İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Sarkobil disfonksiyonunun sarkoerik proteinlerdeki mutasyonlara bağlı kas güçsüzlüğü birincil nedeni olup olmadığını belirlemek için striated kas izole miyofibrillerin kontraktil özelliklerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bu teknik nanonewton çözünürlüğü ile çok yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri elde etmek için kullanılabilir. Bu protokol aynı zamanda permeabilize kardiyomiyositlerde kontraktiliti ölçmek için de uygundur.

Kuvvet dönüştürücüçok kırılgan olduğunu unutmayın. Bu yüzden yapıştırıcıyı montaj iğnesinden çıkarırken veya bir miyofibril yapıştırırken, sabit bir eliniz, çok pratik yapmanız ve çok sabırlı olmanız gerekir. Doku montaj önce, kas dokusu içeren tüp bir homogenizer çubuk yerleştirin.

Tüpü buzda tutarak, 5. Homojenizasyon sonunda, ortaya çıkan miyofibril süspansiyonun 50 mikrolitresini ve 250 mikrolitre rahatlatıcı çözeltiyi doku banyosundaki poli-HEMA kaplı slayta aktarın. Karışımı tozdan korumak için banyoyu bir kapakla kapatın ve miyofibrillerin damlanın dibine batmasını sağlamak için 5 ila 10 dakika bekleyin.

Miyofibrillerin batması sırasında Shellac'ı 65 santigrat derecede 30 ila 60 saniye ısıtın ve kaplamasız bir cam kaydırağa yaklaşık altı mikrolitre tutkal ekleyin. Bir tutkal tabakası görünene kadar her montaj iğnesinin ucunu tutkaliçine tekrar tekrar batırın. Sonra mikroskop aşamasında doku banyosu için yer açmak ve tutkal içeren cam slayt kaldırmak için dikey sonda ve piezo taşımak için mikro-manipülatörler kullanın.

Miyofibrilleri monte ettikten sonra, sarcomere uzunluğunu ölçmek için, miyofibrilin başlangıç sarcomere uzunluğunu 2,5 mikrometreye ayarlamak için piezo ve/veya kuvvet sondasını hareket ettirin. Sistem denetleyici yazılımının gemi işlevini kullanarak, miyofibril uzunluk ve genişlik ölçün. Miyofibril'i video görüntüsünün ortasına konumlandırmak ve miyofibril'in bir tarafından diğerine bir dikdörtgen ilerlemek için mikroskop aşamasını kullanın ve tutkal damlacıklarının koyu kenarını da dahil etmeye özen inin.

Verileri kaydetmeye başlamak için başlat'ı tıklatın. Beş saniye sonra duraklat'ı tıklatın. Uzunluk kaydedilmiş olacak.

Genişliği ölçmek için, miyofibril kendisi kenarının kontrastgörüntülemek için kamera 90 derece döndürün. Verileri kaydetmeye başlamak için dikdörtgeni ve başlat'ı tıklatın. Beş saniye sonra duraklat'ı tıklatın.

Genişlik kaydedilmiş olacak. Teta camı konumlandırmak için, teta camı dikkatle miyofibril doğru hareket etmek için gözlük ve manipülatör kullanın. Teta bardağının üst kanalını miyofibril ile hizalayın ve pozisyonu kontrol etmek için hızlı bir adım atın.

Theta cam hizalama kontrol etmek için arka plan rahatlatıcı akışı açın ve akış odası girişini açmak için bir Luer vana kolu kullanın. Daha sonra akış odası drenaj başlatmak ve akış odası taşan önlemek için, banyo vanası iki, mikro adım modu mikro, 48, 000 piston hedef ve 38-40 piston hızı için çıkış pompası vana ayarlayın. Gerilim intizam oranını ölçmek için, miyofibril'i %15 oranında gevşetmek için gerekli piezo hareketini hesaplayın ve bu değeri sinyal jeneratörüne girin.

Verileri ve açık vanaları kaydetmeye devam etmek için devam edin, rahatlatıcı çözeltinin akışını ve teta camından farklı kalsiyum konsantrasyonlarını sırasıyla başlatın. Temel kuvvetin sıfır volt olması için interferometrenin aralığını sıfırlamak için interferometredeki sıfırlama aralığını seçin. Kuvvet izi kararlı olduğunda, 100 mikrometre adım boyutu ile teta cam hızlı adım gerçekleştirin.

Kuvvet platosu ulaşıldığında, piezo ile kısaltma yeniden germe gerçekleştirin. Bir aktivasyon gevşeme izi kaydedilir. Duraklatma'yı tıklatın.

Adım adım esneme gerçekleştirmek için, başlangıç'ı tıklatın ve temel kuvvetin sıfır volt olması için interferometrenin aralığını sıfırlayın. Sinyal jeneratörü ile adım adım esneme gerçekleştirin. Streç bittiğinde, gevşek uzunluğu na miyofibril kısaltmak için piezo kullanın.

Ardından duraklat tuşuna basın ve durdurun ve verileri kaydedin. Burada, sağlıklı insan kuadriseps kas izole bir miyofibril ile aktif bir kuvvet deney kuvvet izleri gösterilir. Miyofibril, değişen kalsiyum konsantrasyonlarına sahip çözeltilerle beş kez aktive edildi ve milimetrenin karesi yaklaşık 123 milinewton luk tüm miyofibrillerin ortalama maksimum kuvveti ile aktive edildi.

Beş kalsiyum eğrisinin her birinde her bir aktivasyon sırasında ulaşılan plato kuvvetlerinden bir kuvvet kalsiyum konsantrasyon eğrisinin inşası, kalsiyum konsantrasyonunun maksimum kuvvet üretiminin %50'sinde hesaplanmasına olanak sağlar. Bu temsili analizde gösterildiği gibi, miyofibriller miyofibril türü hakkında ek soruları cevaplamak için tek bir deneyde birden fazla bileşikle tedavi edilebilir. Aktif kuvvet ve sarcomere uzunluğu da yeniden geliştirme, aktivasyon ve gevşeme oranlarının hesaplanmasına izin vermek için ölçülebilir.

Noktalı kırmızı kutuda gösterilen dik artış hem viskozite ve elastikiyet neden olur. Plato sadece elastik bileşeni andırır. Viskozite zorlanmaya doğrusal olarak direndiği için, gerginlik çıkarıldıktan sonra kuvvet düştü.

Theta camı konumlandırırken, miyofibril ile düzgün bir şekilde hizaladığınızdan emin olun. Aksi takdirde, etkinleştirme çözümü optik fiber ile kuvvet sondasının kantilever arasında gelebilir ve bu da verilerinizde yapıların oluşmasına neden olur. Ayrıca, miyofibril düzgün aktive olmayabilir.

Perfüzyon Bu yöntem de miyofibril kas lifi türünü belirlemek için uygundur. Örneğin, önce normal bir kalsiyum çözeltisi ile aynı çözeltinin perfüzyon takip ile miyofibril perfuse, ama sonra bir kas liftipi özel kuvvet arttırıcı bileşik ekleyebilirsiniz.