Name: Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Öğrenin, protein S-asilasyonunu canlı hücreler, primer dokular ve donmuş örneklerde hassas bir şekilde tespit etmek için Acyl-RAC yöntemini. Bu teknik, hücresel süreçleri ve protein etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma 5R01GM115446 ve 1R01GM130840 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Bu protokolde kullanılan fareler NIH kurallarına göre ötenazi yedirildi. Houston Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Hayvan Refahı Komitesi tüm hayvan çalışmaları onayladı.
1. Hücre lisatlarının hazırlanması
<ol><li>Tablo 1'deaçıklandığı gibi lysis arabelleği hazırlayın. 10 mL PBS'ye 0,1 g n-dodeyl β-D-maltoside deterjan (DDM) ekleyin ve çözülecek şekilde döndürün. 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyl 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) ve proteaz inhibitörü kokteyli (1x) ekleyin ve kullanmadan önce tamponu buz üzerinde soğutun.</li>
	<li>Herhangi bir hücre enkazından kurtulmak için 350 x g'de 350 x g'de kuvözden hücreleri içeren ortamların 15 mL veya 50 mL konik tüplere ve dönüş hücrelerine aktarılması gerekmektedir. NOT: Yapılacak her asil-RAC reaksiyonu için 1 x 107 hücre kullandık.</li>
	<li>Peleti 5 mL PBS'de yeniden sulayarak ve 5 dk boyunca 350 x g'da döndürerek yıkayın. NOT: PBS'de uzun süreli kuluçka nedeniyle hücre lisi önlemek için adım 1.3'ü hızlı bir şekilde gerçekleştirin.</li>
	<li>1.1 adımda hazırlanan 600 μL likli lisis tamponu peletin üzerine ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca bir termal çalkalayıcıda 1500 rpm'de sallayarak lyse.</li>
	<li>4 °C'de 20.000 x g'de 30 dk pelet deterjansız malzemeleriçin santrifüj ile temizler. Önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrofuge tüplerde temizlenmiş lysate toplayın ve buzüzerinde tutun.</li>
	<li>Protein konsantrasyonu tahmin etmek için Bradford/BCA tayini yapın. Deneyi gerçekleştirmeden önce farklı numuneler arasında aynı miktarda proteinin sağlanması çok önemlidir. Reaksiyon başına en az 500 μg protein kullanmanızı öneririz. NOT: Açıklanan deneylerde fare dokusundan kültürlü (Jurkat) hücreleri ve primer splenositler kullandık. Yukarıda açıklanan lysis yöntemi diğer hücre tiplerine de benimsenebilir. Yukarıda bahsedilen hücre tipleri için elde edilen ortalama protein konsantrasyonu 1 x 107 hücre başına yaklaşık 500 μg'dir. Jurkat hücreleri RPMI-1640 orta 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum pirüuvat, 4.500 mg/L glukoz ve 1.500 mg/L sodyum bikarbonat içeren modifiye edilmiş ve %5 CO2ile 37 °C'de %10 FBS ile desteklenmiştir. Reaksiyon başına 1 x 107 Jurkat hücreleri kullandık. Primer splenositler fare dalak dokusundan izole edildi26. Kısaca, dalak dokusu buz üzerinde maceralı, hipotonik çözelti de eritrositlerin lysis ve santrifüj ile lenfositler ayrılması izledi. Reaksiyon başına 1 x 107 primer hücre kullandık.</li>
</ol>2. Acyl-RAC: Serbest tiyol gruplarının engellenmesi
NOT: Sonraki tüm adımlar oda sıcaklığında (RT) yapılabilir.
<ol><li>Taze 1,5 mL mikrofuge tüpe lysate aktarın ve aşağıda açıklandığı gibi kloroform-metanol (CM) yağış gerçekleştirin.<ol>
<li>Lysate'nin son oranında lysate'ye metanol (MeOH) ve kloroform (CHCl3)ekleyin: MeOH: CHCl3 2:2:1 ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için şiddetle çalkalayın.</li>
		<li>Sulu ve organik fazlar arasındaki interfazda bir pelet ("gözleme") oluşturmak için 5 dk için 10.000 x g spin.</li>
		<li>Bir iğne veya jel yükleme ucu kullanarak tüpü yatırın ve mümkün olduğunca çok çözücü aspire edin.</li>
		<li>Protein peletini birkaç dakika havayla kurutun ve 600 μL MeOH ekleyerek ve peletin kırılmasını önlemek için hafifçe karıştırarak hafifçe yıkayın.</li>
		<li>Dikkatle kalan MeOH çıkarın ve yaklaşık 5 dakika boyunca bir tezgah üzerinde protein pelet kuru.</li>
		<li>(İsteğe bağlı) Örnek kaybını önlemek için MeOH yıkamadan sonra herhangi bir kırık pelet aşağı spin için ek bir santrifüj adım gerçekleştirin. NOT: Cm yağış adımından sonra deney durdurulabilir. Pelet elde edildikten sonra -20 °C'de 500 μL MeOH'da bir haftaya kadar saklanabilir.<ol>
<li>2SHB tamponunun 200 μL'si halinde protein peletini bir termal çalkalayıcıda 42 °C/1500 rpm'de girdaplayarak pelet eriyene kadar çözün.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(İsteğe bağlı) Pelet eritmek için bir sonicating su banyosu ek bir 5-10 dakika kuluçka. NOT: Sonication uzunluğu malzemenin çözünürlüğüne bağlı olarak değişir. Ancak, uzun süreli sonication protein bozulmasına neden olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2SHB'de %0,2 metil metil metanosiosulfonat (MMTS) (v/v) 2SHB'ye 298 μL 2SHB tamponuna 2 μL MMTS ekleyerek hazırlayın. NOT: Her deney için taze hazırlanmış %0,2 MMTS kullanın.</li>
	<li>Her tüpe 2SHB'de %0,2 MMTS'lik 200 μL'lik MMTS'yi %0,1 MMTS'lik son konsantrasyona ekleyin. 42 °C'de 15 dakika boyunca tüplü çalkalayıcıda 1500 rpm'de titreyerek inkübedin.</li>
</ol>3. Asil-RAC: Hidroksilin (HAM) dekoltesi ve S-asilated proteinlerin yakalanması
<ol><li>MMTS kaldırmak için yukarıda açıklandığı gibi 3-4x CM yağışları tekrarlayın. MMTS'nin çıkarılması, MMTS'nin belirgin kokusu ndan tahmin edilebilir. Her yağıştan sonra, pelet içözünceye kadar bir termal çalkalayıcıda 42 °C/1500 rpm girdap ile 2SHB tampon 100 μL pelet eritin ve sonra 300 μL Tampon A ile seyreltin.</li>
	<li>Son çökeltiden sonra, yukarıda açıklandığı gibi 2SHB tamponunun 200 μL'sinde numuneleri çözün ve 240 μL Tampon A ile seyreltin.</li>
	<li>Çeşitli tedavi koşullarına yanıt olarak S-aylasyondeğişiklikleri karşılaştırma durumunda, tekrar protein konsantrasyonu ölçmek ve her durum için protein eşit miktarda devam.</li>
	<li>Giriş kontrolü olarak her örnekten 40 μL tutun.</li>
	<li>Örnekleri 200 μL'lik iki eşit parçaya bölün ve tüpleri "+ HAM" ve "- HAM" olarak işaretleyin. Negatif kontrol olarak kullanılacak tüplerden birine (+ HAM) 400 mM ve ikinci tüpe (- HAM) 50°L nötr 2 M HAM (pH 7.0-7.5) ilave edin. Tiyopropil-Sepharose (TS) boncuk ilavesine devam edin. NOT: Cm yağış adımlarından herhangi biri sonra deney durdurulabilir. Pelet elde edildikten sonra -20 °C'de 500 μL MeOH'da bir haftaya kadar saklanabilir. 2 M HAM'lık nötr pH, asil-sistein tiyoester bağı için seçiciliğini sağlar ve dikkatlice ayarlanmalıdır. Aşırı köpük nedeniyle numune kaybını önlemek için 2SHB tampon numuneleri kullanılırken dikkatli olunmalıdır. Aşağıdaki tüm adımlar - HAM ve + HAM örnekleri için aynıdır.</li>
	<li>Her tüpe 30 μL TS boncuk-bulamaç ekleyin ve tüpleri RT'de 1-2 saat döndürün.</li>
	<li>Artık HAM'ı temizlemek için TS boncukları Tampon A'da %1 SDS ile 4 kat yıkayın.<ol>
<li>Yavaşça 1 dakika için bir mikrofuge kullanarak tüm boncuk örnekleri aşağı spin ve dikkatle supernatant aspire.</li>
		<li>Tampon A'da boncukları %1 SDS'nin 500 μL'inde yeniden askıya alın.</li>
		<li>Adımı 3.7.1-3.7.2'yi üç kez tekrarlayın. NOT: Aktif tiyopropil-Sepharoz (TS), kaplinden önce nötr pH'da yıkanması gereken katkı maddeleri varlığında dondurularak kurutulur. Distile su şişme ve yıkama için tavsiye edilir. Tartılan boncuk 0.1 g ve distile su 1 mL resuspend ve RT 30 dakika-1 saat dönerken şişmesine izin verin. Şişmiş TS nötr pH'da 4 °C'de %20 etanol varlığında bir haftaya kadar saklanabilir. Azit iyonları 2-piril disülfit grupları ile reaksiyona girer beri bir bakteriyostatik ajan olarak sodyum azit kullanmayın. Daha yüksek verimlilik için taze boncuklar hazırlayın. Boncukları kullanırken, P200 pipet ucunun ucu herhangi bir hasarı önlemek için hafifçe kesilebilir. NOT: Deney CM yağışından sonra herhangi bir aşamada durdurulabilir. Pelet 500 μL MeOH'da -20 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. S-asilated proteinlerin elüsyonu ve tespiti
<ol><li>Son yıkamadan sonra, yukarıda açıklandığı gibi boncukları hafifçe aşağı doğru çevirin ve boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok süpernatant aspire edin.</li>
	<li>DTT ile 4x SDS örnek tampon ile boncuklardan proteinleri kurtarın.<ol>
<li>Boncuklara 50 μL 4x SDS örnek tampon ekleyin ve 80 °C'de 1500 rpm'de bir termal çalkalayıcıda 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpler soğumaya bırakın.</li>
		<li>Boncukları 3 dk için 5.000 x g'de santrifüj edin ve eluted proteinleri jel yükleme ucu kullanarak taze 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SDS-PAGE çalıştırın ve batı blotting tarafından ilgi protein(ler) S-acylation analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li>
<li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li>
<li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li>
<li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina%2C+heart%2C+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li>
<li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li>
<li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li>
<li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li>
<li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206(2008).</li>
<li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+palmitoylation%2C+raft+localization%2C+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li>
<li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li>
<li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwissPalm%3A+Protein+Palmitoylation+database%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).</li>
<li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+%5B3H%5Dpalmitic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li>
<li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+are+IntechOpen+%2C+the+world%27s+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li>
<li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li>
<li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li>
<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li>
<li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li>
<li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+protein+S-acylation%3A+spotlight+on+structure%2C+mechanisms%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li>
<li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li>
<li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EBV-genome+negative+%22null%22+and+%22T%22+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li>
<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li>
<li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li>
<li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li>
<li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+%28PAG%29%2C+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein%2C+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li>
<li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li>
<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

Çıkar çatışması bildirilmemiş.

Burada, hem kültürlü insan hücrelerinde hem de fare dokusundan elde edilen birincil hücrelerde seçilen proteinlerin S-aylayasyonunu tespit etmek için asil-RAC analizini başarıyla kullandık. Bu yöntem basit, duyarlı ve standart biyokimya teknikleri kullanılarak minimum ekipman gereksinimleri ile kolayca yapılabilir. Bu yöntem, protein translokasyon sisteminin β-subunit (Sec61b), ribozomal protein S11 (Rps11) ve mikrozomal glutatyon-S-transferaz 3 (MGST3)22gibi yeni S-acylated proteinleri b...

S-acylation bir labile tiyoesterbağı1 ile bir hedef protein üzerinde bir iç sistein kalıntısı bir yağlı asil zincir eklenmesi içeren bir geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyondur. İlk olarak palmitat ile proteinlerin bir değişiklik olarak bildirilmiştir, doymuş 16-karbon yağ asidi2, ve bu nedenle bu değişiklik genellikle S-palmitoylation olarak adlandırılır. Palmitat ek olarak, proteinler geri daha uzun ve kısa doymuş çeşitli tarafından değiştirilebilir (myristate ve stearate), tekli doymamış (oleat) ve çoklu doymamış (arachidonate ve eikosapentanoat) yağ asitleri3,4,5,6,7. Ökaryotik hücrelerde, S-aylasyon DHHC protein ayltransferazlar olarak bilinen enzimler bir aile tarafından katalize edilir ve sistein deamilasyonu ters reaksiyon protein tiyoesterases tarafından katalize edilir, çoğu hala esrarengiz kalır8.
Tiyoester bağının lability bu lipid modifikasyonu geri dönüşümlü hale getirir, dinamik protein kümelenme düzenleyen izin, plazma membran lokalizasyonu, hücre içi ticareti, protein-protein etkileşimleri ve protein stabilitesi9,10. Sonuç olarak, S-acylation Huntington hastalığı, Alzheimer hastalığı ve kanser çeşitli türleri (prostat, mide, mesane, akciğer, kolorektal) dahil olmak üzere çeşitli bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, bu post-çeviriprotein modifikasyonu tespit etmek için güvenilir yöntemlergeliştirilmesini gerektirir11.
Radyoaktif metabolik etiketleme ([3H], [14C] veya [125I]) palmitat, protein S-aylasyonunu saymak için geliştirilen ilk yaklaşımlardan biridir12,13,14. Ancak, radyolabeling tabanlı yöntemler sağlık endişeleri mevcut, çok hassas değildir, zaman alıcı, ve sadece son derece bol proteinlerin lipidasyon tespit15. Radiolabeling için daha hızlı ve radyoaktif olmayan bir alternatif biyoortogonal yağ asidi probları ile metabolik etiketleme, hangi rutin protein S-acylation dinamikleri hesaplamak için kullanılır16. Bu yöntemde, bir kimyasal muhabir (alkine veya azit grubu) ile bir yağ asidi bir protein ayltransferaz tarafından S-asilat protein içine dahil edilmiştir. Azide-alkyne Huisgen sikloek reaksiyonu (tıklama kimyası) daha sonra bir florofor veya biyotin gibi işlevselleştirilmiş bir grup eklemek için kullanılabilir, Entegre yağ asidi S-acylated protein tespiti için izin17,18,19.
Acyl-biotin değişimi (ABE) doku örnekleri için uygun olmayan gibi metabolik etiketleme eksiklikleri bazı atlar S-acylated proteinlerin yakalanması ve belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan biyokimyasal yöntemlerden biridir15. Bu yöntem, dokular ve dondurulmuş hücre örnekleri20,21dahil olmak üzere biyolojik örnekler, çeşitli s-acilesyon analizi için uygulanabilir. Bu yöntem, nötr hidroksilin ile asil grup ve sistein kalıntısı arasındaki tiyoester bağının selektif bölünmesine dayanır. Serbest tiyol grupları daha sonra bir tiol-reaktif biotin türevi ile yakalanır. Üretilen biyotinylated proteinler daha sonra afinite-streptavidin agarose kullanılarak saflaştırılmış ve immünoblotting tarafından analiz edilir.
Alternatif bir yaklaşım acyl-reçine destekli yakalama denir (Acyl-RAC) daha sonra bir tiyol-reaktif reçine22,,23tarafından serbest sistein doğrudan konjugasyon ile biyotinylation adım yerine tanıtıldı . Bu yöntem, ABE ile karşılaştırıldığında daha az adıma sahiptir ve benzer şekilde çok çeşitli örneklerde protein S-alasyonunun saptanması için kullanılabilir1.
Acyl-RAC 4 ana adımdan oluşur (Şekil 1), 1. Serbest tiyol gruplarının engellenmesi; 2. Nötr hidroksilin ile sistein-asil tiyoester bağıseçici bölünme (HAM) sistein tiyol grupları ortaya çıkarmak için; 3. Bir tiyol-reaktif resin ile lipideli sistein yakalama; 4. Tampon azaltarak elüsyondan sonra S-asitli proteinlerin seçici zenginleşmesi.
Yakalanan proteinler daha sonra immünoblotting veya kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik türler ve dokuların çeşitli sitifom değerlendirmek için tabi analiz edilebilir22,24,25. Bireysel S-aylasyon siteleri de yakalanan proteinlerin tripsin sindirim ve LC-MS/MS22ile ortaya çıkan peptidlerin analizi ile tespit edilebilir. Burada, hem hücre hattında hem de doku örneğinde birden fazla proteinin S-amilasyonunun eşzamanlı olarak saptanmasında nasıl asil-RAC kullanılabileceğini gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>cOmplete Proteaz İnhibitörü Kokteyl tabletleri</td><td>Sigma</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>Hidroksilamin (HAM)</td> <td>Sigma</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>Metil methanetiosülfonat (MMTS)</td> <td>Sigma</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>Mini tüp döndürücü</td><td>LabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>Cayman</td><td>17630</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodesil ve beta;-D-maltosid (DDM)</td><td>Sigma</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz İnhibitörü Kokteyli 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Tiyopropil-Sefaroz 6B (TS)</td><td>Sigma</td><td>T8387</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik Quantrex Sonicator</td><td>L &; R</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acyl-reşin destekli yakalama ile protein s-acylation tespiti

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-aylasyon, ayrıca S-palmitoylation olarak anılacaktır, bir labile tiyoester bağı ile uzun zincirli yağ asitleri ile sistein kalıntıları ters çevrilebilir bir post-çevirici modifikasyonudur. Yaygın bir düzenleyici mekanizma olarak ortaya çıkan S-aylasyonu, kompleks oluşumundan protein ticaretine ve protein stabilitesine kadar proteinlerin biyolojik aktivitesinin neredeyse tüm yönlerini modüle edebilir. Protein S-aylasyonunun biyolojik işlevini anlamada son zamanlarda kaydedilen ilerleme, büyük ölçüde çeşitli biyolojik örneklerde protein S-amilasyonunun sağlam ve hassas bir şekilde algılanmasına olanak sağlayan yeni biyokimyasal aletlerin geliştirilmesi sayesinde gerçekleşetmiştir. Burada, endojen S-acylated proteinlerin tiol-reaktif Sepharose boncuklar tarafından seçici olarak ele geçirilmesine dayanan, son zamanlarda geliştirilen bir yöntem olan acyl reçin destekli yakalamayı (Acyl-RAC) tanımlıyoruz. Mevcut yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, Acyl-RAC daha az adım gerektirir ve yeni S-acylation hedeflerinin belirlenmesi için kütle spektrometresi ile birleştiğinde daha güvenilir sonuçlar verebilir. Bu teknikteki önemli bir sınırlama, aynı tiyoester bağı ile sisteinlara bağlı yağ asidi türleri arasında ayrım yapma becerisinin olmamasıdır.

Yukarıda açıklanan protokolü takiben, ilk olarak jurkat hücrelerinde çeşitli proteinlerin S-aylayasyon tespit etmek için ilk acyl-RAC kullanılan, bir ölümsüzleştirilmiş T hücre hattı aslında bir T hücreli lösemi hastasının periferik kan türetilmiştir27. Düzenleyici T hücre proteinleri daha önce S-acylatedolaraktanımlanan 9,28,29 bu yöntemin yarar göstermek için seçildi. Şekil 2A'da</s...

Acyl-RAC (Acyl-Reçin Destekli Yakalama), çeşitli biyolojik örneklerde sistein kalıntılarının (S-aylasyon) geri dönüşümlü lipid modifikasyonunu tespit etmek için son derece hassas, güvenilir ve kolay bir yöntemdir.

Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-reçin destekli yakalama veya Acyl-RAC biyolojik örneklerin çeşitli protein S-acylation tespit etmek için kullanılabilecek hassas ve güvenilir bir yöntemdir. Bu protokol, metabolik etiketleme ve radyo etiketlemenin bazı sınırlamalarını atlar ve birden fazla proteinin S-alasyonunun eşzamanlı olarak algılanmasını sağlar. Sadece canlı hücreler değil, aynı zamanda birincil dokular ve dondurulmuş örnekler.S-aylasyon protein ticareti, plazma membran hedefleme, sinyal transdüksiyonu, demir taşıma ve protein-protein etkileşimleri gibi çeşitli hücresel süreçleri düzenleyebilir. Tiyoester bağının verimli ve spesifik bir dekoltesini sağlamak için her deney için özenle ayarlanmış pH ile taze hazırlanmış hidroksilin çözeltisi kullanmak önemlidir. Bu yöntemin bir gösteri ile kloroform, metanol yağış gibi adımlar için kritik.Bu adımda elde edilen gözleme şekli pelet çok dikkatli kullanılmalıdır. Bu kırılgan olabilir ve adım sırasında numunenin kısmi kaybı düzensiz numune kurtarma yol açabilir. Prosedürü gösteren Savannah West, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.Hücre lysates elde etmek için, konik bir santrifüj tüp içine ilgi hücreleri toplamak. Ve santrifüj ile herhangi bir hücre enkaz kaldırın. PBS 5 mililitre pelet yıkayın.Ve hemen taze hazırlanmış lysis tampon 600 mikrolitre hücreleri askıya. Numuneyi dakikada 1,500 devirde bir termo shaker'da 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede çalkalayın. Lysates, pelet deterjan ve çözünür malzeme yi temizlemeden önce santrifüj ile.Santrifüj sonunda, önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik mikrocentrifuge tüp buz üzerinde temizlenmiş lysate toplamak. Ve standart protokollere göre protein konsantrasyonu tahmin etmek için bir Bradford veya bicinchoninic asit test gerçekleştirin. 2:1 oranında lysate metanol ve kloroform ekleyin.Homojen bir süspansiyon oluşturmak için titizlikle çalkalayın ve sulu ve organik evreler arasındaki arabirimde bir protein peleti toplamak için numuneyi santrifüj edin. Tüpü yatırarak, mümkün olduğunca çok çözücü aspire etmek için bir iğne veya jel yükleme ucu kullanın. Protein peletini hava birkaç dakika kurutun.Yavaşça metanol 600 mikrolitre ile tüp içeriğini karıştırmadan önce, pelet kırmak için değil dikkat. Dikkatle metanol yıkama çıkardıktan sonra, yaklaşık beş dakika boyunca bir tezgah üst üzerinde protein pelet kuru. Daha sonra, 2SHB tampon 200 mikrolitre protein pelet resuspend.Ve 42 santigrat derece ve bir termo shaker dakikada 1,500 devrimler girdap. Pelet çözündüğünde, numuneye 2SHB'de %0,2 MMTS'lik 200 mikrolitre ekleyin. Ve proteini 42 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yaslayın ve termoshake'de dakikada 1,500 devir.Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi 3:4 kloroform-metanol yağışları gerçekleştirin. MMTS'yi çıkarmak için peleti 100 mikrolitre taze 2SHB tamponu girdapla eritin. Ve her yağıştan sonra 300 mikrolitre tampon A ile numuneyi seyreltin.Son yağıştan sonra, numuneleri 2SHB tamponunun 200 mikrolitresinde çözün ve 240 mikrolitre tampon a.Measure ile seyreltin ve her numuneden giriş kontrolleri olarak 40 mikrolitre ayırın. Örnekleri 200 mikrolitrelik iki eşit hacime bölün. Tüpleri artı hidroksilin ve eksi hidroksilin olarak işaretleyin.Artı hidroksilin tüpüne 400 milimolar son konsantrasyonuna taze hazırlanmış nötr iki molar hidroksilin 50 mikrolitre ekleyin. Ve negatif kontrole nötr iki azılı sodyum klorür 50 mikrolitre, eksi hidroksilamin tüpü. Sonra her tüp için TS boncuk bulamaç 30 mikrolitre ekleyin.Ve tüpleri oda sıcaklığında 1-2 saat döndürün. Kuluçka sonunda herhangi bir artık hidroksilin kaldırmak için tampon A% 1 SDS ile boncuk dört kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tüm boncuk örneklerini üç nazik bir dakikalık mikrosantrifüjlerle yıkayın.Supernatants dikkatle spirating ve her yıkamada tampon A% 1 SDS 500 mikrolitre boncuk resucan. Son yıkamadan sonra, yavaşça gösterildiği gibi boncuk aşağı spin. Ve boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok süpernatant aspire edin.Boncuklardan proteinleri kurtarmak için, her tüpe %4 SDS numune tamponunun 50 mikrolitresini ekleyin ve numuneleri termo shaker'da 15 dakika boyunca dakikada 80 santigrat derece ve 1,500 devirde kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, tamamen boncuk pelet için santrifüj önce örnekleri soğumaya bırakın. Daha sonra yeni 1.5 mililitretüpler içine eluted proteinleri aktarmak için bir jel yükleme ucu kullanın.Ve örnekleri Bir SDS-PAGE jelüzerinde çalıştırın batı lekeleme tarafından ilgi proteinlerin S-acylation analiz etmek. Tirozin kinaz Lck nötr iki molar hidroksilin ile tedavi lizatlarda saptayabilir. sistein kalıntıları ve yağ asidi moiety arasındaki tiyoester bağı cleave.Soyunma ve proteinlere karşı antikorlar ile reprobing asil-rezorin destekli yakalama test aynı anda birden fazla protein S-aylation analiz etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, Lck, Fyn ve LAT S-acylation kolayca birincil fare splenositler tespit edilebilir. Bu modifikasyonun iki tür arasında korunduğuna işaret ediyor.Yeni S-asilated proteinlerin tanımlanmasına ek olarak, bu yöntem farklı biyolojik koşullar altında protein S-acilesyon değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. Yeni tanımlanan S-acylated proteinlerin sayısı çift kadar acyl-RAC gibi hızlı ve güvenilir bir teknik anlamına geliyordu sonra muazzam artmıştır. Yeni S-asilated proteinlerin tanımlanmasına ek olarak, bu yöntem farklı biyolojik koşullar altında protein S-acilesyon değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir.

detection-of-protein-s-acylation-using-acyl-resin-assisted-capture

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Bu protokol, proteinlerin sirtuinler için spesifik deasetilasyon substratları olarak rolünü belirlemek ve translasyon sonrası bir modifikasyon olarak tersinir - lizin asetilasyonunun rolünü daha fazla incelemek için in vitro ve in vivo deasetilasyon testlerini yürütmek için gerekli adımları açıklar.

Deasilasyon Tahliller Sirtuins arasında karşılıklı etkileşim (SIRT2) ve Özgül Protein yüzeylerde Unravel için

Protein fonksiyonunu, uzay-zamansal hücre altı lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşim ağlarını araştırmak için lokalizasyon ve afinite saflaştırma (LAP) etiketli indüklenebilir kararlı hücre hatları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Incelenmesi Protein Fonksiyonu, Spatiotemporal Yerelleştirme ve Protein Etkileşim Ağları için İndüklenebilir LAP-etiketli Kararlı Hücre Hatları

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Birden çok araştıran, endojen translasyonel modifikasyonlar hedef protein için son derece zor olabilir. Burada açıklanan teknikleri belirli PTM hedeflemede, benzeşim matrisler bir hedef için asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon değişiklikleri algılamak için geliştirilen bir en iyi duruma getirilmiş lizis tampon ve filtre sistemi kullanmak protein tek ve akıcı bir sistem kullanarak.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Burada, siteye özgü protein asetilasyon ve/veya succinylation İskan izni (stoichiometry) sonra sunulan değişiklikler için endojen değişiklikler ratiometric analizi ile tüm bir Proteom, tarafsız miktar mevcut nicel kimyasal asilasyonu kararlı izotop etiketli anhidritler kullanarak. Hassas verileri bağımsız edinme kütle spektrometresi ile birlikte, doğru site doluluk ölçümler elde edilir.

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Yağ asilasyonunun incelenmesinin hücresel protein etkileşimleri ve hastalıklarda önemli etkileri vardır. Burada sunulan, çeşitli hücre tiplerinde uygulanabilen ve nabız kovalama ve kütle spektrometrisi de dahil olmak üzere diğer tahlillerle birleştirilebilen yağlı asillenmiş proteinlerin tıklama kimyası tespitini geliştirmek için modifiye edilmiş bir protokoldür.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Protein tiol oksidasyonunun normal fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında önemli etkileri vardır. Reçine destekli yakalama, izobarik etiketleme ve kütle spektrometrisini kullanan, proteinlerin geri dönüşümlü olarak oksitlenmiş sistein kalıntılarının bölgeye özgü tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan kantitatif bir redoks proteomik yönteminin ayrıntılarını açıklıyoruz.

Reçine Destekli Yakalama, Protein Thiol Oksidasyonunun Çoklanmış Niceliği için İzobarik Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Birleştirildiğinde

Öğrenin, protein S-asilasyonunu canlı hücreler, primer dokular ve donmuş örneklerde hassas bir şekilde tespit etmek için Acyl-RAC yöntemini. Bu teknik, hücresel süreçleri ve protein etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir araç sunar.

Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

Daha fazla video keşfet