Tilapia Lake Virüs Ünün Özel ve Hızlı Tespiti İçin Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzomal Amplifikasyon (RT-LAMP) Testi
18 Mayıs 2020
Geleneksel RT-PCR tekniklerine göre nispeten kısa bir süre boyunca basit aletler kullanarak tilapia balıklarında TiLV tespiti için bir RT-LAMP tayini salıyoruz. Bu protokol, özellikle gelişmekte olan ülkelerde TiLVD'nin salgınının kontrol altına alabiliyor.
Tilapia gölü virüsü, tilapia ve melez türlerinde yüksek mortaliteye neden olan yeni ortaya çıkan bir virüs ve bulaşıcı patojendir. Tilapia birçok gelişmekte olan ülkeler için ana protein kaynağı olduğu gibi, yeni virüs enfeksiyonu tilapia kültür balıkçılığı için büyük bir etkisi vardır, ve aynı zamanda dünya gıda güvenliğini tehdit ediyor. Balık dokusunda virüsü tespit etmek için hızlı, doğru ve hassas bir yöntem geliştirilmesi, hastalığın kontrolüne yardımcı olacak ve virüsün etkisini azaltacaktır.
Bu videoda, balık örneklerinde tilapia göl virüsünün hızlı bir şekilde saptanması için ters transkripsiyon döngü aracılı izomal amplifikasyon veya RT-LAMP testi göstereceğiz. İkinci bölüm, RNA çıkarma. İlk olarak, steril 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine karaciğer dokusunun 3250 miligram ekleyin, içeren 600 için 1000 mikrolitre asit guanidinium-fenol baz reaktif, ve homojen kadar kıyma.
Santrifüj 10, 000 RCF 30 saniye için, ve yeni bir tüp içine supernatant aktarın. Tüpe %95 eşit hacim ekleyin ve iyice karıştırın. Çözeltiyi bir toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa aktarın, ardından 10,000 RCF'de 30 saniye santrifüj edin.
Akışı atın ve sütunu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Sütuna 400 mikrolitre RNA PreWash ekleyin ve 10,000 RCF'de 30 saniye santrifüj yapın. Akış tan atın ve bu adımı yineleyin.
Sütuna 700 mikrolitrelik RNA Yıkama Tamponu ekleyin ve 10,000 RCF'de iki dakika santrifüj edin. Daha sonra, steril bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine sütun aktarın. Son olarak, 100 mikrolitre, nükleaz içermeyen su ve santrifüj ile sütun matrisiçine elute RNA 30 saniye boyunca 10,000 RCF.
Üçüncü bölüm, astar tasarımı. PrimerExplorer Sürüm 4 verimli LAMP tasarımı için en yaygın biyoinformatik aracıdır, veya RT-LAMP astarlar, hangi yazılım için iyi kılavuzları kendi web sitesinde mevcuttur. Burada, dört özel astar, iki iç ve iki dış astar oluşan, TiLV segment 3 altı farklı bölgeleri tanımak için tasarlanmıştır, Tayland kökenli.
Bağlantının videoda gösterildiği web sitesine girdikten sonra PrimerExplorer V4'e tıklayın. TiLV'nin 3. Oluştur düğmesine tıkladıktan sonra yazılım işlenir ve sonuçlar gösterecektir. LAMP amplifikasyon dizileri optimize edildikten sonra, toplamda, bir çift dış astar ve iki çift iç astar, TiLV enfeksiyonunu saptamak için bu çalışma için seçildi.
Bu astar kümesi burada gösterilmiştir. Dördüncü bölüm, RT-LAMP'nin gösterimi. Tilapia göl virüsüne özgü RT-LAMP ana karışımı aşağıdaki kimyasallardan oluşmaktadır.
Tabloda gösterilen kimyasalları kullanarak bir ana karışım hazırlayın. Steril 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine ana karışımı 22 mikrolitre dağıtın. Daha sonra, reaksiyon tüpüne üç mikrolitre RNA şablonu ekleyin.
Negatif kontrol için RNA malzemeleri yerine distile su kullanın ve iyice karıştırın. Reaksiyonları 65 derecede 60 dakika, ardından 10 dakika boyunca 80 santigrat derece yedirin. 30 dakika kuluçkadan sonra kalorimetrik değişiklikler çıplak gözle görülür.
Uygun olduğu durumlarda, 100 Voltluk bir sabitle çalışan jel elektroforezini %1,5 agarose jel üzerinde 40 dakika boyunca gerçekleştirerek RT-LAMP tahsin sonuçlarını doğrulayabiliriz, bu şekilde bir kilobaz çifti moleküler boyutlu DNA Merdiveni parça boyutunu belirlemek için bir belirteç olarak yüklenir. Bölüm beş, temsili sonuçlar ve yorumlama. 30 dakika kuluçkadan sonra, balık dokularında TiLV'nin pozitif amplifikasyonunu öneren tahıl floresan reaksiyonu, uv ışığı altındaki enfekte örneklerde 365 nanometre dalga boyunda, negatif kontroldekilerin ise net ve biraz renksiz bir çözeltiye sahip olduğu açık bir şekilde gözlenmiştir.
Buna karşılık, RT-LAMP ürünlerinin amplifikasyonu agarose jel elektroforezinde doğrulandı, ters DNA tekrarlarının çoklu amplifikasyonlarının çeşitli boyutlarını gösteren, TiLV enfekte numunelerde UV lambası altında kök-döngü yapıları oluşturan, negatif kontrol kuyularında ise hiçbir bant görüntülenmedi, sonuçlar RT-LAMP testine uygun olarak yapıldı. Tilapia gölü virüsünün yayılmasını azaltmak için, etkili bir tanı yöntemi kullanarak bu enfekte balıkların hemen taranması önemli anahtarlardan biridir. Yani, yeni geliştirilen RT-LAMP testi biyogüvenlik önlemi sürecinde uygulanacak hızlı ve hassas bir tanı aracı sunmalıdır.
Teşp laboratuvarda veya yerinde tesislerde kullanılabilir. Bu yöntemin, tilapia gölü virüsünün yayılmasının azalmasına yol açabilecek enfekte balık popülasyonunun taranması için uygulanacağını umuyoruz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, tilapia balıklarında Tilapia göl virüsünün (TiLV) tespit edilmesi için geleneksel RT-PCR yöntemlerine daha hızlı bir alternatif sunan hızlı bir RT-LAMP testi sunmaktadır. Protokol, özellikle tilapianın hayati bir protein kaynağı olduğu gelişmekte olan ülkelerde TiLV'nin yayılmasının kontrol altına alınmasına yardımcı olmayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Viroloji
- Su ürünleri yetiştiriciliği
- Patojen tespiti
Arka Plan
- Tilapia gölü virüsü, tilapyalarda yüksek ölüme neden olan bulaşıcı bir patojendir.
- Virüs, tilapya su ürünleri yetiştiriciliği ve küresel gıda güvenliği için önemli bir tehdit oluşturmaktadır.
- Mevcut tespit yöntemleri genellikle zaman alıcı ve karmaşıktır.
- Etkili hastalık kontrolü için hızlı bir tespit yöntemi gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Balık dokularında TiLV tespitine yönelik hızlı ve hassas bir yöntem geliştirmek.
- TiLV'nin tilapia yetiştiriciliği üzerindeki etkisini azaltmak.
- Gelişmekte olan ülkelerde hastalık yönetimi için pratik bir çözüm sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) testi.
- Tilapya karaciğer dokusundan RNA ekstraksiyonu.
- Hızlı testler için basit araçların kullanımı.
- Geleneksel RT-PCR teknikleri ile karşılaştırma.
Temel Sonuçlar
- RT-LAMP analizi, TiLV'nin hızlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar.
- Bu yöntem, geleneksel RT-PCR'dan daha basit ve daha hızlıdır.
- Kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda uygulanabilir.
- Bu protokol, tilapia popülasyonlarında TiLV yayılımının azaltılmasına yardımcı olabilir.
Sonuçlar
- RT-LAMP analizi, TiLV tespiti için gelecek vadeden bir araçtır.
- Su ürünleri yetiştiriciliğinde hastalık kontrol çalışmalarını destekler.
- Gelecekteki çalışmalar, yöntemin çeşitli ortamlardaki uygulamasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Tilapia göl virüsü (TiLV) gibi ortaya çıkan viral patojenlerin hızlı ve spesifik tespiti, su ürünleri üretiminin ve küresel gıda güvenliğinin korunması açısından kritik öneme sahiptir. RT-LAMP testi, balık dokusundaki TiLV enfeksiyonunun zamanında belirlenmesini sağlayarak erken müdahale ve biyogüvenlik önlemlerini destekler. Bu yaklaşım, emek yoğun moleküler yöntemlere olan bağımlılığı azaltır ve kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda ölçeklenebilir taramaları kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: TiLV RNA'sının spesifik tespitini sağlayarak, enfekte konak dokularda viral hedef doğrulamasını destekler.
- Operasyonel Değer: Termal döngü ekipmanı gerektirmeyen, hızlı ve izotermal bir amplifikasyon yöntemi sunar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Viral varlığın hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak 60 dakika içinde görsel veya florometrik okumalar üretir.
- Operasyonel Değer: Minimum düzeyde enstrümantasyon kullanır ve yüksek kapasiteli tarama için saha veya laboratuvar ortamlarında uygulanabilir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Mukus gibi öldürücü olmayan örnek türlerine uygulanabilirliği göstererek viral yükün boylamsal izlenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Denekleri feda etmeden hayvan modellerinde boylamsal çalışmaları destekleyerek deneysel tasarımı iyileştirir ve değişkenliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
RT-LAMP testi, hipotez oluşturma aşamasını takip eden ve terapötik veya profilaktik müdahale çalışmalarından önce gelen, konuşlandırılabilir bir tespit aracı sağlayarak keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Biyolojik örneklerde viral varlığın doğrulanmasını kolaylaştırarak TiLV patogenezinin mekanizmaya dayalı çalışmalarını destekler.
- Tarama: Örnek kohortları genelinde enfeksiyon durumunun hızlıca değerlendirilmesine olanak tanıyarak antiviral bileşik değerlendirmesi için analiz hazırlığını geliştirir.
- Analitikler: Görsel bulanıklık, floresans veya jel elektroforezi aracılığıyla kantitatif veya yarı kantitatif çıktılar sağlayarak karşılaştırmalı analize yardımcı olur.
- Translasyonel Araştırma: İlk tespit aşamasından, ilgili hastalık modellerindeki müdahale stratejilerinin preklinik değerlendirmesine kadar olan sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Akuakültür veya hayvancılık sistemlerindeki diğer gelişmekte olan patojenlere uyarlanabilir modüler bir nükleik asit tespit platformu teşkil eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Viral RNA'nın özgül ve hassas tespiti aracılığıyla hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Ekipman gerektirmeyen, sonuçları çıplak gözle veya basit bir transilüminatör ile okunabilen hasta başı uyumluluğu sunar.
- Stratejik Değer: Enfeksiyon taramasında sonuç alma süresini kısaltarak çalışma ilerlemesinde daha hızlı karar verme imkanı sağlar.
- Portföy Etkisi: Güvenilir enfeksiyon durumu verileri sağlayarak preklinik programlarda risk değerlendirmesini iyileştirir ve karıştırıcı değişkenleri azaltır.
Uygulama Hususları
- LAMP tabanlı analizler için moleküler biyoloji ve primer tasarımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- RNA ekstraksiyon kitlerine, su banyosuna veya ısıtma bloğuna ve görselleştirme araçlarına (örneğin, UV ışığı veya jel elektroforezi) erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için farklı doku türleri (örneğin, karaciğer, mukus) arasında örnek hazırlama protokollerinin standartlaştırılması gerekir.
- Yalancı pozitifleri önlemek için analizin ilgili patojenlere karşı özgüllüğünün doğrulanmasını içerir.
- Optimize edilmiş primer setlerine duyulan ihtiyaç ve kompleks biyolojik matrislerden kaynaklanabilecek potansiyel inhibisyon ile sınırlıdır.
