Name: Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Öğrenin, fare beyin dokusunda membran proteinlerinin palmitoylasyon durumunu APEGS jel kayma yöntemiyle nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, afinite saflaştırması gerektirmeden hızlı ve etkili analiz sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar tavsiye ve APEGS tayini üzerinde giriş için K. Woolfrey teşekkür ederim. Bu çalışmalar, Whitehall Vakfı ve NIH-NIMH'den (1R01MH119347) E.D.'ye yapılan araştırma hibeleri ile finanse edilmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından belirlenen yönergeleri takip ve California Üniversitesi, Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Fare beyin zarlarının hazırlanması
<ol><li>Bir giyotin aparatı kullanarak fareyi decapitate ve hızlı bir şekilde beyin dışarı diseksiyon (in <1 dk, mümkünse, diseksiyon işlemi sırasında oluşabilir palmitoylation değişiklikleri en aza indirmek için). 10 mL'lik homojenizasyon tamponu(Tablo 1)içinde bir cam homogenizer (~12 vuruş) buz üzerinde hemen homojenleştirin.</li>
	<li>Santrifüj 15 dk 1.400 x g 4 °C'de. Supernatant'ı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 710 x g'de eşit homojenizasyon tamponu ve santrifüj hacminde peleti (~6 vuruş) yeniden askıya alın.</li>
	<li>4 °C'de 20 dakika boyunca 40.000 x g'de 1.2 adımve santrifüjdeki süpernatanları birleştirin.</li>
	<li>Supernatant atın (sitosolik fraksiyonu) ve homojenizasyon tampon peletli membran (P2) fraksiyonu resuspend. NOT: Numuneler daha sonra kullanılmak üzere -80 °C'de dondurulabilir ve saklanabilir.</li>
	<li>Protein düzeylerini quantitate için bir bicinchoninic asit (BCA) tsay gerçekleştirin. APEGS ttübünü 1,5 mL'lik bir tüpte 470 μL tampon A(Tablo 1)hacminde ~100−200 mg protein (maksimum 250 mg) ile başlayın. İzole ve santrifüj >13.000 x g 10 dk 25 °C'de çözünmez proteini çıkarmak için. Çözünen proteini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
</ol>2. Acyl-PEGyl değişim jel-shift (APEGS) teşp
<ol><li>Disülfür bağlarını bozun ve serbest sisteinları engelleyin.<ol>
<li>25 mM tris (2-karboksitil)fosfin (TCEP; 25 μL, bir stok çözeltisinden eklenen) kuluçkaya yatarak disülfür bağlarını bozar; Tablo 1) 55 °C'de 60 dk.</li>
		<li>50 mM N-etilmaleimid (NEM; 12.5 μL, bir stok çözeltisinden eklenen) bloksuz sisteinlar; Tablo 1) 3 saat oda sıcaklığında. NOT: Reaksiyon bir gecede uzatılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kloroform metanol (CM) yağış gerçekleştirin.<ol>
<li>Protein çözeltisini 1,5 mL'lik tüpten, sallanan kova rotorunda mütevazı bir hızda santrifüj edilebilen polipropilen veya cam tüpe aktarın. 5 mL'lik bir tüp idealdir. Dört cilt (2 mL) metanol (MeOH) ve girdap kısaca ekleyin.</li>
		<li>Kloroform ve girdap kısa bir süre iki cilt (1 mL) ekleyin.</li>
		<li>Üç cilt (1,5 mL) dH2O ve girdap kısaca ekleyin.</li>
		<li>Numuneleri 3.000 x g'de 25 °C'de 30 dk'da sallanan bir kova rotoruile santrifüj edin.</li>
		<li>Üst fazı dikkatlice çıkarın ve atın.</li>
		<li>MeOH 3 cilt (1,5 mL) ekleyin ve opak protein gözleme parçalamak için dikkatli olmak, hafifçe ama iyice karıştırın.</li>
		<li>3.000 x g'de 25 °C'de sallanan bir kova rotorunda 10 dakika boyunca santrifüj.</li>
		<li>Bir cam serolojik pipet kullanarak, protein gözleme rahatsız etmeden mümkün olduğunca üst faz ın çok çıkarın.</li>
		<li>Peleti 1 mL MeOH ile dikkatlice durula.</li>
		<li>Hava en az 10 dakika pelet kuru. NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Palmitoyl-tiyoester bağlantılarının hidroksilin (NH2OH, HAM) bölünmesini gerçekleştirin.<ol>
<li>Resuspend protein ankesür 125 μL tampon A ve sonicate kısaca. Çözünmez malzemeyi çıkarmak için 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj. Çözünen proteini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
		<li>375 μL arabellek H (HAM+; Tablo 1) veya tampon T (HAM-; Tablo 1) ve 25 °C'de 60 dk kuluçka numuneleri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adım 2.2'de açıklanan CM yağışını tekrarlayın. NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>Korumasız sisteinlara mPEG ekleyin.<ol>
<li>10 mM TCEP içeren arabellek A 100 μL resuspend pelet. 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. NOT: CM yağış basamakları sırasında önemli miktarda protein kaybı nın meydana gelmiş olması normaldir. Sonraki tüm adımlar 1,5 mL'lik bir tüpte gerçekleştirilecektir ve protein hacmi maksimum ~120−130 μL'ye kadar kısıtlanacaktır. Bu son CM yağış sırasında protein kaybını azaltacaktır.</li>
		<li>20 mM mPEG-5k ekleyin (25 μL, bir stok çözeltisinden eklendi; Tablo 1) protein numunesi ve pipetleme ile karıştırın. 25 °C'de 60 dakika boyunca inkübün ve uç abitrotasyon.</li>
		<li>Dahil edilmemiş mPEG-5k'yi kaldırmak için, bu ayarlanmış hacimleri kullanarak adım 2.2'de açıklandığı gibi CM çökeltme gerçekleştirin: 4 birim MeOH (500 μL), 2 birim kloroform (250°L) ve 3 cilt dH2O (375°L). 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Kalın, flocculent gözleme kaçınarak, daha önce olduğu gibi dikkatle üst faz kaldırın. MeOH 1 mL ekleyin ve yavaşça ama iyice karıştırın. 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 1 mL MeOH ile peleti durula. 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj. Hava kuru pelet. NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.</li>
		<li>Kurutulmuş peleti 50 μL tampon A'da yeniden askıya alın (TCEP veya herhangi bir azaltma maddesi olmadan). BCA protein niceliği için 5 μL ayırın. Sayısallaştırmadan sonra, uygun miktarda 4x Laemmli numune tamponu ekleyin ve ilgi proteinine bağlı olarak numuneyi 10 dakika boyunca 70−100 °C'ye ısıtın. NOT: Kaynama bazı membran proteinlerinin toplanmasına neden olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PEGylated proteinlerin Batı leke analizi
<ol><li>Numuneyi sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezine (SDS-PAGE) yükleyin13. NOT: Bu protokolde %10 poliakrilamid kullanılmıştır.</li>
	<li>Batı lekeleme14için standart ayırma, aktarım ve algılama protokolleri kullanın.</li>
	<li>Pegylated ve nonPEGylated proteinlerin göreceli miktarlarını belirlemek için densitometri14 kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
<li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li>
<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability%2C+Localization%2C+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li>
<li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+%28APEGS%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Önceki çalışmamızda, SynDIG1'in stabiliteyi, lokalizasyonu ve fonksiyon6'yıdüzenlemek için aktiviteye bağımlı bir şekilde iki korunmuş yan yana transmembran Kis kalıntısı (tüm SynDIG proteinlerinde bulunan) palmitoylated olduğunu göstermek için ABE tsayını kullandık. Bir sınırlama ABE tahlil avidin moieties prosedürün son adım olarak konjuge agarose reçine ile yakınlık arınma gerektirir, kantitatif analiz karmaşık sinyal önemli kaybına neden. Ayrıca, ABE tsay bir protein palmitoylated bir kez veya...

S-palmitoylation kararlı membran ilişkisi, protein ticareti ve protein-proteinetkileşimleridüzenleyen hedef proteinlerin geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyon 1. Palmitoyl acyltransferaz (PAT) enzimleri tarafından katalize edilen tiyoester bağlantısı ile sistein kalıntılarına 16 karbonlu palmitat moiety eklenmesini içerir. Beyindeki birçok sinaptik proteinler palmitoylated, AMPA-Rs ve PSD-95 dahil, bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar düzenlemek için, lokalizasyon, ve fonksiyon2,3,4. PSD-95 gibi sinaptik silikatüritlik ile yardımcı faktörlerin etkileşimi yoluyla PSD sinaptik AMPAR düzeylerinde değişiklikler sinaptik plastisite altında; böylece sinaptik proteinlerin palmitoylation durumunu belirleme yöntemleri sinaptik plastisite mekanizmalarına önemli bir bakış açısı sağlar.
Daha önce,ampaper5 ile ilişkilendirmek beyin özgü transmembran proteinleri kodlama dört gen (SynDIG1-4) SynDIG aile tespit . Aşırı ekspresyon veya parçalanmış sıçan hipokampal nöronlar SynDIG1 knock-down artar veya azalır, sırasıyla, AMPA-R sinaps boyutu ve sayısı ~ 50% olarak immünositokimya ve elektrofizyoloji kullanılarak tespit5. Biz syndig1 iki korunmuş yan yana transmembran Cys kalıntılar (tüm SynDIG proteinlerde bulunan) bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar, lokalizasyon ve fonksiyon6düzenlemek için palmitoylated olduğunu göstermek için acyl-biotin değişimi (ABE) tsay kullanılmıştır. ABE tsay modifikasyon ve sonraki yakınlık saflaştırma7tarafından korunan sistein biotin değişimi dayanır. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, acyl-PEGyl döviz jel vardiya (APEGS) tsay8,9,10,11,12,hangi yakınlık arınma gerektirmez ve bunun yerine ilgi bir protein için modifikasyon sayısını belirlemek için jel hareketlilik değişiklikleri kullanır. Protokol, fare beyninden gelen ve uygun antikorların bulunduğu endojen membran proteinlerinin araştırılması için tanımlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Hidroksilamin (HAM)</td><td>ThermoFisher</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>Metoksi-PEG-(CH<alt>2</alt>)<alt>3</alt>NHCO(CH<alt>2</alt>)<alt>2</alt>-MAL (mPEG)</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>MW ~5000 kDa</td></tr><tr><td>Mikrofüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>veya eşdeğeri ekipman</td></tr><tr><td>N-etilmalemid (NEM)</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>Son derece zehirlidir.</td></tr><tr><td>Dansitometri için optik görüntüleyici</td><td>Azure Biosystems</td><td>Safir Biyomoleküler Görüntüleyici</td><td>veya eşdeğer ekipman</td></tr><tr><td>Kapaklı polipropilen tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler (cam)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td>veya eşdeğeri ekipman</td></tr><tr><td>Tris (2-karboksietil) fosfin-hidroklorür (TCEP)</td> <td>EMD Millipore</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

beyin zarı proteinlerinin palmitoylarasyonunun kantitatif tayini için acyl-pegyl exchange jel shift tayini

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Postsinaptik yoğunluk (PSD) içindeki sinaptik AMPA reseptörlerinin (AMPA) düzeylerindeki aktiviteye bağlı değişikliklerin öğrenme ve hafıza için hücresel bir mekanizmayı temsil olduğu düşünülmektedir. Palmitoylation ampa-Rs, yardımcı faktörler ve sinaptik iskeleler gibi birçok sinaptik proteinin lokalizasyonunu ve işlevini aktiviteye bağlı bir şekilde düzenler. AMPA'larla ilişki içinde olan ve sinaps gücünü düzenleyen, beyne özgü transmembran proteinlerini kodlayan dört genden oluşan sinaps farklılaşma (SynDIG) ailesini (SynDIG1-4) belirledik. SynDIG1, aktiviteye bağlı eksitatory sinaps gelişimi için önemli olan yan yana-transmembran bölgesinde 191 ve 192 pozisyonlarında bulunan iki sistein kalıntısında palmitoylatedtir. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, asil-PEGyl değişim jel shift (APEGS) tsay, ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak ve fare beyin lysates proteinlerin SynDIG ailesi ile yarar göstermek için.

İlgi proteinine karşı antikorlarla immünoblotlama, HAM'in dahil olmadığı örneklere kıyasla hareket kabiliyetine göre fare beynindeki palmitoylated durumunu (non, tek başına, iki kat, vb.) ortaya çıkarır. Daha önce, SynDIG1'in ABE tsay6kullanarak iki yerde palmitoylated olduğunu göstermiştik; Ancak her iki sitenin de beyin dokusunda modifiye edilip edilmediği belirlenemedi. Burada SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 ve Prrt2'nin fare beyninde palmitoylat olduğunu ve iki potansiy...

Palmitoylation geri dönüşümlü bir şekilde hedef proteinlerin sistein artıkları için 16 karbon palmitate moiety dahil gerektirir. Burada, fare beyin lysates ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak için, bir biyokimyasal yaklaşım, asil-PEGyl değişim jel vardiya (APEGS) tsay açıklar.

Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Bu biyokimyasal yöntem, uygun bir antikor mevcut olduğu beyinde ifade edilen herhangi bir membran proteininin palmitoylation durumunun belirlenmesini sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, yakınlık arınması gerektirmez ve bunun yerine ilgi bir protein in modifikasyon sayısını belirlemek için jel hareketlilik değişiklikleri kullanır. Beyin dışarı diseksiyon sonra, buz üzerinde bir cam homogenizer homojenizasyon tampon 10 mililitre hemen homojenize.Yaklaşık 12 vuruş kullanarak, 1400 kez G ve dört derece santigrat 15 dakika lysates santrifüj. Supernatant'ı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. 10 mililitre homojenizasyon tamponunda peleti yeniden askıya alın.Yaklaşık altı vuruş kullanarak homojenize edin. Süspansiyonu 710 kez G ve 4 santigrat derece 10 dakika santrifüj edin. Supernatants birleştirin ve 20 dakika boyunca 40, 000 kez G ve dört derece santigrat onları santrifüj.Supernatant atın ve bir pipet ucu ile pelet kırarak ve yukarı ve aşağı pipetleme bir homojenizasyon tampon pelet membran fraksiyonu resuspend. Protein düzeylerini quantitate için ABCA tayini gerçekleştirin. APEGS tayini gerçekleştirmek için, 1,5 mililitrelik bir tüpe 470 mikrolitre tampon A yerleştirin ve yaklaşık 100 ila 200 miligram protein ekleyin.Tüpü sonicate ve sonra 25 santigrat derece ve 10 dakika boyunca 13.000 kez G en az 13.000 kez gaz önsantrak tarafından çözünmez protein ayırın. Solubalize proteini yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. İlk olarak, 55 santigrat derecede 60 dakika boyunca TCEP 25 mikrolitre solubalize protein kuluçka ile disülfür bağları bozabilir.Daha sonra, oda sıcaklığında üç saat boyunca NEM stok çözeltisinin 12,5 mikrolitre sistein ile inkübünle serbest sisteinları bloke edin. Sonra, kloroform metanol yağış süreci başlar. Protein çözeltisini 1,5 mililitrelik tüpten, sallanan kova rotorunda mütevazı bir hızda santrifüj edilebilen polipropilen veya cam tüpe aktarın.Kısaca iki mililitre metanol ve girdap ekleyin. Kısaca bir mililitre kloroform ve girdap ekleyin. Sonra tekrar kısaca deiyonize su ve girdap 1,5 mililitre ekleyin.Gerekirse, tam karıştırma sağlamak için tüp ters. Numuneleri 3000 kez G ve 25 santigrat derecede 30 dakika sallayarak kova rotorunda santrifüj edin. Çözeltinin üst fazını dikkatlice çıkarın ve bir tüpe atın.Metanol 1.5 mililitre ekleyin. Opak protein gözleme parçalamak için dikkatli olmak, tüp nazik ters tarafından hafifçe ama iyice karıştırın. Numuneyi 3000 kez G ve 25 santigrat derecede 10 dakika sallayarak kova rotorunda santrifüj edin.Cam serolojik pipet kullanarak, protein gözleme bozmadan mümkün olduğunca çözeltinin üst fazı kadar çıkarın. Peleti bir mililitre metanolle dikkatlice durulayın ve en az 10 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Kloroform metanol yağışı tamamlandığında, palmitoyl tiyoester bağlantılarının bölünmesine başlanın ve 125 mikrolitrelik tampon A.Transfer'deki protein çökeltisini yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın.Tüpü kısa bir süre sonicate ve sonra 13, 000 kez G veya daha yüksek ve 25 derece santigrat 10 dakika çözünmez malzeme kaldırmak için santrifüj. Yeni 1.5 mililitre tüpler için solubalized protein aktarın ve tampon H veya tampon T.375 mikrolitre ekleyin.Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnekleri kuluçkasonra, kloroform metanol yağış tekrarlayın. Korumasız sisteinlara m-PEG eklemek için, peleti 10 mil veya daha fazla TCEP içeren 100 mikrolitre arabellek A'da yeniden sulayarak başlayın.Daha sonra süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Stok m-PEG 5K çözeltisi 25 mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Sonunda dönüş üzerinde oda sıcaklığında kuluçka.60 dakikalık kuluçkadan sonra, kloroform metanol çökeltisi tekrar gerçekleştirerek unincorporated m-PEG 5K çıkarın. 13,000 kez G ve 25 santigrat derece 10 dakika dan fazla santrifüj. Kalın, flocculent gözleme kaçınarak, daha önce olduğu gibi dikkatle üst faz kaldırın.Metanol bir mililitre ekleyin ve yavaşça ama iyice karıştırın. 13,000 kez G ve 25 santigrat derece 10 dakika dan fazla santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve metanol bir mililitre ile pelet durun.Yine, 13,000 kez G ve 25 derece santigrat derece 10 dakika dan fazla santrifüj. Pelet hava kurutultuktan sonra, TCEP veya herhangi bir azaltma maddesi olmadan tampon A 50 mikrolitre resuspend. BCA protein quantitation için çözeltinin 5 mikrolitre rezerv.Nicel likten sonra, uygun miktarda 4x Laemmli örnek arabellek ekleyin. Örneği bir SDS sayfa jeline yükleyin. Batı lekeleme için standart ayırma aktarım ve algılama protokollerini kullanın.SynDIG proteinlerinin palmitoylation durumunu araştırmak için, homojenize fare beyinlerinden P2 membran fraksiyonları APEGS tizine tabi tutuldu. Antikorlarla ayırma ve sondalama SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 ve Prrt2'nin fare beyninde palmitoylated olduğunu gösterdi. Kloroform metanol çökeltisinin amacı, NEM gibi bir kimyasalın protokolün bir sonraki adımına müdahale etmesini önlemektir.Uygun bir kloroform metanol yağış protein kaybını en aza indirirken istenmeyen kimyasalları kaldıracaktır. Bu yöntem, palmitoylation'un mekansal-zamansal düzenlemelerini araştırmak için farklı yaşlardaki farelerden veya farklı beyin bölgelerinden gelen beyin lysates'lerine uygulanabilir.

acyl-pegyl-exchange-gel-shift-assay-for-quantitative-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Video, fare beyin dokusundan izole edilen hücre zarı proteinlerinin palmitoilasyon durumunun analizini göstermektedir. İşlem, palmitoillenmemiş sisteinlerin açığa çıkarılmasını ve bunların bloke edilmesini, daha sonra palmitoillenmiş sisteinlere bağlanan ve izole edilen proteinlerin palmitoilasyon durumunun değerlendirilmesine yardımcı olan bir polimer kullanılmasını içerir.

Fare Beyin Dokusundan Hücre Zarı Proteinlerinin Palmitoilasyon Durumunun Değerlendirilmesi

Proteinlere palmitat arasında reversibl Ayrıca hücre içi protein ticaretinin önemli bir düzenleyicisidir. Bu birçok sinaptik proteinlerin palmitoylated edilir nöronların özel bir ilgi alanıdır. Biz birden fazla hücre tipleri ve dokuları için adapte edilebilir kültürü nöronlar içinde palmitoylated proteinleri tespit etmek için basit bir biyokimyasal yöntem kullanmaktadır.

Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Acyl-RAC (Acyl-Reçin Destekli Yakalama), çeşitli biyolojik örneklerde sistein kalıntılarının (S-aylasyon) geri dönüşümlü lipid modifikasyonunu tespit etmek için son derece hassas, güvenilir ve kolay bir yöntemdir.

Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Yağ asilasyonunun incelenmesinin hücresel protein etkileşimleri ve hastalıklarda önemli etkileri vardır. Burada sunulan, çeşitli hücre tiplerinde uygulanabilen ve nabız kovalama ve kütle spektrometrisi de dahil olmak üzere diğer tahlillerle birleştirilebilen yağlı asillenmiş proteinlerin tıklama kimyası tespitini geliştirmek için modifiye edilmiş bir protokoldür.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Plazma zarının lipitleri ile eksojen lipitler arasındaki değişime aracılık etmek için siklodekstrin kullanmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu teknik, lipid sal benzeri ortamlarda, sal benzeri olmayan ortamlarda olduğundan farklı davranan transmembran proteinleri inceleyen deneylerle eşleştirilebilir.

Canlı Hücrelerde Lipid Değişim Testi

Bu çalışma, GFAP ve hastalık neden olan mutasyonlarını biyokimyasal olarak karakterize etmek için filament montajı, toplama ve translasyon sonrası modifikasyona odaklanan deneysel yöntemleri ortaya koymaktadır. Yüksek saflıkta GFAP proteinleri analiz edildi ve Alexander hastalığı mekanizmalarına dair bilgiler ortaya çıkarıldı; bu da potansiyel terapötik hedefleri incelemek ve GFAP mutasyonları ile ilgili bozuklukları anlamak için bir çerçeve sağlayabilecektir.

Glial Fibriller Asitli Protein ve Hastalıkla İlgili Varyantlarının Biyokimyasal Analizi İçin Deneysel Yaklaşımlar

Öğrenin, fare beyin dokusunda membran proteinlerinin palmitoylasyon durumunu APEGS jel kayma yöntemiyle nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, afinite saflaştırması gerektirmeden hızlı ve etkili analiz sunar.

Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini

Daha fazla video keşfet