Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

ICO veya ICO-seq, yüksek iş itimatr RNA sıralamasının mikroplara ilk uyarlamasıdır. Bu yöntem genom çapında mikrobiyal fonksiyonu değerlendirdi. Bu yöntem, tasarlanmış mikroplar için mikrobiyal genomdaki değişikliklerin işlevlerini nasıl zora girebileceğini açıklayabilir.

Bir süspansiyon kültüründen maya elde edin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Mililitre başına yaklaşık 750,000 hücre konsantrasyonu ile PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra, PBS ultra-düşük erime noktası agarose karıştırın ve 90 santigrat derece karışımı ısı, agarose eriyene kadar.

Agarose karışımını 0,22 mikron filtre ile şırıngaya yükleyin. 80 santigrat dereceye ayarlanmış bir uzay ısıtıcının önüne bir şırınga pompası yerleştirin ve şırıngayı pompaya yerleştirin. Maya süspansiyon ile ikinci bir şırınga doldurun, ve florlu yağ ile üçüncü bir şırınga doldurun, ile 2%iyonik florosuraktif.

Her iki şırıngayı da şırınga pompalarına yükleyin. Şırıngalardan gelen tüpü cihaza bağlayın A.15 mililitrelik konik tüpü buz kovasına yerleştirin ve çıkış borularını konik tüpe yönlendirin. Her şırınga için akış hızını ayarlayın ve 15 mililitrelik konik tüpte yaklaşık bir mililitre emülsiyon toplayın.

Tüpteki agarose'un ayarlanması için beş dakika bekledikten sonra, emülsiyona florlu yağda %20 perfloro-oktanol eşit hacim ekleyin. Konik tüpü birkaç kez ters çevirerek emülsiyon ve perfloro-oklüm karıştırın. Kırık emülsiyonunu 2,000 kez G'de iki dakika santrifüj edin.

Hidrojellerin yağ ve PFO fazlarının üzerinde peletlenmiş olduğundan emin olun. Yağ ve PFO fazlarını çıkarın. Hidrojelleri yeniden askıya almak için iki mililitre tet(W)tampon ekleyin.

Süspansiyonu 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Tüpü tekrar 2,000 kez G'de iki dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve tet (W) tekrar hidrojelleri yeniden askıya.

Hidrojelleri 2,000 kez G'de iki dakika döndükten sonra, iki mililitre maya kültür ortamındaki hidrojelleri yeniden askıya alın. Tüpü bir gecede 30 derecede titreyerek tüpe inatın. Her suş farklı oranlarda büyür.

Uygun bir ortam ve kuluçka süresi seçimi maya hidrojel içinde büyümek sağlamak için gereklidir, ama aşırı büyümek yok, hücreler medyaya kaçan yol. İlk olarak, hidrojelleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpü 2,000 kez G'de iki dakika santrifüj edin.

Hidrojelleri PBS ile iki kez yıkayın ve sonra bir kez sferoplasting tampon içinde. Sferoplasting tampon da sferoplasting enzim 40x seyreltme gerçekleştirin. Sonra, hidrojellere seyreltilmiş enzim bir mililitre ekleyin.

Hidrojel tüpünü 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Tedavi edilen maya daha şeffaf görünecektir. Hidrojel süspansiyoniçeren tüpten, tüpün altından süspansiyonun 0,8 mililitresini çekin ve bir mililitrelik uncapped şırıngaya aktarın.

Şırıngayı 3D baskılı şırınga tutucuya yerleştirin. Şırıngayı ve tutucuyu 2,000 kez G'de iki dakika santrifüj edin. Devam etmeden önce, hidrojellerin şırınganın altında sıkıca paketlenmiş olduğundan emin olun.

15 mililitrelik konik bir tüp içine 240, 000 damla-seq boncuk yerleştirin. Tüpü 1000 kez G'de bir dakika lığına santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve 500 milimolar sodyum klorür ile, 0.9x maya lysis tampon iki mililitre boncuk yeniden askıya.

Bir karıştırma çubuğu takın ve boncuk süspansiyonunu üç mililitrelik şırıngaya aktarın. Florlu yağda birkaç mililitre PFPE-PEG yüzey aktif maddesi içeren başka bir şırınga hazırlayın. Maya klon paketlenmiş hidrojellerin önceden hazırlanmış şırınga sını elde edin.

Kabul kafasını boşaltın ve şırıngayı kapatın. Şırınga pompaları içine üç şırınga, hidrojeller, boncuk süspansiyon ve yağ yerleştirin. Şırıngaları tüp aracılığıyla kapsülleme cihazı Olan B cihazına bağlayın.

Çıkış borusu ucunu buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüp içine yerleştirin. Her şırınga için akış hızını ayarlayın. Yaklaşık 1.000 mililitre emülsiyon toplayın veya hidrojel kalmayıp cihazı çalıştırın.

Sonra cDNA sentezi, kütüphane hazırlık ve sıralama için drop-seq protokolünü izleyin. Bir mikroakışkan cihaz kullanılarak, maya hücreleri 160 mikrometrelik damlacıklar kapsüllenmiş edildi. Sekiz kat bölünmüş bir bölük bu damlacıkları sekiz 60 mikrometrelik damlacıklara böldü.

Bir gecede kuluçka, bazı hidrojellerde büyüyen izojenik maya kolonilerinin ortaya çıktı. Maya hidrojellerini ikinci mikroakışkan cihaza yüklemeden önce yıkanmış ve hücre duvarlarını sindirmek için bir çözeltiye daldırılmış. Doğru sindirim mikroskopi ile doğrulandı, tedavi maya hücreleri daha yansıtıcı morfolojisi olan.

Lizis tamponundaki mRNA yakalama boncukları, ikinci mikroakışkan cihazın damla yapma kavşağından önce yakın paket maya hidrojelleri akışıyla karıştırıldı. Ortaya çıkan emülsiyonda, toplanan damlacıkların yaklaşık %10'u lysed kolonisi olan bir boncuk içeriyordu. Bu izojenik koloni sıralama iş akışı C.albicans beyaz opak anahtarlama yanıtı analiz etmek için kullanılmıştır.

Ana bileşen, PC, analiz ve tSNE boyutsallık azaltma örnek veri seti ve bir referans veri seti arasında genel uyum gösterdi. TSNE analizinde üç hücre kümesi saptandı. Küme iki ağırlıklı olarak örnek veri kümesinden hücrelerden oluşurken, sıfır ve bir küme her iki örnekteki hücrelerden oluşuyordu.

TSNE'deki WH11 ifadesinin üst üste konarak, küme bir'in büyük olasılıkla beyaz koloniler içerdiğini göstermiştir. STF2 ifadesi küme bir de artmış, daha önce elde edilen verilerle tutarlı. Sıfır ve iki kümelerinde WH11 ve STF2 küme bir ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde aşağı düzenlenmiştir.

Androjen mikropları, çok çeşitli hastalıkların tedavisinde biyolojik ürünler üretme potansiyeline sahiptir. Bu prosedürü takiben, sıralama verilerini daha fazla analiz etmek için çeşitli biyoinformatik araçlar uygulanabilir.