Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli
1 Mayıs 2020
Bu protokol, in vivo koşullarına benzeyen bir in vitro insan hipertrofik skar dokusu modeli oluşturmak için makromoleküler kalabalık kullanımını açıklar. Kalabalık bir makromoleküler ortamda ekili zaman, insan deri fibroblastlar fenotipleri, biyokimya, fizyoloji ve skar dokusu andıran fonksiyonel özellikleri sergiler.
Makromoleküler kalabalık tekniğini kullanarak hücrelerin in vivo deneyim çevresini taklit etmek için bireysel kollajen açısından zengin bir model oluşturduk. Cilt zaten in vitro hücreleri büyümek için kullandığımız sıvı ortamın aksine, kalabalık bir ortamdır. Geleneksel monolayer hücre kültür sistemi ile karşılaştırıldığında, bu model hücrelerin in vivo deneyim kalabalık moleküler ortamı yeniden oluşturur, özellikle bol hücre dışı matris sıvı su yerinden skar dokularında.
Hipertrofik yaraların yanı sıra, bu makromoleküler kalabalık tekniği pulmoner fibrozis gibi ekstrasellüler matriksbol olduğu çalışmalarda kullanılabilir. El yazması yönlere göre yara ve normal fibroblastlar büyütün. Sonra 50, 000 hücre de orta bir mililitre başına 24 kuyu plakaları içine tohum.
Plakayı bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Ficoll 70, Ficoll 400 ve askorbik asidi %10 FCS DMEM'e karıştırarak makromoleküler kalabalık veya MMC ortamını hazırlayın. Kalabalığı çözeltiye dağıtmak için medyayı su banyosunda kuluçkaya yatırın.
Sonra 0.2 mikrometre filtre ile sterilize. Harcanan ortamı fibroblastlardan aspire edin ve yeni yapılmış MMC media ile değiştirin. Hücreleri altı gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın, her üç günde bir MMC ortamını değiştirin.
Bir mililitre asetik asit ile 200 mililitre distile deiyonize su damıtılmış kırmızı 80 tozu 0,2 gram eriterek bir Sirius Red çözeltisi hazırlayın. MMC ortamını hücrelerden aspire edin ve her kuyuya 300 mikrolitre Sirius Red çözeltisi ekleyin. Sonra hücreleri 90 dakika boyunca kuvöze geri verin.
Kuluçkadan sonra, Sirius Red çözeltisini musluk suyuyla hafifçe durulayın ve plakanın bir gecede kurumasını bekleyin. Ertesi gün, her kuyuya 0,1 molar sodyum hidroksit 200 mikrolitre ekleyerek ve 5 ila 10 dakika boyunca plaka sallayarak Sirius Kırmızı ayıklayın. Çıkarılan lekenin 100 mikrolitresini şeffaf bir 96 kuyu plakasına aktarın ve emiciliği mikro plaka okuyucusuyla 620 nanometrede ölçün.
Her kuyuyu 200 mikrolitre PBS ile yıkayın ve hücreleri 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca metanolile düzeltin. Sonra kuyulara% 3 BSA ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca plaka kuluçka. Engelleme çözeltisi aspire ve her kuyuya 200 mikrolitre anti-kollajen bir antikor ekleyin.
Plakayı 90 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra antikor aspire ve yıkama başına beş dakika PBS ile üç kez kuyuyıkama. Her kuyuya 200 mikrolitre Keçi Anti-Rabbit-FITC İkincil Antikor ve DAPI ekleyin.
Alüminyum folyo ile plaka kapağı ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Sekonder antikor ve DAPI'yi atın ve pbs ile yıkar. Sonra floresan doğrudan bir mikroskop altında görselleştirin.
Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, her kuyuya 40 mikrolitre lysis tamponu ekleyin ve hücre tabakasını pipet ucuyla kazıyın. Daha sonra protein konsantrasyonu ölçmek için mikro santrifüj tüpler içine protein lysate aktarın. 4 ila %12 Bis-Tris protein jelinin her kuyuya 10 mikrogram protein yükleyin ve SDS-PAGE'i 200 voltta 30 dakika boyunca gerçekleştirin.
Bittiğinde, 90 dakika boyunca 90 volt bir batı leke çalıştırarak bir nitroselüloz membran protein transferi, jel ve membran arasında kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat. 10 mililitre bloke tampon ile membranı kapatın. Sonra bir gecede dört santigrat derecede birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, yıkama başına beş dakika için yüzde 0,1 TBS Tween 20 ile membran beş kez yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca türe uygun ikincil antikor ile membran kuluçka. Yıkıntıları tekrarlayın ve bir görüntüleme sistemi ile floresan görselleştirin.
Toplam RNA'yı ticari bir RNA ekstraksiyon kiti ile arındırdıktan sonra, mikro hacim spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ölçün. Sonra ilk iplikçik DNA sentezi gerçekleştirmek için bir cDNA sentez kiti kullanın. CDNA'yı 10 mikrolitre SYBR Green Supermix ile karıştırın ve örnekleri oligonükleotid astarlarla önceden kaplanmış özel bir 96 kuyu plakasına aktarın.
Toplam hacmi suyla kuyu başına 20 mikrolitreye ayarlayın ve el yazması talimatlara göre RT-PCR çalıştırın. Hipertrofik skar kaynaklı insan derisi fibroblastlarının hücre yoğunluğu Ficoll ile kültürden sonra PVP veya kontrol ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artmıştır. Ficoll ile %9 kesirli hacimdolulukta makromoleküler kalabalık, kollajen bir tanesi de dahil olmak üzere kollajen birikimini diğer formülasyonlara göre önemli ölçüde artırmıştır.
Bu daha nicel analiz ile gösterilmiştir. MMC ortamlarında yetiştirilen skar kaynaklı fibroblastlar ve normal dermal fibroblastların kollajene ek olarak ECM türlerinin ekspresyonunu düzenlediği bulunmuştur. Özellikle, matris metalloproteinazveya MDP'lerin yüksek bir ekspresyonu, yerli dokulara göre hipertrofik skar dokularında birikti.
Makromoleküler kalabalık koşullarda yetiştirilen her iki hücre kültüründe de MMP2, 9 ve 13 ekspresyonunun önemli ölçüde güncellendiği gözlenmiştir. Yara iyileşmesi ve yara oluşumunda, ECM montajı ve yeniden biçimlendirilmesinde MDP'ler önemli bir rol oynar. İnterlökin altı ve vasküler endotelyal büyüme faktörü sentezi batı lekesinde saptanamadı.
Ancak RT-PCR analizi interlökin altı ekspresyonunun önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini, vasküler endotelyal büyüme faktörüifadesinin ise MMC koşullarında ekili fibroblastlarda aşağı düzenlenmiş olduğunu ortaya koymuştur. Bu protokolü denerken, çok az CO patojeni olan dermal fibroblastları seçmek çok önemlidir. Biz de askorbik asit MMC orta önemli bir madde olduğunu akılda tutmak zorunda.
Biz özellikle daha fazla bu MMC modelinde kollajen birikimi ve hizalama tespit ilgileniyoruz. Bu in vitro modeli nin yerli skar dokuları ile karşılaştırması için gelişmiş mikroskobik teknikler kullanmayı planlıyoruz. Yardımcı modal dokuların in vitro özgünlüklerini geliştirmek için başkalarını bu makromoleküler kalabalık tekniğini kullanmaya teşvik ediyoruz.
Tabii ki, makromoleküler kalabalık da in vitro hastalık ve patoloji modellerini yeniden hesaplamak için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, in vivo koşullara benzeyen bir in vitro insan hipertrofik skar doku modeli oluşturmak için makromoleküler kalabalıklaştırma yönteminin kullanımını açıklamaktadır. Makromoleküler olarak kalabalık bir ortamda kültüre edilen insan deri fibroblastları, skar dokusuna benzeyen fenotipler, biyokimya, fizyoloji ve fonksiyonel özellikler sergiler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- Deri, geleneksel sıvı hücre kültürlerinin aksine, kalabalık bir ortamdır.
- Hipertrofik skarlar benzersiz hücresel özellikler sergiler.
- Makromoleküler kalabalıklaşma, fibroblastlar için in vivo koşulları taklit edebilir.
- Bu teknik, pulmoner fibrozis gibi diğer durumlar için de uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Skar dokusunun in vivo ortamını doğru şekilde yansıtan bir model geliştirmek.
- Yoğun bir hücre dışı matristeki fibroblastların davranışlarını incelemek.
- Skar dokusu oluşumu ve ilgili durumlar hakkındaki anlayışı artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Makromoleküler kalabalıklaşma kullanarak kolajen açısından zengin bir modelin oluşturulması.
- Geleneksel tek tabaka hücre kültürü sistemleri ile karşılaştırma.
- Skar kaynaklı ve normal fibroblastların 24 kuyucuklu plakalara ekilmesi.
- Makale talimatlarına uygun spesifik büyüme koşullarının kullanılması.
Temel Sonuçlar
- Sıkışık ortamdaki fibroblastlar skar benzeri özellikler sergiler.
- Model, skar dokusunun ekstraselüler matrisini başarıyla taklit etmektedir.
- Bulgular, diğer fibrotik durumların incelenmesinde potansiyel uygulamalara işaret etmektedir.
- Çevresel faktörlerin hücre davranışı üzerindeki önemi ortaya konmuştur.
Sonuçlar
- Makromoleküler kalabalıklaşma tekniği, hipertrofik skarların modellenmesi için etkilidir.
- Bu yaklaşım, fibrotik hastalıklarda fibroblast davranışına dair içgörüler sağlayabilir.
- Gelecekteki çalışmalar, çeşitli doku mühendisliği uygulamaları için bu modeli geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Makromoleküler kalabalıklaşma (MMC), insan hipertrofik skarlarının hücre dışı matris ortamını yakından taklit eden in vitro modellerin oluşturulmasına olanak tanıyarak, translasyonel fibrozis araştırmalarındaki kritik bir boşluğu doldurur. Bu yaklaşım, erken evre hedef doğrulama için öngörü güvenini artırır ve fibrotik hastalık boru hatlarındaki mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Modelin fizyolojik uygunluğu ve ölçeklenebilirliği, onu portföy genelindeki fibrozis ve ECM yeniden yapılanma çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir platform olarak konumlandırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Fibrotik yolakların ve ECM yeniden şekillenme mekanizmalarının fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda sorgulanmasına olanak tanır.
- Kolajen birikimi ve matriks metalloproteinaz regülasyonunda yer alan hedeflerin fonksiyonel validasyonunu destekler.
- In vivo benzeri skar dokusu özelliklerini yeniden oluşturarak, anti-fibrotik adayların ilerletilmesi için öngörücü güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Kollajen ve ECM protein birikiminin kantitatif değerlendirmesi için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir sistem sağlar.
- Skar oluşumunu ve matriks yeniden şekillenmesini hedefleyen bileşiklerin güçlü bir şekilde taranmasına olanak tanır.
- Fibrotik yanıtların yüksek içerikli analizi için assay ölçeklenebilirliğini ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- İn vitro bulguları, kollajen I, MMP2, MMP9 ve MMP13 ekspresyonu gibi hastalıkla ilişkili biyobelirteçlerle ilişkilendirir.
- Hayvan modelleri kullanmadan insan skar dokusu biyolojisini modelleyerek, keşif ve preklinik doğrulama arasındaki köprüyü kurar.
- ECM dinamikleri ve fibrotik sinyalleme hakkında mekanistik içgörüler sağlayarak translasyonel ilerlemedeki riskleri azaltır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu MMC tabanlı model, fibrozis ve yara iyileşmesi programları için keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: İnsan fibroblastlarında ECM regülasyonu ve fibrotik yolak aktivasyonu üzerine hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için kolajen birikimi ve matriks proteini ekspresyonunun kantitatif çıktılarını sağlar.
- Analitik: Deneysel koşullar genelinde ECM ile ilişkili gen ve protein ekspresyonunun istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: İnsan patolojisi ile ilgili biyobelirteç uyumu ve mekanistik çalışmalar için süreklilik sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli fibrotik hastalık araştırmaları için hayvan modellerine karşı ölçeklenebilir ve etik olarak tercih edilebilir bir alternatif sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fibrozis hedef doğrulamasında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: ECM açısından zengin dokuların in vitro modellemesini, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir protokollerle standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Anti-fibrotik stratejilerin erken aşamada risklerinin azaltılmasını sağlayarak, devam/dur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Fibrozis ve yara iyileşmesi varlıklarının risk ayarlı önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Primer insan fibroblast kültürü ve ECM analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Floresan mikroskobu, plak okuyucular ve moleküler biyoloji cihazlarına erişim gereklidir.
- MMC besiyeri hazırlama ve kantitatif analiz protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Protokol optimizasyonu ile pulmoner fibrozis gibi ECM bakımından zengin diğer hastalık modellerine uyarlanabilir.
- Yüksek kaliteli, düşük kontaminasyonlu fibroblast kaynaklarına ve hassas reaktif kullanımına bağlıdır.
