadece in vivo koşullarda yapılan transplantasyon deneylerinde gösterilmiştir. Örneğin, bir fare böbrek kapsülü altında insan pluripotent kök hücre kaynaklı böbrek organoidlerinin nakli fonksiyonel bir evre6organoid nefron gelişimini sağlar.
Tamamen in vitro kültürler ile in vivo transplantasyon yöntemleri arasında ara yaklaşım, kuş embriyolarının CAM'ine ksenotransplantasyondur. Bozulmamış fare böbrek primordia vaskülarizasyonu daha önce bu sistem kullanılarak gösterilmiştir7,8. Bununla birlikte, ksenonakledilen murine böbrekteki renal vaskülatürin greft9'dandeğil, konak endotelden türetildiği gösterilmiştir. Bu gözlem, embriyonik böbrek modellerinin böbrek vaskülatürgelişimini inceleme potansiyelini önemli ölçüde azaltmıştır, çünkü deneysel koşullar donör kaynaklı endotel hücrelerinin hayatta kalması için müsamaha kariyetsizdir.
Bu protokolün ilk bölümünde sunulan kuş yumurtalarının CAM fare embriyonik böbreklerin ekimi için geliştirilmiş bir yöntemdir, organotipik kültür ve knenotransplantasyon mikroçevre koşulları birleştirerek. Önceki yöntemlerde en önemli gelişme, fare embriyonik böbrekleri ve böbrek organoidlerini doğrudan CAM'e yerleştirmek yerine, implantasyon alanının nakledilen dokuyu besleyen kültür ortamıyla dolu geçirilebilir minirezervuarlarla kaplanmasıdır. besinlerle kuruyup kurutularak korur. Deneylerin başarı oranı önemli ölçüde artar ve donör kaynaklı vaskülatür gelişimi için koşullar geliştirmek. Bu yöntemin ksenotransplant kültürlerine uygulanması, donör böbreklerden endojen endotel hücrelerinden oluşan glomerüler vaskülatür gelişimini ile sonuçlanmaktadır.
Hücresel morfogenezin detaylı analizi böbrek kültürü modellerinin bir diğer önemli uygulamasıdır. Böbrek kültürlerinin zaman atlamalı görüntü edinimi daha önce bildirilen yöntemler sadece genel morfolojisi ve embriyonik böbrek desenleme analizi için yeterlidir, ancak tek tek hücreleri izlemek için10. Son zamanlarda böbrek organoidlerinin ve organotipik kültürlerin yüksek çözünürlüklü konfokal 3D hızlandırılmış görüntülemesini amaçlayan yeni bir Sabit Z-Yön (FiZD) yöntemi tanımlanmıştır11. Bu yöntemde, organoidler ve embriyonik organlar, numunenin kalınlığı 70 μm'ye ulaşana kadar cam bir kapak kayması ile transwell insertin geçirilebilir bir zarı arasında hafifçe sıkıştırılır ve görüntüleme için en uygun optik koşulları sağlar. Yöntemlerin ikinci bölümünde, özel olarak tasarlanmış bir plakanın imalatı ve uzun süreli organoid görüntüleme için FiZD deneylerinin kurulumu için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Ayarlanabilir Kürek Matkap Ucu</td><td>Bosch</td><td>2609255277</td><td>20 mm çapında delikler açmak için</td></tr><tr><td>Otomatik Yumurta Çevirici</td><td>OLBA B.V., Hollanda</td><td>AT-42</td><td>Ex ovo kurulumundan önce yumurtaların kuluçkalanması için.</td></tr><tr><td>Hücre İnkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>13090543</td><td>Sıcaklık 37 ° C'ye ayarlandı; C, %90 nem, %5 CO<alt>2</alt></td></tr><tr><td>Hücre İnkübatörü</td><td>SANYO</td><td>10070347</td><td>Tavuk CAM kültürü inkübatörü. Sıcaklık 37 ° C'ye ayarlandı; C, %90 nem, %5 CO2</td></tr><tr><td>Cellstar 6 kuyulu Plaka</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>Uçlarla uyumlu 16 mm kuyu derinliği</td></tr><tr><td>Dremel Döner Alet için Daire Testere Bıçağı</td><td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Geçirgen Polikarbonat Membran Uçlu Çok Kuyulu Plaka</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>6 oyuklu plakalar için. 40 ve mikro; m gözenek boyutu</td></tr><tr><td>Havşa Açma Matkap Ucu</td><td>Craftomat, Bauhaus</td><td>22377902</td><td>Parlatma için (20,5 mm, 1/4", HSS)</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Cam Kılcal Boru</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Neşter</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Delme Makinesi</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC Profesyonel</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D777</td><td>Yüksek glikozlu</td></tr><tr><td>Yumurta Kuluçka Makinesi Kompakt S84</td><td>Grumbach, Almanya</td><td>8012</td><td>Ex ovo kurulumundan önce yumurtaların kuluçkalanması için. Sıcaklık 38 ° C'ye ayarlandı; Bağıl nem %60'ın üzerinde ayarlanmış C</td></tr> <tr><td>Etanol (%70)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Döllenmiş Yumurtalar</td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finlandiya</td><td></td><td>Hy-Line White ve Nick Chick</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Forseps DUMONT #5</td><td>Dumont</td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>Cam Lameller</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>Histoakril Tutkal</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Sahne Üstü İnkübatör</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline, özel yapım</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>Mini rezervuarların yıkanması.</td></tr><tr><td>Penisilin ve Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren Boncuklar</td><td>Korpüsküler</td><td>1000263-10</td><td>70 & mikro; m çapında</td></tr><tr><td>Döner Çok Amaçlı Alet Sistemi</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Havya Weller</td><td></td><td>TCP S</td><td>Isıtmalı cam kılcal damar da kullanılabilir</td></tr><tr><td>Thincert 12 oyuklu Hücre Kültürü Ekleri 0.4 & mikro; m-gözenekli Polistiren Membran</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert 0.4 & mikro ile 6 oyuklu Hücre Kültürü Ekleri; m-gözenekli Polistiren Membran</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

vaskülarizasyon, uzatılmış gelişim ve geliştirilmiş mikroskopi görüntüleme için renal organoid ve organotipik kültürün optimizasyonu

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embriyonik böbrek organotipik kültürler, ve özellikle pluripotent kök hücre kaynaklı böbrek organoidler, gelişimsel süreçleri takip etmek ve böbrek hastalığı modelleme için mükemmel araçlardır. Ancak, modeller vaskülarizasyon ve işlevsellik eksikliği ile sınırlıdır. Bunu gidermek için, bir kuş embriyosundaki koryoallantoik membrana (CAM) ksenogreftleme yöntemi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiş tir. Greftler, örnekleri CAM'a sabitleyen ve greftleri kurumaya karşı koruyan kültür ortamı sağlayan özel yapım minirezervuarlarla kaplanır. Geliştirilmiş kültür yöntemi ksenogreftlerin 9 güne kadar büyümesini sağlar. El yazması ayrıca, daha önce yayınlanmış Sabit Z-Yön (FiZD) yöntemini kullanarak renal organoidlerin ve organotipik kültürlerin uzun süreli konfokal görüntülemesi için en uygun koşulların nasıl sağlandığını da açıklamaktadır. Bu yöntem, embriyonik bir organı veya organoidi cam bir kapak kayması ile membran arasında büyük miktarda orta derecede sıkıştırır ve 12 güne kadar görüntüleme için mükemmel koşullar sağlar. Birlikte, bu yöntemler geliştirilmiş konfokal görüntüleme ile renal organoidler ve organotipik böbrek kültürleri vaskülarizasyon ve kan akışını sağlar. Burada açıklanan yöntemler böbreklerin temel ve uygulamalı fonksiyonlarını incelemek için son derece yararlıdır ex vivo. Her iki yöntem doku ve organoidler çeşitli uygulanabilir.

Burada sunulan CAM kültür protokolü, tavuk CAM'de knenotransplantasyon sonucu böbrek organoidlerinin ve embriyonik böbreklerin yüksek verimli vaskülariteleştirilmesini sağlamıştır (Şekil 1, Film 1). Kültür ortamı içeren minirezervuarlar donör dokuya besin sağlamakta ve uygun vaskülarizasyondan önceki zaman diliminde kurumasını korumuştur. Bu yöntem, donör kaynaklı endotel hücrelerinin büyümesi için izin koşulları sağladı. Bu nedenle, nakledilen böbreklerde ve organoidlerde r...

Bu çalışma, organ gelişimini incelemek için iki yöntem, kültürlü embriyonik organ ve organoidlerin vaskülarizasyonuna olanak sağlayan kuş embriyolarından koryoallantoik membran (CAM) üzerine geliştirilmiş bir ksinotransplantasyon kurulumu ve yeni bir sabit z-yönü yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı konfokal görüntüleme sağlayan modifiye deneysel koşulları ile organ kültürü yöntemi.

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Programlanmış kök hücrelerden elde edilen böbrek organ kültürü ve organeller böbrek gelişimi ve hastalığının arkasındaki mekanizmaları incelemek için mükemmel yollar sağlar. Ancak mevcut organ kültür sistemi böbreğe kan akışını sağlamaz. Bu nedenle, mevcut modeller eksik ve kan filtrasyon olan böbreğin ana işlevini recapitulate başarısız nedeni.Bu yayında, tavuk embriyosunun koroallantoik zarında embriyo böbreklerinin ve organoidlerinin yetiştirilmesi ve görüntülenmesi için geliştirilmiş bir protokol sunacağız. Yeni deneysel kurulumumuzda, CAM'e nakledilen böbrek ilkelerini kültür ortamıyla dolu geçirimli anlam rezervuarları ile kaplıyoruz. Bu protokol önemli ölçüde böbrek rudiments ve aynı zamanda içsel endotel hücrelerinin hayatta artırır.Bu yöntem gelişmekte olan glomerulus kan akışını sağlar. Son zamanlarda da yüksek çözünürlüklü konfokal 3D hızlandırılmış görüntüleme sunan yeni bir sabit set yön organ kültürü yöntemi yayınladı. Bu yöntem organoidlerin ve organ ilkelerinin uzun süreli konfokal görüntülemesi için en uygun koşulları sağlamıştır.Yaklaşımda, biz yavaşça bir cam kapak kayma ve geçirimli membran arasında doku sıkıştırmak. Burada özel tasarlanmış plakaların nasıl yapıldığını ve kültür deneylerinin nasıl kurulduğunu gösteriyoruz. Bu nedenle, bu yayında geliştirilmiş bir renal organel tüp kültür tekniği sayılmiyoruz.Bu yöntem, organel oluşumumodeli ve embriyonik böbrekler ve böbrek organoidleri ex vivo çalışma için yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapmak için daha iyi bir yol sunuyor. Deneyinize bağlı olarak, altı kuyulu veya 12 kuyulu plakalar için tasarlanmış transfer hücresi kontra uçlarını alın. Bir Dremel aracı kullanarak sıcık ın kenarlarını kesilerek, ona bağlı geçirilebilir bir zar bulunan iki milimetre yüksekliğinde plastik bir halka oluşturun.Bir neşter veya keskin bir bıçak ile swarf gelen halka kenarları lehçe. Mini rezervuarları en az bir saat boyunca %70 etanol ile sterilize edin. Daha sonra mini rezervuarları distile su yla otoklavda yıkayın ve laminar bir başlıkta kurulayın.PBS ve kültür ortamındaki mini rezervuarları durula. Rezervuarı, membran yukarı bakacak şekilde kültür ortamımızın üzerine bir petri kabına yerleştirin. Membran üzerinde diseksiyon ex vivo embriyonik böbrekler veya böbrek organoidler düzenleyin.Örneklerin etrafında çok fazla sıvı bırakmaktan kaçının ve onları bir hücre kültürü kuluçka makinesinde 2 ila 24 saat bağlı bırakın. Sekiz günlük eski ovo embriyonik tavuğun koryoallantoik zarına eksenal transplantasyon yapılır. Mini rezervuarları membranın grefti kapsaabilmesi için aktarın.Embriyoyu örtmesinler diye CAM'in çevresine yerleştirin. Sonra mini rezervuarlar için kültür orta ekleyin. Maksimum olarak dokuz gün boyunca tavuk CAM üzerinde örnekleri yetiştirmek.Mini rezervuarlarda günlük kültür ortamıdeğiştirin. Örneklerin vaskülarizasyonu transplantasyondan 24-48 saat sonra gözlenebilir. Sabit kültür için özel tasarlanmış altı-iyi plakalar yapmak için.Uygun bir matkap ucu ile bir sondaj makinesi kullanarak plakanın alt kısmında 20 milimetrelik delikler delme ile başlamak gerekir. Daha sonra, plakanın üst tarafındaki deliklerin jantlarını parlatın. Son olarak, en az bir saat boyunca% 70 etanol plakaları sterilize.Daha sonra plakaları distile su ile otoklavda yıkayın ve lemiar başlık içinde kurulayın. 22x22 milimetrelik kapağı %70 etanolde yıkayın ve tamamen kurutun. Tutkal doku tutkal kullanarak bir kuyunun dibinde bir deliğin üstüne kapak kayma.Kurutuldıktan sonra, steril mikroskop altında plakaları inceleyin ve fazla tutkal çıkarın. İlk olarak, eşit miktarda hidrojen ile polistiren boncukbir aliquot karıştırın. Transfill kesici kesici sokucu, membran yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve böbrekleri membran üzerinde düzenleyin.Dikkatle böbrekler yanında hidro-jel boncuk karışımı bir damla ekleyin. Transfill insertini ters çevirin, böylece membran ve böbrekler aşağı bakacak şekilde. Sonra dikkatle özel tasarlanmış altı kuyuplaka bizim kuyu içine eklemek yerleştirin.Sokağı yavaşça kuyuya doğru itin. Böbrek boncuklar ile düzeyde olana kadar mikroskop düzleme derecesini izleyin. Bir elinizle kuyuya hafifçe bastırArak kesiciye tutun ve lehim demiri ile kesici uç çevresinde üç noktada plastik eriterek plakaya sabitle.Yan tarafta bir açıklık ile kuyuya iki mililitre kültür ortamı ekleyin. Hızlandırılmış bir görüntülemeye başlarken, plakayı ters bir mikroskobun sahnedeki kuluçka makinesine aktarın. Modifiye CAM yakalama protokolümüz böbrek organoidlerinin ve embriyonik böbreklerin yüksek verimli vaskülariteleştirilmesini sağlar.Kültür ortamı içeren birçok rezervuar donör doku sağlar ve vascularizaton devam ilk dönemde kuruyan korur. Bu film bir embriyonik fare böbrek merkezinde tavuk CAM aşılanmış ve yedi gün boyunca kültürlü tavuk kan hücrelerinin akışını gösterir. Bu şekil paneli, geliştirilmiş CAM kültür yöntemimizin renal kaynaklı endotel hücreleri için izin veren koşullar sağladığını göstermektedir.A ve B rakamları, gün aralığında beş gün boyunca yetiştirilen embriyonik böbreklerin beş gün boyunca tavuk CAM'e aşılanmış merkez olduğunu göstermektedir. Fare spesifikleri ILE boyama CD-31 antikor cam aşılı böbrek merkezinin endotel hücre ağı sol yan kontrol daha geniş olduğunu göstermektedir. Şekil C fare kan damarları fare özel CD-31 antikor ile lekeli görmek ve tavuk kan damarları ile en çok.Şekil D ve E beş gün boyunca seyahat kültürü veya tavuk CAM yetiştirilen ve CD-31 ve Hoechst ile boyanmış fare embriyonik böbreklerin kriyokesitleri göstermektedir. Glomeruli vaskülatür daha böbreklerde kontrol kültürleri daha tavuk CAM kültürlü olgundur. Şekil F yedi gün boyunca bir transgenik GFP tavuk CAM kültürlü bir fare embriyonik böbrek gösterir.Fare endotel hücreleri CD-31 antikor ile boyanmıştır ve xenotransplanted fare böbreklerinde vaskülatür çoğunlukla ama sadece fare türetilmiş olduğunu gözlemleyebilirsiniz. Yeni sabit set yön kültürü sınırlı bir set mesafede embriyonik böbrekler ve organoidler kültürlenme sağlar. Geleneksel bir seyahat kültüründe, kültürlü organlar metal bir ızgara tarafından bir hava orta arayüzünde tutulan bir filtre üzerine yerleştirilir.Bu yöntem gelişme ve büyüme için iyi koşullar sağlar, ancak görüntüleme için en uygun değildir. Sabit ayarlı yön kültüründe, kültürlü organ çanak bir cam alt ve bir membran arasında preslenir ve kalınlığı burada spacer olarak çalışan polistiren boncuklar tarafından kontrol edilir. Gelişmekte olan organlar, organın daha iyi bir görünüm vererek kapak cam sağ görüntülenebilir.Bu şekil paneli, embriyonik böbreklerin ve böbrek organoidlerinin sabit ayarlı yön kültürü yöntemiyle kültüre alınabileceğini göstermektedir. Yedinci gün embriyonik böbrekler ve böbrek organoidlerinin parlak alan görüntüleri normal gelişim göstermektedir. Şekil C'de, Şekil D ile bir böbrek organoidinin gelişen nefronlarında GFB ekspresyonu aktive edilmiştir.E ve F figürleri 12 gün boyunca kültürlü fare böbreğini sunar. Travma bir ve nefron boyama eurethric tomurcuk ve podocites göstermektedir. Film de, MTMG bir embriyonik böbrek sunar, Tayvan cree kökenli, Tayvan cree endotel hücrelerinde GFB ifade indükler nerede.Gelişen embriyonik böbrekte renal endotel hücrelerinin mevcut olduğunu ve kültür yönteminde endotel ağının da gelişebileceğini görüyoruz. Sağdaki panelde, endotel hücrelerinin S şeklindeki evre nefronunvasküler yarıkiçine nasıl göç ettiğinizi görebilirsiniz. Burada tavuk CAM böbrek organoidleri ve embriyonik böbreklerin kzenotransplantasyonu için geliştirilmiş protokol sunduk.Bu protokol önemli ölçüde böbrek rudiments ve aynı zamanda içsel endotel hücrelerinin hayatta artırır. Bu yöntem gelişmekte olan glomerulus kan akışını sağlar. Burada sunulan diğer protokol, görüntüleme kalitesini artıran ve organel oluşumunu tek hücre düzeyinde incelemeye yardımcı olan sabit set yön organ kültürü yöntemidir.Yüksek çözünürlüklü görüntüler, böbrek organoidleri ve böbrek kültürlerinde hücresel davranışların otomatik hücre segmentasyonu ve bilgisayar tabanlı çalışması için uygundur.

optimization-renal-organoid-organotypic-culture-for-vascularization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, kuş embriyolarından alınan koryoallantoik membran (CAM) üzerinde geliştirilmiş bir ksenotransplantasyon kurulumu kullanılarak organ gelişimini incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tamamen vaskülarize kültürlenmiş embriyonik organların ve organoidlerin geliştirilmesine izin verir.

Tavuk TAT'ta Renal Organotipik Kültür: Renal Vasküler Mimari Oluşumunu İndüklemek İçin Tavuk TAT'ta Murin Böbrek Eksplantlarının Transplantasyonu İçin Bir Teknik

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX) genişletilmiş in vitro kültürünü mümkün kılacak yöntemleri göstermektedir. Bir adım, 3D hidrojellerde çok hücreli küme kültürlerinin genel canlılığını, canlı olmayan tek hücrelerin doğrudan çıkarılması yoluyla artırır. İkincibir adım, pdx kültürü için en iyi uygulamaları perfüzyonlu mikroakışkan bir platformda gösterir.

Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık

Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için bir protokol tarif ediyoruz. Bu protokol iki hafta içinde böbrek organoidleri üretir. Elde edilen böbrek organoidleri, paralel ilaç testi yaklaşımları için büyük ölçekli iplikçi şişelerinde veya çok kuyulu manyetik karıştırma plakalarında kültürlenebilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Bu yazıda, organoidlerin yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak kültürlenebildiği ve gözlemlenebildiğimm2 başına yüzlerce mikro konteynere sahip yeni bir kültür substratı türü için bir üretim protokolü sunulmaktadır. Hücre tohumlama ve immün boyama protokolleri de detaylandırılmıştır.

Organoidlerin kültürü ve 3D görüntülenmesi için yüksek verimli bir platform

Burada, tavuk embriyolarının selomik boşluğunda böbrek organoidlerinin transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler ve bu süreçleri verimli bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Tavuk Embriyolarında İntralomik Transplantasyon Yoluyla Böbrek Organoidlerinin Etkin Vaskülarizasyonu

Bu protokol, süspansiyon kültürü koşulları kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için kapsamlı ve etkili bir yöntem sunar. Bu çalışmanın birincil vurgusu, başlangıç hücre yoğunluğunun ve WNT agonist konsantrasyonunun belirlenmesinde yatmaktadır, böylece böbrek organoid araştırmalarıyla ilgilenen araştırmacılara fayda sağlamaktadır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Süspansiyonda Böbrek Organoidlerinin Üretilmesi

Burada, insan beyni organoidlerini çoklu olgunlaşma aşamalarında civciv koryoallantoik membranına (CAM) aşılamak için bir protokol sunuyoruz. Beyin organoidleri, kılavuzsuz standartlaştırılmış protokoller izlenerek büyütüldü.

Erken Güdümsüz İnsan Beyni Organoid Nörovasküler Niş İzin Veren Civciv Embriyo Korioallantoik Membran Modellemesi

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerini kullanarak vasküler organoidler oluşturmak için bir yöntem sunar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi

Keşfedin böbrek organoidlerinin vaskülarizasyonunu geliştiren yeni bir kültür protokolünü. Tavuk embriyosu koryoallantoik membranı üzerinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan bu yöntem, gelişim biyolojisi araştırmalarında kullanılabilir.

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu (Video) | JoVE Journal

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

Daha fazla video keşfet