Name: Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Öğrenin, C. elegans canlı modellerinde FLIM kullanarak amiloid protein yapılarını in vivo ve invaziv olmayan şekilde karakterize etme yöntemini. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıkların temel mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanan kas-Q40-mRFP suşu. Nöronal-Q40-CFP Morimoto Lab bir tür hediye oldu. Biz DFG (KI-1988/5-1 JK, NeuroCure Doktora Bursu MLP için Mükemmellik NeuroCure Küme tarafından), EMBO (MLP kısa vadeli burs) ve Biyologlar Şirketi (CG ve MLP seyahat hibe) finansman için kabul. Ayrıca, YFP'nin inşalarının görüntülenmesi için kurulum sağlamak için Berlin'deki Max Delbrück Moleküler Tıp Merkezi'ndeki Gelişmiş Işık Mikroskobu görüntüleme tesisini de kabul ediyoruz.

1. C. eleganların senkronizasyonu
<ol><li>Senkronize C. elegans ya alkali nhipoklorit çözeltisi tedavisi ile ya da basit yumurtlama yoluyla 4 saat 20 °C8.</li>
	<li>Standart prosedürlere göre OP50 E. coli ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM)plakalarıüzerinde 20 °C'de nematodyetiştirin ve bakımını yap. Yaş nematodlar istenilen gelişim aşaması veya güne kadar. NOT: Bu protokolde genç yetişkinler 4.</li>
</ol>2. RNAi aracılı refakat makineleri besleme yoluyla nakavt
NOT: Nematodlar10ilgili RNAi vektörbe besleyerek ısı şok proteini 1(hsp-1) şaperon knockdown gerçekleştirin. HSP-1 RNAi plazmidahringer kütüphanesinden elde edildi (klon kimliği: F26D10.3).
<ol><li>50 g/mL ampisilin içeren Luria Bertani (LB) ortamında 6 saat boyunca hsp-1 RNAi plazmidini ifade eden HT115 (DE3) E. coli'yi büyütün.</li>
	<li>İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) ve ampisilin (25 g/mL) içeren taze NGM agar plakaları ve hsp-1 RNAi bakterisi ile tohum hazırlayın. Tabakları kurumaya bırakın ve oda sıcaklığında 1-3 gün bekletin.</li>
	<li>Senkronize yumurtaları bir siRNA plakasına yerleştirin ve yumurtadan çıkmaya bırakın veya gravid nematodları yerleştirin ve çıkarmadan önce 20 °C'de 4 saat yumurtlayın. İstenilen yaş veya aşamaya kadar nematodlar büyümek. NOT: İkinci nesil nematodlar nakavtın daha güçlü bir fenotipini ortaya çıkabilir. Burada açıklanan siRNA protokolü ve koşulları geneldir ve hsp1'euyarlanmıştır. Belirli bir klonun/genin siRNA ile RNA girişimlerinin son kullanıcı tarafından kurulması ve optimize edilmesi gerekir. Tüm siRNA'nın aynı verime sahip olmadığını ve bu nedenle de kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) veya Batı lekeleri ile darbenin etkinliğini nicel olarak test edilmesi tavsiye edilir.</li>
</ol>3. Mikroskopi slaytlarının hazırlanması
<ol><li>Görüntüleme gününde, görüntüleme slaytları hazırlayarak başlayın. % 3 (w / v) bir konsantrasyonda ddH2O eriyen agarose ve biraz soğumaya bırakın.</li>
	<li>1 mL pipet ucunu kesin ve yaklaşık 200 μL erimiş agarose alın. Pipet temiz bir cam slayt üzerine agarose ve hemen üstüne ikinci bir yerleştirin, herhangi bir kabarcıkoluşumukaçınarak. Kurumaya bırakın ve üst teki cam kaydırağı nazikçe çıkarın. Sonuç nematodlar konumlandırılmış olacak eşit bir agarose yüzeyi ile bir cam slayt. NOT: Her slayt 5-10 nematodlar arasında görüntü için kullanılacaktır. Slaytlar, agarose'un kurumasını önlemek için humified bir kutuda birkaç saat hazırlanabilir ve saklanabilir.</li>
</ol>4. Nematodların mikroskopi slaytlarına montajı
NOT: FLIM nematodların hareketsiz hale getirilmesigerekir. Görüntüleme kurulumu (örn. mikroskoplar, lazerler, dedektörler) kullanıma hazır olduğunda bu adımı gerçekleştirin.
<ol><li>Platin tel pick kullanarak, taze tohumsuz plaka üzerine istenilen yaş nematodları yerleştirin ve onları vücutlarından fazla OP50 bakteri kaldırmak için tarama izin.</li>
	<li>Nematod'u hareketsiz hale getirmek için anestezik bileşiği (sodyum azitveya levamisole) hazırlayın. 500 mM NaN3 stoğunu 4 °C'de karanlıkta tutun ve taze ddH2O'da 250 mM'lik son konsantrasyona seyreltin. Levamisole kullanıyorsanız, ddH2O'da 20 mM'lik bir stoğu 2 mM çalışma çözeltisine seyreltin. DİkKAT: Sodyum azit (NaN3)son derece zehirlidir. Eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ve havalandırmalı bir başlık altında çalışın.</li>
	<li>Stereomikroskop altında çalışarak, bir agarose ped üzerine 10 μL'lik bir anestezik bileşiği yerleştirin ve 5-10 nematod'u yavaşça içine aktarın. Nematodları ayırmak için kirpik ucu kullanın. Görüntü edinimi sırasında nematodların daha kolay yerelleştirilmesine olanak sağlamak için onları birbirine yakın tutun, ancak dokunmadan tutun.</li>
	<li>Dikkatle bir coverslip ile nematodlar bindirme. Montajdan sonra 1 saat içinde ölçümler alın. NOT: Her iki anestezi sonunda C. elegansöldürecek . Nematodlar görüntüleme sırasında tamamen hareketsiz olmalıdır, çünkü yaşam süresinin haritası her pikselden kaydedilir. x,y parametrelerinin herhangi bir hareketi aynı heyecanlı pikselde ömür boyu okunmasını engeller.</li>
</ol>5. FLIM verilerinin elde edilmesi
NOT: Bu protokolde florofor ömrü zaman alan TCSPC yöntemi ile elde edilir. FLIM bir dizi ve sabit tekrarlama hızında lazer tarafından oluşturulacak bir ışık darbesi gerektirir. Tekrarlama oranı lazer türüne göre değişir ve kullanıcı tarafından bilinmesi gerekir. Ömür boyu ölçümler, konvansiyonel mikroskopun yanına monte edilen dedektörler ve elektronik ekipmanlar la gerçekleştirilir. Bu protokolde, mRFP, CFP ve YFP ömürlerinin elde edilmesi için iki farklı şirket(Malzeme Tablosu)tarafından sağlanan dedektörler ve yazılımlarla üç farklı lazer tarama konfokal mikroskopüzerinde ölçümler yapılmaktadır. Emisyon/uyarma doğru filtreler yerinde olup olmadığını kontrol edin ve başlamadan önce herhangi bir arka plan veya monitör arka ışık en aza indirmek. Herhangi bir deneye başlamadan önce, seçilen florofor fotostabilitesi kurmak. Florofor nematod dokuları içinde kısa bir süre içinde beyazlıyorsa, C. elegans'taFLIM ölçümleri için uygun değildir.
<ol><li>FLIM satın alma yazılımını açın. FLIM yazılımı aynı zamanda konfokal mikroskobun kontrolünü de sağlar. Dedektörün çıktılarının etkinleştirilmesiiçin sekmeyi/düğmeyi bulun ve Çıkışları Etkinleştir'ebasın.</li>
	<li>Enstrümantal kurulumun zamanlama hassasiyetini açıklayan enstrüman yanıt işlevini (IRF) edinin. NOT: Bu adım nematodları monte etmeden önce tercihen yapılmalıdır.<ol>
<li>Varsa, uyarma/emisyon filtrelerini çıkarın.</li>
		<li>Hedefin üzerine boş bir kapak kaydırıcını yerleştirin ve yüzeyini bulun. Kapak tan elde edilen dağılım sinyalini en az 30 s olarak kaydedin. NOT: Birkaç nanosaniyelik ömürler boyunca, satın alma yazılımı Otomatik olarak IRF kaydırma tahmin edebilirsiniz. Bir IRF edinme her zaman önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slaytı monte edilmiş C. elegans ile sahneye yerleştirin. Şanzıman modunda 10x büyütme lensi kullanmak ve slayttaki nematodların konumunu yerelleştirin.</li>
	<li>Slaytı çıkarın, hedefi 63x büyütme merceği ile değiştirin ve gerekli daldırma ortamını (örn. yağ) uygulayın. Sahnedeki slaytı değiştirin ve nematodları yerelleştirin.</li>
	<li>Satın alma yazılımında Pinhole Yöneticisi'ni bulun ve Maksimum'aaçın. Numuneyi taramaya başlayın, ilgi çekici bir bölge seçin (örn. kafa, üst gövde) ve maksimum projeksiyon düzlemine odaklanın.</li>
	<li>Lazer darbe hızını ve yazılımın arabiriminde bulunan diğer üç değeri izleyin: Sabit Kesir Ayırıcı (CFD), Zaman-To-Genlik (TAC) ve Analog-to-Dijital Dönüştürücü (ADC). NOT: Lazer 1 x 108 tek foton sayısı maksimum kapısı olmalıdır. Bu sayı lazer tarafından sağlanan en fazla foton sayısını temsil eder. CFD dedektör tarafından lazer darbe referans tek foton darbe alınması hakkında bilgi sağlar. Bu değer kabaca 1 x 105olmalıdır. TAC, bir fotonun tespit edildiği zaman ile bir sonraki lazer darbesi arasında ayrım yapıyor. Son olarak, ADC, TAC voltajını storable bellek sinyaline dönüştürür11. CFD, TAC ve ADC, florofor tarafından yayılan fotonların kaybolmamasını sağlamak için benzer değerlere sahip olmalıdır. Bu parametrelerin doğru değerlendirilmesi, doğru bir yaşam boyu haritası oluşturmak için yeterli sayıda foton toplanmasını sağlar.</li>
	<li>FLIM yazılımının arabiriminde, algılanan fotonların sayısını önizleme: ADC değeri 1 x 104 ve 1 x 105arasında olmalıdır. Gerekirse, farklı bir düzlemde odak kayması veya daha fazla foton toplamak için lazer gücünü artırmak. NOT: Genel olarak, saniyede kaydedilen foton sayısı lazerin tekrarlama oranının %1'ini geçmemelidir.</li>
	<li>Menü çubuğunda, edinme parametrelerini ayarlamak için sekmeyi seçin. Tek bir foton algılamasına izin vermek için scan eşitle'yi seçin.</li>
	<li>Edinmeyi sabit bir zaman miktarına veya sabit sayıda fotona ayarlayın. Örneğin, 2 dakika boyunca veya tek bir piksel 2.000 tek olaydan oluşan bir foton sayısına ulaşana kadar ömür boyu çürüme eğrisi edinin. Satın almaya başlamak için Başlat'a basın. NOT: Farklı floroforlar farklı uyarma ve emisyon lazerleri ve filtreler igerektirecektir. Örneğin parlaklığına göre lazer gücü de ayarlanabilir, bu da kullanım ömrünü etkilemez. Bu protokoller aşağıdaki uyarma/emisyon ayarlarını kullanır: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Ex800/em440 nm kullanılarak CFP ölçümleri için darbeli iki foton lazer kullanılmıştır. Bir FLIM haritasının edinimi için gereken süre ve foton sayısının her kurulum ve her deneysel amaç için ampirik olarak belirlenmesi gerekir.</li>
</ol>6. FLIMfit yazılımı kullanılarak FLIM verilerinin analizi
NOT: Imperial College London12'de geliştirilen FLIMfit yazılım aracını kullanarak veri analizi yapın (Bkz. Şekil 1).
<ol><li>Dosya üzerinden yazılım açın ve FLIM veri dosyalarını içe aktarma | FLIM Verilerini Yükleyin. Farklı seanslarda ve farklı biyolojik tekrarlardan elde edilebilse bile, tüm numuneleri tek bir koşuldan yükleyin.</li>
	<li>Gerekirse, Segmentasyon üzerinden herhangi bir FLIM resimden tek bir nematod segment | Segmentasyon Yöneticisi. Kırpma aracını vurgulanana kadar ilgi alanının etrafına sürükleyin. Tamamlandıktan sonra Tamam'abasın. NOT: Tüm görüntüler için segmentasyon yapılmalıdır.</li>
	<li>C. elegans'ın yoğunluk tabanlı görüntüsünün göründüğü küçük bir bölge seçin(Şekil 1, Oklar 1). Bu bölgenin bozunma eğrisi arabirimin sağ tarafındaki büyük bozunma penceresinde görünür(Şekil 1, Ok 2). NOT: Bozunma doğrusal veya logaritma tiksintisi olarak görüntülenebilir.</li>
	<li>6.5-6.8 adımlarında açıklandığı gibi, yazılımın algoritması aracılığıyla kullanım ömrünü tahmin etmek için doğru parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>Veri sekmesinde (Şekil 1, Ok 3):<ol>
<li>İyi bir uyum sağlamak için çok loş pikselleri hariç tutmak için rasgele bir Tümleşik Minimum değer ayarlayın. C. elegans örneğine bağlı olarak bu değer 40-300 arasında değişir. Tatmin edici bir önizleme elde edilene kadar farklı değerler girişi.</li>
		<li>FLIM sinyalini bu değerlerle sınırlamak için bir Time Min ve Time Max numarasını seçin. Bu eşikten önce ve sonra görünen tüm olaylar hariç tutulur. NOT: Örneğin, mRFP analizi için, 800 ps önce ve 4.000 ps sonra olaylar hariç tutuldu. Bu değerler floroforun ömrüne bağlıdır ve son kullanıcı tarafından belirlenmelidir.</li>
		<li>Önceden ayarlanmış Counts/Photon 1'i değiştirmeyin.</li>
		<li>Satın alma sırasında kullanılan lazerin MHz cinsinden TekrarLama Oranınıgirdi. NOT: Mevcut protokol için farklı lazerler çeşitli tekrarlama oranları ile kullanılmıştır. CFP yaşam sürelerinin elde edilmesinde kullanılan iki foton lazer, 80 MHz tekrarlama oranına sahip, YFP için lazer 40 MHz'de tekrarlanır ve mRFP için değeri 78,01 MHz'dir. Bu değerler analiz edilen örneğe göre FLIMfit'e girilmiştir.</li>
		<li>Tüm doymuş pikselleri hariç tutmak için Bir Gate Max değeri giriş kurun. NOT: C. elegansyaşam boyu ölçümler için, bu değer herhangi bir büyük sayı (örneğin, 1 x 108)olarak ayarlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Ömür Boyu sekmesinde, kullanılacak genel bir montaj (örn. piksel açısından uygun bir montaj) seçin. Bkz. Şekil 1, Ok 4. NOT: Piksel açısından bir montaj, her bir piksele monte edilmiş bir bozunma üretir. Görüntü açısından bir montaj, her bir görüntünün küresel bir şekilde takılması sağlar ve görüntü başına tek bir ömür boyu değer görüntüler. Küresel-bilge uydurma tüm veri seti boyunca tek bir uydurma üretecektir. Tüm görüntüler için tek bir yaşam boyu değer sağlanır.</li>
	<li>No dışında başka bir parametre değiştirmeyin. Exp seçimi seçilen floresan çürüme multikonsonential olduğu ve tek bir ömürden daha fazla sergiler olduğu biliniyorsa. NOT: Bu protokolde, bu işlev biexponential CFP florofor ömürleri hesaplamak için kullanılmıştır.</li>
	<li>IRF menüsü üzerinden IRF yükleyin: IRF | Yük IRF. IRF değişimini tahmin etmek için IRF | Tahmin IRF Shift. IRF sekmesinde bir değer kümesi otomatik olarak görünür. Bu kurulduktan sonra, bu sekmenin diğer parametrelerini değiştirmeyin.</li>
	<li>Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, Fit Dataset (Şekil 1, Ok 5) tuşuna basın. Algoritma bozunma eğrisi için bir uyum üretecek ve her görüntü için bir ömür boyu değer oluşturacak. NOT: Mavi bir çizgide vurgulanan ortaya çıkan sığması, tüm olaylarla çakışmalıdır. Tüm olaylar uyum boyunca hizalandığında iyi bir uyum elde edilir.</li>
	<li>Yazılımın arabiriminin sağ üst menülerinde bulunan Parametreler sekmesini(Şekil 1, Ok 6) tıklatın ve İstatistik'i seçin: w_mean (ağırlıklı ortalama) ve chi2 değerinin mümkün olduğunca yakın olup olmadığını 1'e kontrol edin. NOT: Bir yakın bir chi2 uyum doğruluğunu sağlar. Böylece seçilen görüntünün yaşam boyu değeri tau_1olarak ortaya edilir.</li>
	<li>İlgi ni çeken herhangi bir bilgiyi dışa aktarma: Dosya | İhracat Yoğunluk Görüntüler / Fit Sonuç Tablosu / Görüntüler / Histogramlar. Kullanım ömrünü hesaplamak için kullanılan veri ayarlarını kaydetme: Dosya | Veri Ayarlarını Kaydet. NOT: Kullanılan parametreler, seçili örneklerin gelecekteki analizi için kaydedilir.</li>
</ol>7. FLIM verilerinin grafik gösterimleri
NOT: Farklı örneklerden toplanan yaşam ömürleri görsel olarak çeşitli şekillerde temsil edilebilir. Nanosaniye veya pikosaniye cinsinden yaşam boyu değerlerini belirtmek için seçin.
<ol><li>Çürüme eğrisini doğrudan FLIMfit'ten dışa aktararak eğrinin kalitesini ve doğruluğunu gösterin.</li>
	<li>Foton sayısının sıklığını histogramdaki yaşam boyu değerine göre çizerek fotonların dağılımını temsil edin.</li>
	<li>Son olarak, istatistiksel karşılaştırma için, iki veya daha fazla örneği karşılaştırıyorsanız, yaşam boyu değerleri artı bir dağılım çizimi çubuğu grafiğine ortalamanın standart sapması yerleştirin. İstenilen istatistiksel analizleri yapın.</li>
</ol>

<ol><li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li>
<li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58(2016).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. New York, NY. (2006).</li>
<li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li>
<li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li>
<li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+Synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li>
<li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li>
<li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687(2013).</li>
<li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li>
<li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-nanoimaging%3A+Protein+Misfolding+and+Aggregation%22%5BJournal%5D)">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li>
<li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+%CE%B1-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li>
<li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells%3A+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li>
<li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes%3A+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li>
<li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sunulan protokol, C. elegans model sistemindeki birleştirilmiş türleri tanımlamak için mikroskopi tabanlı bir tekniği tanımlar. FLIM, floresan yaşam larındaki çürümelerinin ölçümü yoluyla bir florofora kaynaşmış hem birakadar hem de çözünen türlerin varlığını doğru bir şekilde karakterize edebilir. Bir füzyon proteini toplama başladığında, kayıtlı ortalama ömrü daha yüksek bir değerden daha düşük bir değere kayacaktır16. Toplama eğilimi daha sonra ömür boyu düşüş tarafından çıkarıl...

Protein toplama hem yaşlanma da hem de hastalıkta görülür. Büyük amiloidlerin veya amorf inklütiflerin oluşumuna ve birikmesine yol açan yolları takip etmek zordur ve kinetiklerinin çözülmesi de benzer şekilde zordur. Proteinler genetik hastalıklarda olduğu gibi kodlama sekanslarındaki içsel mutasyonlara bağlı olarak yanlış katlanabilirler. Proteinler de yanlış çünkü proteostaz ağ (PN) onları çözünür ve düzgün katlanmış tutar bozulmuş, yaşlanma sırasında olur. PN moleküler şaperonlar ve bozulma makineleri içerir ve biyogenez sorumludur, katlama, ticareti, ve proteinlerin bozulması1.
C. elegans kısa ömrü nedeniyle yaşlanma ve hastalık çalışma modeli olarak ortaya çıkmıştır, izojenik doğa, ve genetik manipülasyon kolaylığı. Hassas dokularda insan hastalığına neden olan proteinleri ifade eden çeşitli C. elegans transgenik suşları oluşturulmuştur. Daha da önemlisi, agregasyona eğilimli proteinler içeren suşların çoğu amiloid bozukluklarının damgasını, büyük inklütiflerin oluşumunu özetler. C. elegans 'şeffaf vücut sayesinde, bu agregalar invivo görselleştirilmiş olabilir, noninvaziv ve nondestructively2. Bir florofor ile füzyon ilgi herhangi bir protein (POI) üreten yerleri, kaçakçılık, etkileşim ağı ve genel kaderi araştırmak için izin verir.
Floresan yaşam boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) ile yaşayan ve yaşlanan C. elegans'de hastalığa neden olan proteinlerin toplanması nın izlenmesi için bir protokol sokulmaktadır. FLIM, emisyon spektrumlarından ziyade florofor ömrüne dayanan güçlü bir tekniktir. Yaşam süresi (tau, τ) bir fotonun heyecanlı durumundan yer durumuna geri çürümek için gerekli ortalama süre olarak tanımlanır. Belirli bir molekülün ömrü zaman-ilişkili tek foton sayma (TCSPC) zaman-etki alanı tekniği ile hesaplanır. TCSPC-FLIM'de floresan bozunma fonksiyonu, kısa, yüksek frekanslı lazer darbeleri ile floroforheyecan verici ve yayılan fotonun varış sürelerinin darbelerle ilgili olarak bir dedektöre göre ölçülmesi ile elde edilir. Bir örnek tararken, her piksel için üç boyutlu bir veri dizisi oluşturulur: dizi, x,y uzamsal koordinatlarındaki fotonların dağılımı ve zamansal bozunma eğrisi hakkında bilgiler içerir. Bu nedenle verilen bir örnek, proteinin yapısı, bağlanması ve çevre3,4. Her floresan protein, genellikle birkaç nanosaniye (ns) olan, fiziksel özelliklerine bağlı olarak içsel ve tam olarak tanımlanmış bir yaşam süresine sahiptir. Daha da önemlisi, bir florofor ömrü konsantrasyonu, floresan yoğunluğu ve görüntüleme metodolojisi bağımsızdır. Ancak, biyolojik bir sistem içinde, pH, sıcaklık, iyon konsantrasyonları, oksijen doygunluğu ve etkileşim ortakları gibi çevresel faktörlerden etkilenebilir. Yaşam ömürleri iç yapısal değişikliklere ve oryantasyona karşı da hassastır. Bir poi için bir florofor eritme ömrü nde bir değişiklik ve dolayısıyla erimiş proteinin davranışı hakkında bilgi sonuçlanır. Bir florofor, amiloid yapının antiparalel beta sayfaları gibi sıkıca bağlanmış bir ortamda çevrili veya kapsüllendiğinde, 5.5 Florofor un söndürülme, görünür ömrünün kısalmasıyla sonuçlanır. Çözündüğünde, bir proteinin ömrü orijinal, daha yüksek değerine daha yakın kalır. Buna karşılık, bir protein toplambaşlar, ömrü kaçınılmaz olarak daha düşük birdeğerekayacak 6,7. Bu nedenle, yaşayan C. elegansfarklı yaşlarda herhangi bir amiloid oluşturan proteinin toplama eğilimini izlemek mümkün olur.
Burada farklı poliglutamin (CAG, Q) uzanır (Q40, Q44 ve Q85) oluşan bir füzyon proteininin agregasyon analiz etmek için bir protokol açıklar. Tekniğin siyan floresan protein (CFP), sarı floresan protein (YFP) ve monomerik kırmızı floresan protein (mRFP) gibi farklı floroforlara nasıl eşit olarak uygulanabileceğini gösteriyoruz; ve C. eleganstüm dokularda , nöronlar da dahil olmak üzere, kaslar, ve bağırsak. Ayrıca, proteostaz bağlamında, FLIM moleküler şaperonların tükenmesi üzerine değişiklikleri gözlemlemek için çok yararlı bir araçtır. RNA girişim yoluyla önemli moleküler şaperon, ısı şok proteini 1(hsp-1)yıkmak proteinlerin erken yanlış bağlanmasına neden olur. Yaşlanma, hastalık veya eksik şaperonların bir sonucu olarak toplama yükündeki artış, daha sonra floresan yaşam süresinde bir azalma olarak ölçülür.

<table><tbody><tr><td>Agar-Agar Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>5210.2</td><td>NGM bileşeni</td></tr><tr><td>Ahringer Kitaplığı hsp-1 siRNA</td><td>Kaynak BioScience UK Limited</td><td>F26D10.3</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K029.3</td><td>Antibiyotik</td></tr><tr><td>B & H DCS-120 SPC-150</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td></td><td>FLIM Aquisition yazılımı</td></tr><tr><td>B& H SPC830-SPC Görüntü</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td></td><td>FLIM Satın Alma yazılımı</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD-Bionsciences</td><td>211677</td><td>NGM bileşeni</td></tr><tr><td>C. elegans iQ44-YFP</td><td>CAENORHABDITIS GENETİK MERKEZİ (CGC)</td><td>OG412</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans iQ85-YFP</td><td></td><td></td><td>Morimoto Lab</td></tr><tr><td>C. elegans mQ40-RFP'den</td><td></td><td></td> nazik hediye<td>Morimoto Lab'dan nazik hediye</td></tr><tr><td>C. elegans nQ40-CFP</td><td></td><td></td><td>Morimoto Lab</td></tr><tr><td>Deckgl&auml'den nazik hediye; ser-18x18mm</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0657.2</td><td>Kapak fişleri</td></tr><tr><td>İzopropil-&beta;-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>2316.4</td><td></td></tr><tr><td>Leica M165 FC</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Montaj Stereomikroskobu</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>Levamizol Hidroklorür</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4341</td><td>Anestezik</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</em</td><td>>CAENORHABDİTİS GENETİK MERKEZİ (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>PicoQuant PicoHarp300</td><td>PicoQuant GmbH</td><td></td><td>FLIM Aquisition yazılımı</td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K305.1</td><td>Anestezik</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3957.2</td><td>NGM bileşeni</td></tr><tr><td>Standart-Objekttr&auml; ger</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0656.1</td><td>Cam slaytlar</td></tr><tr><td>Universal Agarose</td><td>Bio & Sell GmbH</td><td>BS20.46.500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Konfokal Mikroskop</td></tr></tbody></table>

yaşlanma c. floresan yaşam boyu görüntüleme kullanarak elegans amiloid yapıların karakterizasyonu

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amiloid fibrils Huntington gibi nörodejeneratif hastalıkların bir dizi ile ilişkilidir, Parkinson, veya Alzheimer hastalığı. Bu amiloid fibrils endojen metastabil proteinlerin yanı sıra proteostaz ağı bileşenleri (PN) sequester ve bu nedenle hücrede protein misfolding şiddetlendirebilir. Bir hayvan içinde amiloid proteinlerin toplama sürecini değerlendirmek için araçlar sınırlı sayıda vardır. Floresan yaşam boyu mikroskopi (FLIM) için nöronlar gibi belirli hücrelerde amiloid fibrilizasyonun izlenmesine ve ölçülmesine olanak tanıyan bir protokol sayılarak, yaşlanmanın ilerlemesi ve PN. FLIM florofor ifade düzeylerinden bağımsızdır ve daha fazla boyama veya ağartma olmadan toplama işleminin analizini sağlar. Florofororlar amiloid yapıların yakın çevresinde olduklarında söndürülürler, bu da floresan ömrün azalmasına neden olur. Söndürme doğrudan amiloid proteininin agregasyonu ile ilişkilidir. FLIM, farklı amiloid proteinlerin fibrilizasyon sürecini karşılaştırmak için uygulanabilen çok yönlü bir tekniktir, çevresel uyaranlar, ya da in vivo genetik arka planlar non-invaziv bir şekilde.

Protokol, hem doğal yaşlanma sırasında hem de strese maruz kaldığında, yaşayan C. elegans'tatoplanan türlerin oluşumunun nasıl doğru bir şekilde izlendiğini göstermektedir. 40Q, 44Q veya 85Q tekrarpoliglutamin proteinlerini ifade eden dört farklı transgenik nematod suşları seçtik. Bu proteinler farklı dokularda sentezlenir ve farklı floroforlara kaynaşır. C. elegans suşları ya vücut duvarı kaslarında Q40-mRFP ifade (mQ40-RFP), Sinir sisteminde Q40-CFP (nQ40-CFP), ve ya Q...

Floresan yaşam boyu görüntüleme, proteinlerin yaşam, yaşlanma ve stresli C. elegans hastalık modellerinde toplama eğilimlerini ölçer, ölçer ve ayırt eder.

Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Yöntem bize açıkça çözünür ve hatta birikmiş muadilleri entegre amiloid protein yapıları ayırt etmek için izin verir. Teknik in vivo çok az veya hiç toksik yan etkisi olmayan bir şekilde gerçekleştirilir. Floroforün floresan özelliklerine bağlı olduğundan, zamanla son derece sağlam ve tekrarlanabilir.FLIM kanser tanısı alanında kullanılmaktadır. Ancak, biz gerçekten nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili protein toplama temel mekanizmaları incelemek için istihdam. Metodoloji protein toplama alanında kullanılabilir.Hastalıkla ilişkili protein floresan sonda ile etiketlendiği sürece, zaman içinde izlenebilir ve izlenebilir. Toplamayı teşvik eden veya engelleyen bileşikler ve stratejiler başarılı bir şekilde incelenebilir. Işık mikroskobu ile görüntülenmeyi sağlayan herhangi bir biyolojik sistem, örneğin hücre kültüründe, sabitlenmiş veya geçirimli numunelerde ve gerekli herhangi bir ortamda, in vivo veya ex vivo fLIM için uygundur.Deneysel veri almadan önce seçtiğiniz floroforun nematod içindeki özelliklerini test etmeyi ve ölçümleri almadan önce kurulumun tamamen işlevsel olduğunu test etmeyi unutmayın. Başlamak için, büyümek ve NGM plakaları üzerinde 20 santigrat derece nematodlar korumak. Yaş genç yetişkinler ve yaşlı yetişkinler olarak yaşamın sekizinci gün olarak yaşamın dördüncü gününe kadar nematodlar.Görüntüleme gününde, görüntüleme slaytları hazırlayarak başlayın. Hacim olarak% 3 ağırlık tanınArak agarose ve çift distile su yerleştirin. Eritmek için bir mikrodalga içine aktarın ve sonra biraz soğumasını bekleyin.Bir mililitrelik pipet ucunu kesin ve erimiş agarose yaklaşık 200 mikrolitre almak. Pipet temiz bir cam slayt üzerine agarose ve hemen herhangi bir kabarcıkoluşumunu kaçınarak üstüne ikinci bir yerleştirin. Slaytları kurumaya bırakın ve üstteki cam kaydırağı nazikçe çıkarın.Sonuç nematodlar konumlandırılmış olacak eşit bir agarose yüzeyi ile bir cam slayt. Görüntüleme kurulumu kullanıma hazır olduğunda, stereo mikroskop altında çalışarak, 10 mikrolitrelik bir anestezik bileşiğin damlasını agarose pedin üzerine yerleştirin ve yavaşça içine 5 ila 10 nematod aktarın. Nematodları ayırmak için kirpik ucu kullanın.Görüntü edinimi sırasında nematodların daha kolay yerelleştirilmesine olanak sağlamak için onları birbirine yakın tutun, ancak dokunmadan tutun. Dikkatle bir coverslip ile nematodlar bindirme. Montajdan sonra bir saat içinde, ölçümler alın.Nematodların tamamen hareketsiz olduğundan emin ol. FLIM satın alma yazılımını açın. Sekme düğmesini bulun ve etkinleştirme çıktılarına basın.Sahneye monte edilmiş C.elegans ile slayt yerleştirin ve iletim modunda 10X büyütme lens kullanarak, slayt üzerinde nematodların konumunu yerelleştirmek. Slağı çıkarın, hedefi 63X büyütme merceğiile çevirin ve gerekli daldırma ortamını uygulayın. Slaytı sahneye yerleştirin ve nematodları yerelleştirin.Örneği taramaya başlayın. İlgi çekici bir bölge seçin ve maksimum projeksiyon düzlemine odaklanın. FLIM yazılımının arabiriminde, algılanan foton sayısını önizleyin.ADC değeri bir kere 10 ile dördüncü arasında, 10-5 arasında olmalıdır. Gerekirse, farklı bir düzlemde odak kayması veya daha fazla foton toplamak için lazer gücünü artırmak. Eğer foton kazık önlemek ama iyi bir ömür boyu uyum ve ölçüm oluşturmak için fotonyeterli miktarda toplamak emin olun.Menü çubuğunda, edinme parametrelerini ayarlamak için sekmeyi seçin. Tek bir foton algılamasına izin vermek için scan eşitle'yi seçin. Edinmeyi sabit bir zaman miktarına veya sabit sayıda fotona ayarlayın.Basın satın almaya başlamak için başlar. Yazılımı açın ve Dosya üzerinden FLIM veri dosyalarını aktarın, FLIM verilerini yükleyin. Farklı seanslarda ve farklı biyolojik tekrarlardan elde edilebilse bile tüm numuneleri tek bir koşuldan yükleyin.Gerekirse, segmentasyon, segmentasyon yöneticisi ile birçok FLIM resim için sinyal nematod segment. Kırpma aracını vurgulanana kadar ilgi alanının etrafına sürükleyin. Tamamlandıktan sonra Tamam'a basın. C.elegans'ın yoğunluk tabanlı görüntüsünün göründüğü küçük bir bölge seçin.Bu bölgenin bozunma eğrisi arabirimin sağ tarafındaki büyük bozunma penceresinde görünür. Veri sekmesinde, kullanım ömrünü tahmin etmek için, iyi bir uyum sağlamak için çok loş pikselleri hariç tutmak için 40 ila 300 arasında rasgele tümleşik bir minimum değer ayarlayın. FLIM sinyalini bu değerlerle sınırlamak için en az bir zaman ve en uzun süre numarası seçin.Önceden ayarlanmış sayımları değiştirmeyin foton. Satın alma sırasında kullanılan lazer megahertz tekrarlama oranı giriş. Tüm doymuş pikselleri hariç tutmak için bir kapı maksimum değeri girişi.Ömür boyu sekmesinde, kullanılacak genel bir montaj seçin. Seçilen floresan bozunma çok üstel olduğu ve tek bir yaşam süresinden daha fazla sergilediği biliniyorsa, üstel seçim sayısı dışında başka bir parametredeğiştirmeyin. IRF menüsünden IRF'yi yükleyin.IRF kaymasını tahmin etmek için IRF'yi seçin, IRF değişimini tahmin edin. IRF sekmesinde otomatik olarak bir değer kümesi görüntülenir. Bu kurulduktan sonra, bu sekmenin diğer parametrelerini değiştirmeyin.Tüm parametreler ayarlandıktan sonra uygun veri kümesine basın. Mavi çizgide vurgulanan ortaya çıkan sığması tüm olaylarla çakışmalıdır. Tüm olaylar uyum boyunca hizalandığında iyi bir uyum elde edilir.Yazılımın arabiriminin sağ üst menülerinde bulunan parametreler sekmesini tıklatın ve istatistik, ağırlıklı ortalamaseçin ve ki kare değerinin mümkün olduğunca yakın olup olmadığını kontrol edin. Böylece seçilen görüntünün yaşam boyu değeri tau bir olarak ortaya edilir. Dosya, ihracat yoğunluğu görüntüleri, uygun sonuç tablosu, görüntüler, histogramlar aracılığıyla ilgi herhangi bir bilgi dışa aktarın.C.elegans'ın yaşamın dördüncü veya sekizinci gününde kaslı Q40 RFP'yi ifade eden temsili haritaları burada gösterilmiştir. IQ85'in uzun Q uzantısı agregasyona daha yatkındı ve yaşamın dördüncü gününde histogramda floresan ömür boyu değişim sergiledi. Aslında, dördüncü günde IQ44'te yokken IQ85 için foci oluşumu gözlendi.Yaşlanma üzerine, Ancak, IQ44 de fosi oluşumu ve böylece azaltılmış floresan ömrü sergiledi. Son olarak, nq40CFP suşunda fosi oluşumu saptanmadı ve floresan ömrü azaltıldı. Bu gerginlik için, yaşlanma üzerine ortalama floresan ömür boyu sadece ince olmayan önemli değişiklikler vardı.Nematod modeli kurulduktan sonra, toplanan foton miktarı iyi bir ömür boyu uyum elde etmek için çok önemlidir. Yöntem, forster rezonans enerji transferi, FRET, fotobeyazrlama sonrası floresan geri kazanımı, FRAP veya ölçüm gibi farklı tekniklerle daha da birleştirilmiş olabilir. Tüm bu adaptasyonlar protein çalışmalarının özellikleri ve birleştirilmiş formu hakkında ekstra bilgi sağlar.Protein toplama ve protein homeostazı alanında, sistemde uygulanan herhangi bir tedirginliğin, farklı protein türlerinin dağılımının, insan ticaretinin ve genel olarak canlı organizmadaki çözünmez ve çözünmez protein fraksiyonlarının farkını ve önemini araştırmasına olanak sağladı. Anestezik sodyum azit toksiktir ve eldiven ve gözlük ile ele alınmalıdır ve bir duman başlık altında seyreltilmiş. Teknik mikroskopi tabanlı olduğundan lazerlerle ilgili tüm uyarıları takip etmek önemlidir.

characterization-amyloid-structures-aging-c-elegans-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, yaşlanmaya bağlı proteostaz düşüşünü belirlemek için in vivo görüntülemeye dayalı bir testi göstermektedir. Test, yaşa bağlı poliglutamin agregasyonunu ve proteotoksisitenin indüksiyonunu ölçmek için vücut duvarı kaslarında poliglutamin YFP-füzyon proteinini eksprese eden Caenorhabditis elegans'ı kullanır ve felce yol açar.

Floresan Raportör Tabanlı Felç Testi: Poliglutamin Floresan Raportörünün Yaşa Bağlı Progresif Oluşumunu ve İlişkili Felci Değerlendirmek İçin Bir Teknik Caenorhabditis elegans

Kaynak: Nyström, S., et al., Hiperspektral Konfokal Mikroskopi ve Floresan Ömür Boyu Görüntüleme ile Lüminesan Konjuge Oligotikofenlerle Boyanmış Amiloid Dokularının Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2017). Bu video, amiloid organizasyonunu yansıtan renk kodlu görüntülerde kompakt çekirdekleri mavi/yeşil ve kararsız çevre birimlerini kırmızı/sarı olarak ortaya çıkarmak için hFTAA boyası kullanarak floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu veya FLIM ile amiloid yapılarının analiz edilmesini...

Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanılarak Bir Doku Bölümündeki Amiloid Yapılarının Analiz Edilmesi

Kaynak: Pigazzini, M. L., et. al. Yaşlanmada Amiloid Yapıların Karakterizasyonu C. elegans{{}}. J. Vis. Uzm.  (2020). Bu video, C. elegans nöronlarında poliQ protein agregasyonunu değerlendirmek için floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunun (FLIM) kullanımını göstermektedir, kontrol ve şaperon protein eksikliği olan solucanları karşılaştırır. Şaperon eksikliği olan solucanlarda artan agregasyon, kümelenmiş floroforlar arasında enerji transferini teşvik ederek floresan ömrünü azaltır. FLIM...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında PolyQ Protein Agregasyonunun Floresan Ömür Boyu Görüntülenmesi

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Amiloid birikimi farklı hastalıklar özelliğidir ve birçok farklı organları afflicts. Bu kağıt Işıksaçan konjuge oligothiophene floresan Floresans mikroskobu teknikleri ile birlikte boyama uygulaması açıklanır. Bu boyama yöntemi algılama ve klinik ve bilimsel kurulumları protein toplamları keşfi için güçlü bir araç temsil eder.

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Lizozomal asit pH duyarlı hayati boya 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA) kullanarak C. elegans bağırsak kaybı soruşturma için bir adım adım...

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Biyolojik bilimlerin öğretilmesi, deneylerin kullanılmasıyla öğrenciler için daha teşvik edici hale getirilebilir. Bu el yazması, öğrencileri yüksek kalorili diyetler, açlık ve yaşlanma ile ilgili hipotezleri formüle etmeye ve test etmeye teşvik etmek için sınıfta kullanılabilecek iki farklı ancak tamamlayıcı protokol sunmaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması

Bu protokol, yaşlanma sırasında C. elegans'ın çoklu dokularında mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için standart bir yaklaşım sağlar.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Öğrenin, C. elegans canlı modellerinde FLIM kullanarak amiloid protein yapılarını in vivo ve invaziv olmayan şekilde karakterize etme yöntemini. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıkların temel mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet