Name: Tilapia Lake Virüs Ünün Özel ve Hızlı Tespiti İçin Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzomal Amplifikasyon (RT-LAMP) Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Öğrenin, Tilapia göl virüsünü balık dokularında hızlı ve hassas bir şekilde tespit etmek için RT-LAMP yöntemini kullanmayı. Bu teknik, geleneksel RT-PCR'e göre daha basit ve hızlıdır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Proje mali Tayland Araştırma Fonu (TRF) hibe numarası RDG6050078 ve Merkezi Tarım ve Gıda İleri Çalışmalar, İleri Çalışmalar Enstitüsü, Kasetsart Üniversitesi, Bangkok, Tayland Yüksek Öğretim Araştırma Teşvik ve Ulusal Araştırma Üniversitesi Projesi, Yüksek Öğretim Komisyonu Ofisi, Eğitim Bakanlığı, Tayland altında finanse edilmektedir. Araştırma kısmen Kasetsart Üniversitesi Lisansüstü Programı Bursu ile desteklenmiştir. Yazarlar dr Kwanrawee Sirikanchana video ve Piyawatchara Sikarin video düzenleme için konuşma için teşekkür etmek istiyorum.

Hayvan dokusu kullanımını içeren bu deney, Bangkok, Tayland'daki Kasetsart Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numarası ACKU61-VET-009).
1. Doku toplama
<ol><li>Aşırı dozda karanfil yağı (yani 3 mL/L'den fazla) kullanarak tilapia balığı namına ötenazi. Triain metansülfonat karanfil yağı alternatif olarak kullanılabilir.</li>
	<li>Postmortem tilapia'nın karnını açmak ve yaklaşık 30-50 mg karaciğer dokusu çıkarmak veya mikroskop kapak camı kullanmak için steril mayo makası ve forceps kullanın, balık derisi tabakasını uzunlamasına kazıyarak (anteriordan posterior'a kadar) 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 100 μL mukus toplayın.</li>
	<li>RNA çıkarma adımına hemen devam edin veya toplanan numuneyi deneye kadar −80 °C'de tutun. Bozulmamış RNA DNA'dan daha hassas olduğundan, RNA ekstraksiyonu sırasında RNa içermeyen malzemeler ve reaktifler kullanın.</li>
</ol>2. RNA çıkarma
<ol><li>Karaciğer dokusundan RNA ayıklamak için, 600-1.000 μL guanidinium-acid-phenol ekstraksiyon reaktifi içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüneTable of Materialstilapia dokusunun 30-50 mg ekleyin ve bir el dokusu homogenizer kullanarak homojen kadar örnek pulverize. Doku örnekleri guanidinium-asit-fenol ekstraksiyon reaktifinin yaklaşık %10'una ihtiyaç duyar. Mukus örnekleri için guanidinium-acid-phenol ekstraksiyon reaktifinin sadece 300 μL'sini kullanın (3:1). DİkKAT: Guanidinium-asit-fenol ekstraksiyon reaktifi toksiktir; bu nedenle, işleme özenle yapılmalıdır. Güvenlik gözlükleri, laboratuvar elbisesi ve güvenlik eldivenleri gibi koruyucu ekipmanlar giyilmelidir.</li>
	<li>Homojenize numuneyi oda sıcaklığında 30 s'de 10.000 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Tüpe %95 eşit hacim ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Çözeltiyi bir toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa(Malzeme Tablosu)aktarın ve oda sıcaklığında 30 s için 10.000 x g'de santrifüj koyun. Akış tan atın ve dönüş sütununu yeni bir toplama tüpüne aktarın.</li>
	<li>Akış tan önce oda sıcaklığında 30 s için 10.000 x g'de kolona 400 μL RNA Ön Yıkama reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. NOT: RNA Ön Yıkama'yı hazırlamak için 40 mL RNA Pre-Wash konsantresine 10 mL %95 etanol ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 10.000 x g'de kolona 700 μL RNA Yıkama Tamponu(Malzeme Tablosu)ekleyin. Kolonu steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. NOT: RNA Yıkama Tamponu hazırlamak için, 12 mL RNA Yıkama Tampon konsantresine 52 mL %95 etanol ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 30 s için 10.000 x g'de 100°L nükleaz içermeyen su ve santrifüj ile spin kolon matrisinde yakalanan RNA örneğini eute.</li>
	<li>Mikro hacimsi spektrofotometre kullanarak çıkarılan RNA'nın konsantrasyonunu ölçün ve çekirdeksiz su kullanarak RNA'yı istenilen konsantrasyona seyreltin. NOT: OD260/OD280'in nitelikli emici değeri 1,6 ile 1,9 arasında değişmekte dir ve RT-LAMP tsayı için kabul edilebilir RNA saflığını gösterir.</li>
	<li>Hemen bir sonraki adıma geçin veya numuneyi kullanıma kadar −80 °C'de tutun.</li>
</ol>3. Astar tasarımı
<ol><li>RT-LAMP için özel astarları tasarlamak için Primer Explorer sürüm 4'nü kullanın. Web sitesine gidin, https://primerexplorer.jp/e/ ve PrimerExplorer V4 düğmesine tıklayın.</li>
	<li>FASTA formatında TiLV'nin 3. Primer Design NOT: Tilapia lake virus TV1 segment 31'itemsil eden GenBank katılım numarası KX631923'ten FASTA formatında dizileri alın.</li>
	<li>Astarları tasarlamak için aşağıdaki temel parametreleri girdi: - %40-60 GC içeriği - ≥280 baz çifti (bp) bir amplicon - Maksimum 5 °C'lik farka sahip astarlar arasında benzer bir erime sıcaklığı (Tm) NOT: Astarlar birbirini tamamlamamalıdır<ol>
<li>Sekonder yapılar oluşturmaya yatkın sıralı bölgelerden kaçının.</li>
		<li>En büyük ΔG için en uygun tasarım için en az −3,5 ile dimer astar analizini seçin ve daha küçük ΔG için en uygun tasarım için en fazla −4 olan astarların uçlarını seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oluştur düğmesini tıklatın. NOT: Yazılım giriş verilerini işlemeyi bitirdikten sonra astar sonuçları gösterilir (Şekil 1).</li>
</ol>4. RT-LAMP teşp
<ol><li>2.5 μL 1x SD II reaksiyon tamponu, 3 μL 6 mM MgSO4, 1.4 mM dNTP set, 0.8 M betain, 0.052 mM kalsin karışımının 1.3 l'si, 1.6μM TiLV-F3 asal 1 000 000 000 calcein karışımı, 1 μL'lik 1.6 mM MgSO reaksiyon tamponu içeren bir RT-LAMP ana karışımı hazırlayın, 1 μL 1,6 μM TiLV-B3 astar, 1 μL 0,2 μM TiLV-BIP astar, 0,2 μM TiLV-FIP astar, 1 μL 0,3 Bst DNA polimeraz, 1 μL 0,1 U AMV ters transkripsiyonu ve reaksiyon başına 3,8 μL nükleazsız su. NOT: Toplam reaksiyon hacminin en az %10'unu oluşturan fazla ana karışımı hazırlayın.</li>
	<li>RT-LAMP ana karışımının 22 μL'sini steril 1,5 mikrosantrifüj tüpe dağıtın.</li>
	<li>Çıkarılan RNA'nın 3 μL'sini reaksiyon tüpüne ekleyin ve girdap yaparak numuneyi karıştırın. Negatif kontrol için RNA malzemeleri yerine distile su kullanın.</li>
	<li>Reaksiyonu 65 °C'de 60 dk, ardından reaksiyonu sona erdirmek için 10 dk için 80 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, kolorimetrik değişiklikleri çıplak gözle görsel olarak gözlemleyin. Olumlu bir sonuç floresan yeşil renk olarak görünür.</li>
</ol>5. Agarose jel elektroforez
<ol><li>1x TAE tamponunun 40 mL'inde 0,6 g agarose tozu askıya alarak %1,5 w/v agarose jel hazırlayın. Agarose tamamen çözülene kadar 3-5 dakika mikrodalga da ısıtarak karışımı eritin ve karıştırmak için girdap.</li>
	<li>Sıcaklık 65 °C'ye ulaşana kadar agarose'un soğumasını bekleyin. Bir jel tepsiüzerine agarose çözeltisi 40 mL dökün ve jel kalıbına bir tarak ekleyin.</li>
	<li>Agarose jel tamamen katılaşmış kadar 20-30 dakika oda sıcaklığında ayarlamak için izin verin. Sonra tarak çıkarın ve jel tankına yerleştirin.</li>
	<li>Jel tankıjel yüzeyini kapsayacak şekilde çalışan bir tampon ekleyin.</li>
	<li>Her kuyuya 10 μL RT-LAMP numunesi ve 2 μL 6x jel yükleme tamponu ekleyin. Referans şeridine 5 μL 1 kb DNA merdiveni ekleyin.</li>
	<li>Katota bağlı kapağı ve güç kaynağına bağlı anod'u takın. Güç kaynağını açın, sabit 100 V'e ayarlayın ve 40 dakika çalıştırın.</li>
	<li>Jel ayrımını tamamladıktan sonra jel tepsisinden çıkarın. Daha sonra 7 dk için 10 mg/mL konsantrasyonda ethidium bromür (EtBr) kullanarak süzülmüş jelleke ve 5 dakika distile suda restain. DİkKAT: EtBr toksiktir ve karsinojen olarak kabul edilir; bu nedenle, bu aracıyı kullanırken dikkatli olun.</li>
	<li>Bantların göründüğü bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak jeli UV ışığına maruz bırakın ve jelin fotoğrafını çekin.</li>
</ol>6. Tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi
<ol><li>Reaksiyon başına 2 μL 5x RT tamponu, 0,5 μL astar karışımı, 0,5 μL RT enzimi ve reaksiyon başına 2 μL çekirdeksiz su içeren bir cDNA sentezi ana karışımı hazırlayın. NOT: Pipetleme sırasında ki potansiyel kayıp nedeniyle reaksiyonun 1x'inden oluşan fazla ana karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Ana karışımın 5 μL'sini steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe dağıtın.</li>
	<li>Reaksiyon tüpüne seyreltilmiş çıkarılan RNA'nın (adım 2.8'den elde edilen) 100 ng'sini ekleyin, tüm karışımı geminin dibine taşımak için karıştırın ve aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Reaksiyonları 42 °C'de 60 dakika, ardından pcr makinede 5 dk için 98 °C'de kuluçkaya yatırın. CDNA'yı kullanıma kadar −20 °C'de saklayın.</li>
</ol>7. RT-qPCR
<ol><li>0,3 μL 10 μM ters astar, 0,3 μL 10 μM ileri astar, 5 μL 2x SYBR Yeşil DNA polimeraz ve reaksiyon başına 0,4 μL nükleaz içermeyen su içeren bir TiLV qPCR ana karışımı hazırlayın. Aşağıdaki astarları ve denetimleri kullanın: İleri astar (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATGGATT-3' Ters astar (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3'</li>
	<li>TiLV qPCR ana karışımının 6 μL'sini kullanılan gerçek zamanlı termal döngüile uyumlu qPCR şeridinin her kuyuya dağıtın.</li>
	<li>CDNA şablonunun 4 μL'sini, negatif kontrolü (nükleaziçermeyen su), pozitif kontrol (10 pg/μL) ve pTiLV (plazmid)10 veya seri olarak seyreltilmiş TiLV plazmidini kuyuya ekleyin ve her numuneyi hareket ettirerek karıştırın. Her örneği triplicate olarak iletin.</li>
	<li>QPCR reaksiyonlarını programlanmış gerçek zamanlı termal döngüye yerleştirin. 3 dakika boyunca 95 °C'de kuluçka yı yapmak için qPCR programını ayarlayın, ardından 10 s için 95 °C'lik 40 devir ve 30 s için 60 °C'lik 40 döngü, sıcaklığın 0,5 °C/5 s artık larla 65 °C'den 95 °C'ye yükselmesi gereken erime eğrisi adımından önce 30 s'ye ayarlayın.</li>
	<li>Amplifikasyon ve erime eğrilerini değerlendirerek veri analizini yapın ve seri olarak seyreltilmiş plazmidleri kullanarak verilerden elde edilen standart eğriyi kullanarak TiLV kopyalarının sayısını hesaplayın.</li>
</ol>

<ol><li>Surachetpong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+Tilapia+Lake+Virus+Infection%2C+Thailand%2C+2015-2016%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).</li>
<li>Eyngor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+RNA+virus+lethal+to+tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).</li>
<li>Adams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+to+taxonomy+and+the+International+Code+of+Virus+Classification+and+Nomenclature+ratified+by+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses+%282017%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017).</a> Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).</li>
<li>Bacharach, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Novel+Orthomyxo-like+Virus+Causing+Mass+Die-Offs+of+Tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia.</a> MBio. 7 (2), 00431(2016).</li>
<li>Jaemwimol, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+important+warm+water+fish+species+to+tilapia+lake+virus+%28TiLV%29+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection.</a> Aquaculture. 497, 462-468 (2018).</li>
<li>Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGiews%2C+F+%22Food+and+Agriculture+Organization+of+the+United+Nations%22">Food and Agriculture Organization of the United Nations</a>. , Rome, Italy. (2017).</li>
<li>Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Genome+Sequence+of+a+Tilapia+Lake+Virus+Isolate+Obtained+from+Nile+Tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus).</a> Genome Announcements. 6 (26), (2018).</li>
<li>Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+risk+of+tilapia+lake+virus+transmission+via+frozen+tilapia+fillets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets.</a> Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).</li>
<li>Fathi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Tilapia+Lake+Virus+in+Egypt+in+Nile+tilapia+affected+by+%27summer+mortality%27+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome.</a> Aquaculture. 473, 430-432 (2017).</li>
<li>Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+reverse+transcription+quantitative+polymerase+chain+reaction+for+tilapia+lake+virus+detection+in+clinical+samples+and+experimentally+challenged+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish.</a> Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).</li>
<li>Waiyamitra, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TaqMan+RT-qPCR+assay+for+tilapia+lake+virus+%28TiLV%29+detection+in+tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia.</a> Aquaculture. 497, 184-188 (2018).</li>
<li>Kembou Tsofack, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Tilapia+Lake+Virus+in+Clinical+Samples+by+Culturing+and+Nested+Reverse+Transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).</li>
<li>Dong, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+tilapia+lake+virus+in+Thailand+and+an+alternative+semi-nested+RT-PCR+for+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection.</a> Aquaculture. 476, 111-118 (2017).</li>
<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).</li>
<li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+a+rapid%2C+accurate%2C+and+cost-effective+diagnostic+method+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).</li>
<li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).</li>
<li>Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+a+fish+iridovirus+using+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP).</a> Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).</li>
<li>Soliman, H., El-Matbouli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inexpensive+and+rapid+diagnostic+method+of+Koi+Herpesvirus+%28KHV%29+infection+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification.</a> Virology Journal. 2, 83(2005).</li>
<li>Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+koi+herpesvirus+in+common+carp%2C+Cyprinus+carpio+L.%2C+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).</li>
<li>Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loop+mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+method+for+detection+of+infectious+hematopoietic+necrosis+virus+%28IHNV%29+in+rainbow+trout+%28Oncorhynchus+mykiss%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).</a> Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).</li>
<li>Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+white+spot+syndrome+virus+in+shrimp+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).</li>
<li>Soliman, H., El-Matbouli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29+for+rapid+detection+of+viral+hemorrhagic+septicaemia+virus+%28VHS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS).</a> Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).</li>
<li>Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+rapid+detection+of+channel+catfish+Ictalurus+punctatus+important+bacterial+pathogen+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri.</a> Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).</li>
<li>Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+rapid+detection+of+Flavobacterium+columnare+in+channel+catfish+Ictalurus+punctatus+by+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method.</a> Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).</li>
<li>Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+rapid+detection+of+infectious+hypodermal+and+hematopoietic+necrosis+virus+%28IHHNV%29+in+shrimps+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).</li>
<li>Shivappa, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+spring+viraemia+of+carp+virus+%28SVCV%29+by+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+in+koi+carp%2C+Cyprinus+carpio+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L.</a> Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).</li>
<li>Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+rapid+detection+of+Aeromonas+caviae+in+stool+samples+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).</li>
<li>Chinabut, S., Puttinaowarat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choice+of+disease+control+strategies+to+secure+international+market+access+for+aquaculture+products%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products.</a> Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).</li>
<li>Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+Tilapia+Lake+Virus+to+buffered+Povidone-iodine+complex+and+chlorine%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine.</a> Aquaculture. 512, 734342(2019).</li>
<li>Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virucidal+effects+of+common+disinfectants+against+tilapia+lake+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus.</a> Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).</li>
<li>Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tilapia+lake+virus%3A+a+threat+to+the+global+tilapia+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry.</a> Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+rapid+reverse+transcription-loopmediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29+assay+for+sensitive+detection+of+tilapia+lake+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus.</a> Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).</li>
<li>Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification%3A+an+emerging+technology+for+detection+of+fish+and+shellfish+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens.</a> Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).</li>
<li>Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+tilapia+lake+virus+using+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay.</a> Aquaculture. 507, 35-39 (2019).</li>
<li>Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+sampling+for+Tilapia+Lake+Virus+detection+by+RT-qPCR+and+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture.</a> Aquaculture. 486, 75-80 (2018).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+rapid+reverse+transcription-loopmediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29+assay+for+sensitive+detection+of+tilapia+lake+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus.</a> Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).</li>
<li>Khan, R. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+infectious+bursal+disease+by+loop-mediated+isothermal+amplification+for+field+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis.</a> Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).</li>
<li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.</a> Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li>
<li>Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+amplicon+length+on+real-time+PCR+results%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%2C+Agronomy%2C+Society+and+Environment%22%5BJournal%5D)">The influence of amplicon length on real-time PCR results.</a> Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kültür balıkçılığı endüstrisi sürekli önemli ekonomikkayıplaraneden viral enfeksiyonlar tarafından tehdit edilir9,23,28. Örneğin, ortaya çıkan TiLV dünyanın birçok yerinde tilapia üreten ülkeler için büyük bir tehdit oluşturmaktadır1,6,9. Şimdiye kadar, TiLVD önlemek için özel bir tedavi mevcut olmuştur. Bir aşının geliştirilmesi devam ...

Tilapia lake virus disease (TiLVD) tilapia viral bir hastalıktır(Oreochromis spp.) bildirildiğine göre Asya1dahil olmak üzere dünyanın birçok bölgesinde tilapia ölümlerine nedenolan,Dahil Asya 1 ,2,Afrika, ve Amerika. Hastalık ilk olarak 2009 yılında İsrail'de tilapia'nın kitlesel mortalitesi sırasında tanındı ve Kinneret Gölü'ndeki yabani tilapia sayısıyılda257'den 8 tona düştü. Hastalık tilapia göl virüsü neden olur (TiLV), hangi aile Amnoonviridae yeni bir cins Tilapinevirus ve yeni bir tür Tilapia tilapinevirusolarak atanmıştır3. TiLV genetik karakterizasyonu virüs 10 proteinler1,2,,4kodlama 10 segmentleri olan yeni bir zarflı, negatif-sense, tek iplikli RNA virüsü olduğunu gösterdi. Sarotherodoncinsi tilapia çeşitli türler , Oreochromis, ve Tilapine ve diğer sıcak su balıkları (örneğin, dev gourami(Osphronemus goramy)) TiLV duyarlı olduğu gösterilmiştir2,5. Şu anda, bu virüs küresel yayılmaya devam ediyor, muhtemelen enfekte canlı balık hareketi ile6,7, dondurulmuş tilapia veya ürün yoluyla viral iletim riski sınırlı iken8. TiLV enfeksiyonuna bağlı önemli mortalite, tilapia endüstrisi üzerinde önemli ölçüde zararlı bir ekonomik etkiye sahip olabilir. Örneğin, Mısır'da TiLV enfeksiyonu ile ilişkili yaz mortalite sendromunun ekonomik etkisi 100milyon9 ABD Doları olarak hesaplanmıştır. Bu nedenle balık çiftliklerinde bu hastalığın kontrolünü kolaylaştırmak için hızlı ve uygun bir tanı yöntemi geliştirmek önemlidir.
Şimdiye kadar TiLVD tanısı moleküler tahliller, viral izolasyon ve histopatolojiye dayanıyordu. TiLV tanısı için farklı PCR protokolleri ve astarları geliştirilmiştir10,11. Örneğin, bir SYBR yeşil tabanlı ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) yöntemi gibi az iki kopya / μL virüsün algılama duyarlılığı ile geliştirilmişve TiLV algılama için doğrulanmıştır10. TiLV tespiti için diğer PCR yöntemleri TaqMan kantitatif PCR11, RT-PCR2, iç içe RT-PCR12, ve yarı iç içe RT-PCR13içerir. Ancak, bu yöntemler, reaksiyonların karmaşıklığı nedeniyle sonuç vermek için gelişmiş laboratuvar ekipmanı ve nispeten uzun süreler gerektirir, bu da onları saha uygulaması için uygun hale getirir.
Döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) testi hızlı, basit ve pratik alan uygulaması14,15. Teknik bir iplikçik yer değiştirme reaksiyonu prensibini kullanır, amplifikasyon reaksiyonu gelişmiş ve pahalı termal döngücü14olmadan izotermal koşullar altında çalışır iken,15. Sonuç olarak, güçlendirilmiş LAMP ürünleri veya RT-LAMP ürünleri, DNA veya RNA14'ün güvenli görüntülenmesi için floresan leke li agarose jel elektroforezi kullanılarak merdiven benzeri bantlarda veya bulanıklık veya beyaz çökelti 16,17,18varlığı için çıplak gözle gözlem de analiz edilir.18 Bu nedenlerden dolayı, bu teknik farklı balık patojenlerinin yerinde tespiti için kullanılmıştır17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Bu çalışmanın amacı TiLV tespiti için hızlı, hassas ve doğru bir RT-LAMP testi oluşturmaktır. RT-LAMP tne30 dakika içinde balık örneklerinde TiLV için tarama sunuyor. TiLVD tanı ve gözetimi için teknik uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Doku toplama: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Karanfil yağı</td><td>Better Pharma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trikain metansülfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Karanfil yağı</td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyonuna</td> alternatif bir seçenek: <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asit guanidinyum-fenol bazlı reaktif (TRIzol reaktifi)</td><td>ThermoFisher Scientific Corp.</td><td></td><td></td>15596026</tr><tr><td>Asit guanidinyum-fenol bazlı reaktif (GENEzol reaktifi)</td><td>Geneaid</td><td>GZR100</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Kiti:</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>- Direct-zol RNA Ön Yıkama</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- RNA Yıkama Tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- DNase/RNaz içermeyen su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Zymo-spin IIICG sütunları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Toplama Tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>RT-LAMP: < / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x SD II reaksiyon tamponu</td><td>Biyoteknolojitavşan</td><td>BR1101301</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (MgSO<alt>4</alt>)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>dNTP seti</td><td>Bioline</td><td>BIO-39053</td><td></td></tr><tr><td>Betain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2629</td><td></td></tr><tr><td>Kalcein karışımı</td><td>Merck</td><td>1461-15-0</td><td></td></tr><tr><td>Bst DNA polimeraz</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1101301</td><td></td></tr><tr><td>AMV ters transkriptaz</td><td>Promega</td><td>M510A</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>İnvitrogen</td><td>10320995</td><td></td></tr><tr><td>Elite kuru banyo inkübatörü, tek ünite</td><td>Büyük Bilim</td><td>EL-01-220</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Jel elektroforezi: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Agarose Vivantis Technologies</td><td>PC0701-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-borat-EDTA (TBE) tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0062</td><td></td></tr><tr><td>Tris-asetik-EDTA (TAE) tamponu:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- Tris</td><td>Vivantis Teknolojileri</td><td>PR0612-1KG</td><td></td></tr><tr><td>- Asetik asit (buzul), EMSURE</td><td>Merck Millipore</td><td>1000632500</td><td></td></tr><tr><td>- Disodyum Etilendiamintetraasetat dihidrat (EDTA), Vetec</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V800170-500G</td><td></td></tr><tr><td>Neogreen</td><td>NeoScience Co., Ltd.</td><td>GR107</td><td></td></tr><tr><td>DNA jel yükleme boyası (6X)</td><td>ThermoFisher Scientific Corp.</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNA merdiveni ve işaretleyicileri</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PC701-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mini Hazır Alt Hücre GT (Yatay elektroforez sistemi)</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487</td> PowerPac HC güç kaynağı Bio-Rad 1645052 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel Doc EZ Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>UV numune tepsisi</td><td>Bio-Rad</td><td>1708271</td><td></td></tr><tr><td>N & alfa; BI görüntüleyici</td><td>Neojen Bilimi</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>cDNA sentezi:</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Kiti</td><td>Toyobo</td><td>FSQ-101</td><td></td></tr><tr><td>Viva cDNA Sentez Kiti</td><td>Vivantis Technologies</td><td>cDSK01 cDNA</td><td>sentezi için alternatif bir seçenek</td></tr><tr><td>NanoDrop2000 (mikrohacim spektrofotometresi)</td><td>ThermoFisher Scientific Corp.</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>RT-qPCR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725120</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su, steril su</td><td>MultiCell</td><td>809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>8 tüplü PCR şeritleri, beyaz</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0851</td><td></td></tr><tr><td>Düz PCR tüpü 8 kapaklı şeritler, optik</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Dokunmatik Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Genel ekipman ve malzemeler:</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mayo makas</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td></td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 (girdap karıştırıcı)</td><td>Bilimsel Endüstriler Mikrosantrifüj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM-60</td><td>LioFuge</td><td>CM610</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE mini mikrosantrifüj</td><td>Corning</td><td>6765</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Rainin</td><td>Pipete-Lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>QSP filtreli pipet uçları</td><td>Kalite Bilimsel Plastikler</td><td>TF serisi</td><td></td></tr><tr><td>Corning Isotip filtreli uçlar</td><td>Merck</td><td>CLS serisi</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri, NEST</td><td>Wuxi NEST Biyoteknoloji</td><td>615601</td><td></td></tr></tbody></table>

tilapia lake virüs Ünün Özel ve hızlı tespiti İçin ters transkripsiyon döngü aracılı İzomal amplifikasyon (rt-lamp) testi

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus (TiLV) tarafından ortaya çıkan tilapia viral hastalığı olan Tilapia lake virus hastalığı (TiLVD), dünyanın birçok yerinde tilapia'nın kitlesel morbidite ve mortalitelerine yol açan kültür balıkçılığı endüstrisinde kalıcı bir sorundur. Bu nedenle tilv enfeksiyonu için etkili, hızlı ve doğru bir tanı testi ilk enfeksiyonu tespit etmek ve kültür balıkçılığı tarımında hastalığın yayılmasını önlemek için gereklidir. Bu çalışmada balık dokusunda tilapia göl virüsünü saptamak için son derece hassas ve pratik ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) yöntemi sunulmuştur. Enfekte örneklerin RT-qPCR ve RT-LAMP testlerinin karşılaştırılmasında 63 (%100) pozitif sonuç saptandı. ve 51 (%80,95) örnekleri, sırasıyla. Ayrıca, enfekte edilmemiş örneklerin analizi, 63 enfekte olmayan mendilin hem RT-qPCR hem de RT-LAMP tahlilleri için olumsuz sonuçlar verdiğini göstermiştir. Tilapia beş patojenile çapraz reaktivite RT-LAMP kullanılarak değerlendirildi ve tüm testler de negatif sonuçlar gösterdi. Enfekte balıklardan alınan karaciğer ve mukus örnekleri RT-LAMP yöntemi kullanılarak karşılaştırılabilir sonuçlar göstererek, mukusların rt-LAMP'de balık öldürmemek için öldürücü olmayan bir tahkikat olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Sonuç olarak, sunulan RT-LAMP tahsinin tilapia dokusunda TiLV tespiti için etkili bir yöntem sağladığını göstermiştir. Bu nedenle bu yöntem, TiLV'nin hızlı tanısı için çiftliklerde bir tarama aracı olarak önerilir.

Bu çalışmada tilapia'da TiLV enfeksiyonunu saptamak için rt-LAMP teşbelli geliştirilmiştir. Test edilen numuneler 2015-2016 yılları arasında Tayland'ın farklı bölgelerinde bulunan 14 çiftlikten toplanmıştır. Enfekte ve enfekte olmayan balıklar öncelikle fiziksel tanılara ve semptomatik TiLVD'nin görünüşüne göre gruplandı. TiLV enfeksiyonu daha sonra toplama işleminden sonra RT-PCR kullanılarak doğrulandı. Agarose jel elektroforezi ve Parlak yeşil rengin saptanması LAMP amfikonslarının değerlendirme yöntemleri olarak seçi...

Geleneksel RT-PCR tekniklerine göre nispeten kısa bir süre boyunca basit aletler kullanarak tilapia balıklarında TiLV tespiti için bir RT-LAMP tayini salıyoruz. Bu protokol, özellikle gelişmekte olan ülkelerde TiLVD'nin salgınının kontrol altına alabiliyor.

Tilapia Lake Virüs Ünün Özel ve Hızlı Tespiti İçin Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzomal Amplifikasyon (RT-LAMP) Testi

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

Tilapia gölü virüsü, tilapia ve melez türlerinde yüksek mortaliteye neden olan yeni ortaya çıkan bir virüs ve bulaşıcı patojendir. Tilapia birçok gelişmekte olan ülkeler için ana protein kaynağı olduğu gibi, yeni virüs enfeksiyonu tilapia kültür balıkçılığı için büyük bir etkisi vardır, ve aynı zamanda dünya gıda güvenliğini tehdit ediyor. Balık dokusunda virüsü tespit etmek için hızlı, doğru ve hassas bir yöntem geliştirilmesi, hastalığın kontrolüne yardımcı olacak ve virüsün etkisini azaltacaktır.Bu videoda, balık örneklerinde tilapia göl virüsünün hızlı bir şekilde saptanması için ters transkripsiyon döngü aracılı izomal amplifikasyon veya RT-LAMP testi göstereceğiz. İkinci bölüm, RNA çıkarma. İlk olarak, steril 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine karaciğer dokusunun 3250 miligram ekleyin, içeren 600 için 1000 mikrolitre asit guanidinium-fenol baz reaktif, ve homojen kadar kıyma.Santrifüj 10, 000 RCF 30 saniye için, ve yeni bir tüp içine supernatant aktarın. Tüpe %95 eşit hacim ekleyin ve iyice karıştırın. Çözeltiyi bir toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa aktarın, ardından 10,000 RCF'de 30 saniye santrifüj edin.Akışı atın ve sütunu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Sütuna 400 mikrolitre RNA PreWash ekleyin ve 10,000 RCF'de 30 saniye santrifüj yapın. Akış tan atın ve bu adımı yineleyin.Sütuna 700 mikrolitrelik RNA Yıkama Tamponu ekleyin ve 10,000 RCF'de iki dakika santrifüj edin. Daha sonra, steril bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine sütun aktarın. Son olarak, 100 mikrolitre, nükleaz içermeyen su ve santrifüj ile sütun matrisiçine elute RNA 30 saniye boyunca 10,000 RCF.Üçüncü bölüm, astar tasarımı. PrimerExplorer Sürüm 4 verimli LAMP tasarımı için en yaygın biyoinformatik aracıdır, veya RT-LAMP astarlar, hangi yazılım için iyi kılavuzları kendi web sitesinde mevcuttur. Burada, dört özel astar, iki iç ve iki dış astar oluşan, TiLV segment 3 altı farklı bölgeleri tanımak için tasarlanmıştır, Tayland kökenli.Bağlantının videoda gösterildiği web sitesine girdikten sonra PrimerExplorer V4'e tıklayın. TiLV'nin 3. Oluştur düğmesine tıkladıktan sonra yazılım işlenir ve sonuçlar gösterecektir. LAMP amplifikasyon dizileri optimize edildikten sonra, toplamda, bir çift dış astar ve iki çift iç astar, TiLV enfeksiyonunu saptamak için bu çalışma için seçildi.Bu astar kümesi burada gösterilmiştir. Dördüncü bölüm, RT-LAMP'nin gösterimi. Tilapia göl virüsüne özgü RT-LAMP ana karışımı aşağıdaki kimyasallardan oluşmaktadır.Tabloda gösterilen kimyasalları kullanarak bir ana karışım hazırlayın. Steril 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine ana karışımı 22 mikrolitre dağıtın. Daha sonra, reaksiyon tüpüne üç mikrolitre RNA şablonu ekleyin.Negatif kontrol için RNA malzemeleri yerine distile su kullanın ve iyice karıştırın. Reaksiyonları 65 derecede 60 dakika, ardından 10 dakika boyunca 80 santigrat derece yedirin. 30 dakika kuluçkadan sonra kalorimetrik değişiklikler çıplak gözle görülür.Uygun olduğu durumlarda, 100 Voltluk bir sabitle çalışan jel elektroforezini %1,5 agarose jel üzerinde 40 dakika boyunca gerçekleştirerek RT-LAMP tahsin sonuçlarını doğrulayabiliriz, bu şekilde bir kilobaz çifti moleküler boyutlu DNA Merdiveni parça boyutunu belirlemek için bir belirteç olarak yüklenir. Bölüm beş, temsili sonuçlar ve yorumlama. 30 dakika kuluçkadan sonra, balık dokularında TiLV'nin pozitif amplifikasyonunu öneren tahıl floresan reaksiyonu, uv ışığı altındaki enfekte örneklerde 365 nanometre dalga boyunda, negatif kontroldekilerin ise net ve biraz renksiz bir çözeltiye sahip olduğu açık bir şekilde gözlenmiştir.Buna karşılık, RT-LAMP ürünlerinin amplifikasyonu agarose jel elektroforezinde doğrulandı, ters DNA tekrarlarının çoklu amplifikasyonlarının çeşitli boyutlarını gösteren, TiLV enfekte numunelerde UV lambası altında kök-döngü yapıları oluşturan, negatif kontrol kuyularında ise hiçbir bant görüntülenmedi, sonuçlar RT-LAMP testine uygun olarak yapıldı. Tilapia gölü virüsünün yayılmasını azaltmak için, etkili bir tanı yöntemi kullanarak bu enfekte balıkların hemen taranması önemli anahtarlardan biridir. Yani, yeni geliştirilen RT-LAMP testi biyogüvenlik önlemi sürecinde uygulanacak hızlı ve hassas bir tanı aracı sunmalıdır.Teşp laboratuvarda veya yerinde tesislerde kullanılabilir. Bu yöntemin, tilapia gölü virüsünün yayılmasının azalmasına yol açabilecek enfekte balık popülasyonunun taranması için uygulanacağını umuyoruz.

reverse-transcription-loop-mediated-isothermal-amplification-rt-lamp

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Domesle, K. J. ve diğerleri. Hayvansal Gıda Salmonella'yı Taramak ve Kültür İzolasyonundan Salmonella'yı Doğrulamak için Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon.  J. Vis. Exp. (2020).Bu video, hedef bakteri genini sabit sıcaklıkta amplifikasyonla tespit etmek için döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) tekniğini göstermektedir. Reaksiyon karışımı, izotermal ana karışım, hedef gen için özel primerler ve DNA şablonları içeren örnekler eklenerek hazırlanır. Amplifikasyon bir LAMP...

Bakteriyel Gen Tespiti İçin Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon

Bu video, gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak viral enfeksiyonu tespit etmek için nicel bir yöntemi göstermektedir. Ters transkripsiyon adımı, RNA'yı cDNA'ya dönüştürür ve bu daha sonra PCR döngüleri yoluyla amplifiye edilir. Numunede viral RNA'nın varlığı, PCR'den elde edilen DNA'nın amplifikasyon ve ayrışma eğrileri analiz edilerek doğrulanır.

Viral enfeksiyonları teşhis etmek için gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Bu iletişim kuralı Zika virüs tespit veya hedefleri insan serum ve idrar örnekleri veya sivrisinekler Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon tarafından (RT-lamba) denetlemek için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Bu yöntem does değil istemek RNA izolasyon ve 30 dk içinde yapılabilir.

İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters

Bu iletişim kuralı Tilapia Gölü virüs (TiLV) RT-PCR yöntemlerini kullanarak tilapia dokularda tanılar. Tüm yöntemi doku diseksiyon toplam RNA emme, ardından cDNA sentezi ve TiLV geleneksel PCR veya kantitatif PCR dsDNA bir floresan bağlama boya bağlama kullanarak tarafından algılanması için tanımlanır.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

DsDNA enterkalasyon boya kullanarak bu gerçek zamanlı RT-PCR Lissavirüse enfeksiyonları teşhis etmek için uygundur. Yöntem, kuduz şüpheli ante-mortem veya post-mortem örneklerinden çıkarılan RNA ile başlar, ana karışım hazırlama, RNA ilavesi, gerçek zamanlı makinenin kurulumu ve sonuçların doğru yorumlanması hakkında ayrıntı.

Pan-Lyssavirus gerçek zamanlı RT-PCR Rabies tanı için

Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromattografik tanı testi (RIDT) ile alan koşullarında hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tam bir protokol salıyoruz. Ayrıca moleküler analiz ve viral genotipleme için cihazı kullanarak daha fazla uygulama açıklar.

Field Postmortem Kuduz Hızlı İmmünromatografik Tanı Testi Kaynak Sınırlı Ayarlar için Diğer Moleküler Uygulamalar ile

Burada, ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) ile insan örneklerinde SARS-CoV-2 virüsünü tespit etme yöntemini standartlaştırmak ve uygulamak için eksiksiz bir protokol sunuyoruz. 60 dakika içinde yapılan bu yöntem, düşük maliyetle ve ucuz ekipman kullanılarak herhangi bir laboratuvara veya bakım noktasına uyarlanabilir.

SARS-CoV-2 Virüsünü Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon ile Tespit Etme

Yaygın solunum yolu virüsleri için iki prob tabanlı kurum içi tek adımlı RT-qPCR kiti sunuyoruz. İlk test SARS-CoV-2 (N), İnfluenza A (H1N1 ve H3N2) ve İnfluenza B içindir. İkincisi SARS-Cov-2 (N) ve MERS (UpE ve ORF1a) içindir. Bu testler herhangi bir özel laboratuvarda başarıyla uygulanabilir.

SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV'nin Tespiti için Multipleks Gerçek Zamanlı RT-qPCR Testlerinin Geliştirilmesi

Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım,...

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

Öğrenin, Tilapia göl virüsünü balık dokularında hızlı ve hassas bir şekilde tespit etmek için RT-LAMP yöntemini kullanmayı. Bu teknik, geleneksel RT-PCR'e göre daha basit ve hızlıdır.

Tilapia Lake Virüs Ünün Özel ve Hızlı Tespiti İçin Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzomal Amplifikasyon (RT-LAMP) Testi

Daha fazla video keşfet