Name: Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Keşfedin, makromoleküler kalabalık kullanarak insan hipertrofik yara dokusunun in vitro modelini nasıl oluşturulacağını. Bu yöntem, fibroblast davranışlarını ve yara iyileşmesi mekanizmalarını daha gerçekçi koşullarda çalışmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Singapur Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" ve "Tropics için Yara Bakımı İnovasyonu" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 tarafından desteklendi. Yazarlar minnetle tavsiye ve Dr Paula Benny ve Dr Michael Raghunath yardım kabul.

1. Hücre kültürü
<ol><li>Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) patolojik olmayan dokudan (hNSFs) elde edilen hHSF'leri ve normal dermal fibroblastları %10 fetal baldır serumu (FCS) ve %1 v/v penisilin/streptomisin çözeltisi (P/S) içeren %5 CO2/95hava ile bir kuvözde 37°C'de muhafaza edin.</li>
	<li>Ficoll 70, Ficoll 400 ve uygun şirketlerden askorbik asit satın alın.</li>
</ol>2. MMC hipertrofik skar modelinin yapımı
<ol><li>HHSF'leri veya hNSF'leri (50.000/iyi) her kuyuda 1 mL ortam içeren 24 kuyu plakasına yerleştirin.</li>
	<li>%5 CO2'de 37°C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin ve gece boyunca bırakın.</li>
	<li>MMC ortamını hazırlayın. Deney için gereken toplam hacme göre Ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL) ve askorbik asit (100 μM) karıştırılarak %10 FCS/DMEM ortam üretin.</li>
	<li>Karışımı 37°C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve crowders'ı çözeltiye dağıtın ve ardından 0,2 m filtre kullanarak MMC ortamını sterilize edin.</li>
	<li>Harcanan ortamı aspire edin ve yeni yapılmış MMC ortamıile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri 37°C'de 6 gün ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın ve her 3 günde bir ortam değiştirin.</li>
</ol>3. Kollajen toplam miktarının ifadesi
<ol><li>Sirius kırmızı çözeltisi hazırlayın (%0.1 w/v). 200 mL distile deiyonize su (ddH2O) ve 1 mL asetik asit ile Doğrudan Kırmızı 80 tozunun 0,2 g'ını çözün.</li>
	<li>MMC ortamını aspire edin ve her kuyuya 300 μL Sirius Red çözeltisi ekleyin. 90 dk için 37 °C'de kuluçka.</li>
	<li>Sirius Red çözeltisini musluk suyuyla hafifçe durulayın ve plakanın bir gecede hava kurmasını bekleyin.</li>
	<li>Her kuyuya 200 μL sodyum hidroksit (0,1 M) ekleyerek Sirius Red lekesini ayıklayın. Sirius Kırmızı lekesini tamamen çıkarmak için plakayı 5-10 dakika boyunca orbital shaker üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Çıkarılan Sirius Red lekesinin 100 μL'sini 96 iyi saydam bir plakaya aktarın ve mikroplaka okuyucu kullanarak 620 nm'de emiciliği ölçün.</li>
</ol>4. Kollajen I ekspresyonu (immünboyama)
<ol><li>200 μL fosfat tamponlu salin (PBS, pH = 7,35) kullanarak kuyuları yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca metanol (500 μL/iyi) kullanarak düzeltin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca %3 büyükbaş serum albumini ile nonspesifik etkileşimleri engelleyin.</li>
	<li>Engelleme çözeltisini aspire edin ve RT'de 90 dk boyunca 200 μL anti-kollajen I antikor (10 μg/mL) ile inkübat.</li>
	<li>Birincil antikor aspire ve 5 dakika her pbs ile 3x yıkayın.</li>
	<li>200 μL Keçi anti-Rabbit-FITC ikincil antikor (1:400 seyreltme) ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1: 2000 seyreltme) ile inkübat 30 dakika RT. Alüminyum folyo ile plaka kapağı.’</li>
	<li>Hem ikincil antikor ve DAPI atın ve 5 dakika her pbs ile 3x yıkayın.</li>
	<li>Floresan boyamasını doğrudan mikroskop altında görselleştirin.</li>
</ol>5. Batı lekeleme
<ol><li>Hücreleri 2 kat PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Her kuyuya 40 μL likte arabellek ekleyin ve bir pipet ucu ile hücre tabakasıkazıyın. Lysis tamponripa tampon, proteaz inhibitörü kokteyl (PIC), 2 mM sodyum vanadate ve 10 mM sodyum florür içerir.</li>
	<li>Protein lisatını mikrosentrifuge tüplere aktarın ve üreticinin talimatlarına göre protein tonu kullanarak protein konsantrasyonu ölçün16.</li>
	<li>Her grubun 10 μg proteinini %4-12 Oranında Bis-Tris protein jellerinin kuyularına yükleyin. Sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) 200 V 30 dakika için gerçekleştirin.</li>
	<li>90 dk için 90 V'de batı lekesini çalıştırarak proteini nitroselüloz membrana aktarın.</li>
	<li>Membranı 10 mL blokaj tamponu ile kapatın.</li>
	<li>Bir gecede 4°C'de primer antikorlarla kuluçkaya yatırın. Primer antikorlar şunlardır: anti-kollajen I, anti-kollajen III, anti-kollajen IV, anti-αSMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13, ve anti-gliserinaldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH).</li>
	<li>Membranı %0,1 TBS-Tween 20 (her biri 5 dk için 5 x) ile yıkayın. TBS/Tween 20 (1 L) aşağıdakileri içerir: 50 mL 1 M Tris (pH = 7.4), 30 mL 5 M sodyum klorür, 1 mL Tween 20 ve 920 mL ddH2O içerir.</li>
	<li>1 saat için RT uygun ikincil antikor ile kuluçka.</li>
	<li>Adım 5.8'i tekrarlayın ve bir görüntüleme sistemi kullanarak floresan'ı görselleştirin.</li>
</ol>6. RT-PCR
<ol><li>RNA ekstraksiyon sayıcı kitinde yer alan 2-mercaptoetanol ile karıştırılmış lysis tamponu kullanarak toplam RNA'yı toplayın.</li>
	<li>Üreticinin talimatları na göre RNA arındırın17.</li>
	<li>Mikro hacimsi spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ölçün.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre cDNA sentez kiti kullanarak ilk iplikçik cDNA sentezini gerçekleştirin.</li>
	<li>RT-PCR oligonükleotid astarlar özel 96 kuyu plakaları (precoated) sağlanır. CDNA numunelerinin 100 ng'sini 10 μL SYBR yeşil supermix ile özelleştirilmiş plakaya karıştırın.</li>
	<li>DDH2O kullanarak toplam hacmi 20°L/iyiye yükseltin.</li>
	<li>RT-PCR'ı üreticinin talimatlarına uygun bir termal döngü kullanarak çalıştırın: 98°C'de 15 s için 40 devir denaturing ve 60 s için 60 °C'de tavlama/uzatma. RT-PCR'de test edilen genler şunlardır: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1, ve VEGF.</li>
</ol>

<ol><li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li>
<li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen%5Bmdash%5DThe+Role+of+Tissue+Transglutaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li>
<li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing%2C+burns+and+scarring%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Burns+and+Trauma%22%5BJournal%5D)">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li>
<li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-depleted+fetal+bovine+and+human+sera+have+reduced+capacity+to+support+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373(2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li>
<li>Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+macromolecular+crowding+can+do+to+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">What macromolecular crowding can do to a protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).</li>
<li>Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li>
<li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+Crowding+Directs+Extracellular+Matrix+Organization+and+Mesenchymal+Stem+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior.</a> PloS one. 7 (5), 37904(2012).</li>
<li>Chen, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Scar-in-a-Jar%3A+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+%22macromolecular+crowding%22+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin%2C+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747(2019).</li>
<li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procollagen+trafficking%2C+processing+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes%3A+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li>
<li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918(2010).</li>
<li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+RNeasy+Mini+Kit+to+obtain+high-quality+total+RNA+from+sessile+cells+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Medical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).</li>
<li>Xue, M., Jackson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+Reorganization+During+Wound+Healing+and+Its+Impact+on+Abnormal+Scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+wound+care+%28New+Rochelle%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring.</a> Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).</li>
<li>Rohani, M. G., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li>
<li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li>
<li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li>
<li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li>
<li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li>
<li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165(2019).</li>
<li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746(2016).</li>
<li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li>
<li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70(2015).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li>
<li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yok.

Bu protokol, insan kutanöz skar dokusu için geliştirilmiş bir "scar-in-a-jar" in vitro modelini optimize etmeyi ve doğrulamasını amaçlamaktadır. Önceki çalışmalarda insan akciğer fibroblastları için MMC tekniğinin uygulama bildirilmiştir12, insan kemik iliği mezenkimal kök hücreler23, ve insan dermal fibroblastlar23 dekstran kullanarak12, Ficoll12, ve PVP23 crowders olarak. Burad...

Yara dokusu doku onarımının bitiş noktasını temsil eder. Ancak, birçok kişide, özellikle yanık veyatravma1 muzdarip olanlar, yara izi aşırı olabilir ve morfolojisi ve iyileşmiş cildin işleyişi üzerinde istenmeyen etkileri empoze. Patolojik (hipertrofik yara izleri ve keloidler) skar oluşumunun tam mekanizmaları tam olarak anlaşılamamasına rağmen, yara iyileşmesi sırasında kollajenin aşırı birikiminin önemli bir katkı olduğu gösterilmiştir2.
Transforming büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) ve alfa düz kas aktininin (αSMA) hipertrofik yaraların oluşumunda kilit rol oynadığı iyi belirlenmiştir. Kanıtlar, yüksek TGF-β1'in SMAD sinyal yolu3'üdüzenleyerek kollajenin aşırı birikimini doğrudan uyardığını göstermektedir. Buna ek olarak αSMA'nın yara iyileşme sürecinde hücre daralması ve reepitelizasyonunu düzenleyerek hipertrofik skar oluşumuna katkıda bulunduğu bulunmuştur4. Uygun in vitro ve in vivo modellerin in eksikliği, yara izi İyileştirme için müdahalelerin ve tedavilerin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi açısından önemli bir engeldir. Bu çalışmanın amacı, yeni ve ortaya çıkan yara ile ilgili müdahaleleri değerlendirmek için uygun olan "in vivo benzeri" hipertrofik skar modeli oluşturmak için mevcut MMC tekniğini kullanmaktır.
Canlı dokuların vücut dışında üretilmesi bilim camiasında yıllardır bir hedef olmuştur. Yirminci yüzyılın başlarında in vitro tekniklerinin geliştirilmesi kısmen bu hedefe ulaşıldı. Mevcut in vitro teknikleri biraz Roux orijinal gösteri embriyonik hücrelerin sıcak tuzlu5birkaç gün için ex vivo hayatta olabilir gelişti . Ancak in vitro metodolojiler çoğunlukla 2-B'de yetiştirilen tek hücreli tiplerle sınırlıdır ve in vivo dokuları doğru bir şekilde özetlemez. Hücre biyokimyası, fizyolojisi ve genetiğinin incelenmesinde yararlı olmakla birlikte, yerli dokular 3-B'dir ve birden fazla hücre tipini içerir. Basit 2-D in vitro sistemler memeli hücrelerini doğal dokuya özgü mimarinin6'sınıkaybettiği son derece yapay ortamlara tabi tutar. Buna karşılık, bu anormal hücre morfolojisi, fizyolojisi ve davranış7sonuçlanan, hücre içi ve hücre dışı olayları etkiler.
Bu protokolün arkasındaki ilgi hipertrofik yara ve keloidlerin gelişimi ve klinik yönetiminde yatsın. Dermal fibroblastların skar dokusunda bulunan kollajenlerin bol miktarda üretilmesinden büyük ölçüde sorumlu olduğu iyi saptanmış olsa da, 2-D in vitro sistemleri kullanılarak dermal fibroblastların yetiştirilmesi in vivo8'degözlenen kollajenin cirosunu yeniden üretememektedir. Çağdaş in vitro yöntemleri hala aslında "sıcak tuzlu" kullanmak, bir ortamda tamamen canlı dokularda farklı. Vivo'daki dokular proteinler, nükleik asitler, ribonükleoproteinler ve polisakkaritlerle son derece kalabalıktır ve toplam hacmin %5-40'ını kaplarlar. Hiçbir iki molekül aynı anda aynı alanı işgal edebilirsiniz gibi, çok az boş alan mevcut ve serbest su neredeyse tam yokluğu9.
MMC tekniği, sitosol ve interstisyel sıvıların termodinamik özelliklerini etkileyen kısıtlamalar uygular. Moleküler etkileşimler, reseptör-ligand sinyal kompleksleri, enzimler ve organeller serbestçe etkileşime girerler 9. Perisellüler ortam (yani interstitium) içindeki etkileşimler de kısıtlanır. Son kanıtlar, kalabalık çözeltilerde yüksek oranda inert makromoleküllerin perturb difüzyon, fiziksel ilişki, viskozite ve hidrodinamik özellikleri10olduğunu doğrulamaktadır.
İlginçtir, çeşitli popüler kalabalık ajanlar (yani, Ficoll, dextran, polivinylpyridone [PVP], ve sodyum 4-stirensülfonat [PSS]) farklı hücre tipleri ve farklı ortamlarda uygulandığında eşdeğer değildir. Bir önceki çalışmada, Ficoll PVP ile karşılaştırıldığında mezenkimal kök hücreler için daha az sitotoksik olduğu bildirilmiştir. Bu sonuçlar nötr yükü ve nispeten küçük hidrodinamik yarıçapı11sonucu olarak yorumlandı. Buna karşılık, ikinci bir çalışmada dextran ficoll12ile karşılaştırıldığında insan akciğer fibroblastları tarafından kollajen I birikimi uyarıcı daha etkili olduğunu bulundu . Kendi çalışmamızdan elde edilen veriler Ficoll hipertrofik skar kaynaklı fibroblastlar tarafından kollajen birikimini artırır düşündürmektedir, PVP bu hücreler için toksik ise13.
Bu kollajen için prokollajen dönüşüm ü vivo ortamda son derece kalabalık bir ortamda daha hızlı olduğu gösterilmiştir14, biyolojik reaksiyonların oranı seyreltilmiş 2-B kültür sisteminde gecikilir iken15. Biz burada in vitro protokolü optimize var, dermal fibroblastlar dermal fibrozis ve skar oluşumu için daha "in vivo gibi" bir model olarak hizmet veren ekimi göstermek için MMC içeren. Ortak 2-B kültür sisteminin aksine, MMC ile hHSFs yetiştirmek önemli ölçüde13kollajen biyosentez ve birikimi ni uyarır. Özellikle, fibrozis diğer özellikleri (yani, matris metalloproteinazların artan ekspresyonu [MDP] ve proinflamatuar sitokinler) ayrıca bu optimize MMC protokolü13altında belirgindir . Bu yöntemle ekili olduğunda, dermal hücrelerin in vivo ölçülen fizyolojik, biyokimyasal ve fonksiyonel parametreleri yeniden kapitalizettiği gösterilmiştir.
Optimize edilmiş MMC in vitro protokolü, hipertrofik skar dermisi ve ilgisiz komşu dermisten izole edilen dermal fibroblastlar tarafından kollajen ve diğer ECM proteinlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır. MMC ortamlarında in vitro olarak yetiştirildiğinde, HHSF'lerin dermal hipertrofik skar dokusuna benzer belirli özellikleri (yani mRNA, biyokimya, fizyoloji ve fenotip) ifade ettiği gözlenmiştir. Kanıtlar, crowders seçerken ve in vitro ekimi için MMC koşullarını optimize ederken fiziksel ve kimyasal özelliklerin önemli noktalar olduğunu göstermektedir.
Prensip kanıtı için, MMC protokolü burada Nitel ve nicel olarak Shikonin ve analoglarının apoptoza neden olma yeteneğini değerlendirmek için uygulanır. Bu dermal yara izi yönetmek için bu doğal kaynaklı Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) bileşiklerin potansiyel uygulamalarının değerlendirilmesi sağlar13. Buna rağmen, bu in vitro MMC protokolünün basitliği, maliyet etkinliği ve güncelliği, ab direktifi 2010/63/EU ve ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından memelilerde yapılan deneyleri ortadan kaldırmak için yapılan son düzenlemeleri de karşılar.

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mu; m filtre</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 800</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11371</td><td></td></tr><tr><td>alfa düz kas aktin (&alfa;SMA) birincil antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td></td></tr><tr><td>Uygulamalı Biyosistemler 7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi (termal döngüleyici)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Wako</td> <td># 013-12061</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2153</td><td></td></tr><tr><td>Bradford protein testi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I birincil antikoru (immün boyama için)</td><td>Abcam</td><td>6308</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I birincil antikoru (western blot için)</td><td>Abcam</td><td>ab21286</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen III birincil antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab7778</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen IV birincil antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab6586</td><td></td></tr><tr><td>Doğrudan Kırmızı 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2610108</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11996-065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu (FCS)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>6000-044</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Sağlık Hizmetleri</td><td>#17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 70</td><td>GE HealthCare</td><td>#17-0310-10</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH birincil antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan ikincil antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab97050</td><td></td></tr><tr><td>İnsan hipertrofik skar/normal fibroblastlar (hHSF/hNSF)</td><td>Cell Research Corporation</td><td>106, 107, 108</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Sentez Kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>#1708890</td><td></td></tr><tr><td>MMP-1 birincil antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab38929</td><td></td></tr><tr><td>MMP-13 birincil antikor</td><td>Abcam</td><td>ab39012</td><td></td></tr><tr><td>MMP-2 primer antikor</td><td>Abcam</td><td>ab37150</td><td></td></tr><tr><td>MMP-9 primer antikor</td><td>Abcam</td><td>ab38898</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Mikrohacim Spektrofotometreleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran</td><td>Bio-Rad</td><td>10484060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey engelleme tamponu</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927&ndash; 40000</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc Görüntüleme Sistemi</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 HCS mikroskobu (immün boyama için)</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/streptomisin çözeltisi (P/S)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Testleri</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>İhtiyaca göre 96 oyuklu plakalarda önceden kaplanmış özelleştirilmiş astarlar</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör kokteyli (PIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>PVP 360</td><td>Sigma</td><td>#PVP360</td><td></td></tr><tr><td>PVP 40</td><td>Sigma</td><td>#PVP40</td><td></td></tr><tr><td>RIPA tamponu</td><td>Merck</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td> <td># 74134</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum vanadat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum vanadat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Çok Modlu mikroplaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced evrensel SYBR yeşil süper karışım</td><td>Bio-Rad</td> <td># 172-5270</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

makromoleküler kalabalık kullanılarak İnsan kutanöz hipertrofik yaranın in vitro modeli

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

İnvivo dokuların proteinler, nükleik asitler, ribonükleoproteinler, polisakkaritler vb. ile çok kalabalık olduğu gösterilmiştir. Aşağıdaki protokol, nötr polimerlerin (crowders) hücre kültürlerine in vitro eklenmesi yle bu fizyolojik kalabalığı taklit etmek için makromoleküler bir kalabalık (MMC) tekniğini uygular. Ficoll veya dextran'ı crowder olarak kullanan önceki çalışmalar, WI38 ve WS-1 hücre hatlarında kollajen I ve fibronektin ekspresyonunun MMC tekniği kullanılarak önemli ölçüde geliştirildigini göstermektedir. Ancak, bu teknik primer hipertrofik skar kaynaklı insan deri fibroblastlarında (hHSFs) doğrulanmamıştır. Hipertrofik yara kollajenaşırı birikimi ortaya çıktığından, bu protokol hHSFs ile MMC tekniği uygulanarak kollajen açısından zengin in vitro hipertrofik skar modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu optimize MMC modeli geleneksel 2 boyutlu (2-B) hücre kültür sistemleri ile karşılaştırıldığında in vivo skar dokusu ile daha fazla benzerlikler sahip olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, hayvan modellerine göre uygun maliyetli, zaman-etkin ve etik olarak arzu edilir. Bu nedenle, burada bildirilen optimize edilmiş model hipertrofik skar ile ilgili çalışmalar için gelişmiş bir "in vivo benzeri" modeli sunuyor.

Her deneyde üçerlik örnekler uygulandı ve her deney üç hastanın hücreleri kullanılarak 3x tekrarlandı. Veriler kontrol grubunun yüzdeleri olarak ifade edilir. İstatistiksel farklılıkları analiz etmek için tek yönlü ANOVA ve Tukey'in post-hoc testi uygulandı (*p 0.05).
MMC% 9 FVO (fraksiyonel hacim doluluk) de Ficoll kullanarak hHSF13kollajen ve kollajen I birikimi nin toplam miktarını artırır. Şekil 1A'dagösterildiği gibi, Ficoll i...

Bu protokol, in vivo koşullarına benzeyen bir in vitro insan hipertrofik skar dokusu modeli oluşturmak için makromoleküler kalabalık kullanımını açıklar. Kalabalık bir makromoleküler ortamda ekili zaman, insan deri fibroblastlar fenotipleri, biyokimya, fizyoloji ve skar dokusu andıran fonksiyonel özellikleri sergiler.

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Makromoleküler kalabalık tekniğini kullanarak hücrelerin in vivo deneyim çevresini taklit etmek için bireysel kollajen açısından zengin bir model oluşturduk. Cilt zaten in vitro hücreleri büyümek için kullandığımız sıvı ortamın aksine, kalabalık bir ortamdır. Geleneksel monolayer hücre kültür sistemi ile karşılaştırıldığında, bu model hücrelerin in vivo deneyim kalabalık moleküler ortamı yeniden oluşturur, özellikle bol hücre dışı matris sıvı su yerinden skar dokularında.Hipertrofik yaraların yanı sıra, bu makromoleküler kalabalık tekniği pulmoner fibrozis gibi ekstrasellüler matriksbol olduğu çalışmalarda kullanılabilir. El yazması yönlere göre yara ve normal fibroblastlar büyütün. Sonra 50, 000 hücre de orta bir mililitre başına 24 kuyu plakaları içine tohum.Plakayı bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Ficoll 70, Ficoll 400 ve askorbik asidi %10 FCS DMEM'e karıştırarak makromoleküler kalabalık veya MMC ortamını hazırlayın. Kalabalığı çözeltiye dağıtmak için medyayı su banyosunda kuluçkaya yatırın.Sonra 0.2 mikrometre filtre ile sterilize. Harcanan ortamı fibroblastlardan aspire edin ve yeni yapılmış MMC media ile değiştirin. Hücreleri altı gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın, her üç günde bir MMC ortamını değiştirin.Bir mililitre asetik asit ile 200 mililitre distile deiyonize su damıtılmış kırmızı 80 tozu 0,2 gram eriterek bir Sirius Red çözeltisi hazırlayın. MMC ortamını hücrelerden aspire edin ve her kuyuya 300 mikrolitre Sirius Red çözeltisi ekleyin. Sonra hücreleri 90 dakika boyunca kuvöze geri verin.Kuluçkadan sonra, Sirius Red çözeltisini musluk suyuyla hafifçe durulayın ve plakanın bir gecede kurumasını bekleyin. Ertesi gün, her kuyuya 0,1 molar sodyum hidroksit 200 mikrolitre ekleyerek ve 5 ila 10 dakika boyunca plaka sallayarak Sirius Kırmızı ayıklayın. Çıkarılan lekenin 100 mikrolitresini şeffaf bir 96 kuyu plakasına aktarın ve emiciliği mikro plaka okuyucusuyla 620 nanometrede ölçün.Her kuyuyu 200 mikrolitre PBS ile yıkayın ve hücreleri 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca metanolile düzeltin. Sonra kuyulara% 3 BSA ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca plaka kuluçka. Engelleme çözeltisi aspire ve her kuyuya 200 mikrolitre anti-kollajen bir antikor ekleyin.Plakayı 90 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra antikor aspire ve yıkama başına beş dakika PBS ile üç kez kuyuyıkama. Her kuyuya 200 mikrolitre Keçi Anti-Rabbit-FITC İkincil Antikor ve DAPI ekleyin.Alüminyum folyo ile plaka kapağı ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Sekonder antikor ve DAPI'yi atın ve pbs ile yıkar. Sonra floresan doğrudan bir mikroskop altında görselleştirin.Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, her kuyuya 40 mikrolitre lysis tamponu ekleyin ve hücre tabakasını pipet ucuyla kazıyın. Daha sonra protein konsantrasyonu ölçmek için mikro santrifüj tüpler içine protein lysate aktarın. 4 ila %12 Bis-Tris protein jelinin her kuyuya 10 mikrogram protein yükleyin ve SDS-PAGE'i 200 voltta 30 dakika boyunca gerçekleştirin.Bittiğinde, 90 dakika boyunca 90 volt bir batı leke çalıştırarak bir nitroselüloz membran protein transferi, jel ve membran arasında kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat. 10 mililitre bloke tampon ile membranı kapatın. Sonra bir gecede dört santigrat derecede birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, yıkama başına beş dakika için yüzde 0,1 TBS Tween 20 ile membran beş kez yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca türe uygun ikincil antikor ile membran kuluçka. Yıkıntıları tekrarlayın ve bir görüntüleme sistemi ile floresan görselleştirin.Toplam RNA'yı ticari bir RNA ekstraksiyon kiti ile arındırdıktan sonra, mikro hacim spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ölçün. Sonra ilk iplikçik DNA sentezi gerçekleştirmek için bir cDNA sentez kiti kullanın. CDNA'yı 10 mikrolitre SYBR Green Supermix ile karıştırın ve örnekleri oligonükleotid astarlarla önceden kaplanmış özel bir 96 kuyu plakasına aktarın.Toplam hacmi suyla kuyu başına 20 mikrolitreye ayarlayın ve el yazması talimatlara göre RT-PCR çalıştırın. Hipertrofik skar kaynaklı insan derisi fibroblastlarının hücre yoğunluğu Ficoll ile kültürden sonra PVP veya kontrol ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artmıştır. Ficoll ile %9 kesirli hacimdolulukta makromoleküler kalabalık, kollajen bir tanesi de dahil olmak üzere kollajen birikimini diğer formülasyonlara göre önemli ölçüde artırmıştır.Bu daha nicel analiz ile gösterilmiştir. MMC ortamlarında yetiştirilen skar kaynaklı fibroblastlar ve normal dermal fibroblastların kollajene ek olarak ECM türlerinin ekspresyonunu düzenlediği bulunmuştur. Özellikle, matris metalloproteinazveya MDP'lerin yüksek bir ekspresyonu, yerli dokulara göre hipertrofik skar dokularında birikti.Makromoleküler kalabalık koşullarda yetiştirilen her iki hücre kültüründe de MMP2, 9 ve 13 ekspresyonunun önemli ölçüde güncellendiği gözlenmiştir. Yara iyileşmesi ve yara oluşumunda, ECM montajı ve yeniden biçimlendirilmesinde MDP'ler önemli bir rol oynar. İnterlökin altı ve vasküler endotelyal büyüme faktörü sentezi batı lekesinde saptanamadı.Ancak RT-PCR analizi interlökin altı ekspresyonunun önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini, vasküler endotelyal büyüme faktörüifadesinin ise MMC koşullarında ekili fibroblastlarda aşağı düzenlenmiş olduğunu ortaya koymuştur. Bu protokolü denerken, çok az CO patojeni olan dermal fibroblastları seçmek çok önemlidir. Biz de askorbik asit MMC orta önemli bir madde olduğunu akılda tutmak zorunda.Biz özellikle daha fazla bu MMC modelinde kollajen birikimi ve hizalama tespit ilgileniyoruz. Bu in vitro modeli nin yerli skar dokuları ile karşılaştırması için gelişmiş mikroskobik teknikler kullanmayı planlıyoruz. Yardımcı modal dokuların in vitro özgünlüklerini geliştirmek için başkalarını bu makromoleküler kalabalık tekniğini kullanmaya teşvik ediyoruz.Tabii ki, makromoleküler kalabalık da in vitro hastalık ve patoloji modellerini yeniden hesaplamak için kullanılabilir.

in-vitro-model-human-cutaneous-hypertrophic-scarring-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokolün amacı, doğal cilde benzeyen üç boyutlu tam kalınlıkta bir cilt eşdeğeri oluşturmaktır. Özel olarak yapılmış bir otomatik yaralama cihazı ile, sterilitenin korunması altında hassas ve tekrarlanabilir yaralar oluşturulabilir.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

Bu makalenin amacı, epidermal keratinositlerden ve devitalize insan dermisinden genetik olarak değiştirilmiş insan organotipik derisinin nasıl oluşturulacağına dair kapsamlı ve ayrıntılı bir protokol sağlamaktır.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Bu makromoleküler Crowders (MMC) kullanarak, hücre dışı matris protein açısından zengin hücre-türevi matrisleri elde etmek için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, yapının vadesinin korurken kültür süresini azaltır 3D Organotipik bir deri ko-kültür üretimi bölgesi MMC içeren bir protokol mevcut.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Bu protokol, üç boyutlu yeniden oluşturulmuş insan epidermisini tekrarlanabilir ve sağlam bir şekilde yetiştirmek için basit bir yöntemi açıklar. Ek olarak, epidermal bariyer modelinin yapı-işlev ilişkisini karakterize eder. Yeniden inşa edilen insan epidermisinin proinflamatuar uyaranlar üzerine biyolojik tepkileri de sunulmaktadır.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

Bu protokolün amacı, uzun vadeli kültür için erişilebilir ve basit teknikler kullanarak damarlı insan derisi eşdeğerlerinin neslini ve hacimsel analizini tanımlamaktır. Mümkün olduğu ölçüde, adımların gerekçesi, araştırmacılara araştırma ihtiyaçlarına göre özelleştirme olanağı sağlamak için açıklanmıştır.

Kendi Kendine Monte Edilmiş Vaskülerleştirilmiş İnsan Derisi Eşdeğerlerinin Üretimi

Burada, ex vivo insan derisini kullanarak yara onarımını değerlendirmek için optimize edilmiş bir teknik ve tam montajlı bir boyama yaklaşımı sergiliyoruz. Bu metodoloji, potansiyel yara tedavilerinin değerlendirilmesi için klinik öncesi bir platform sağlar.

Cilt Onarımını Doğru Değerlendirmek için İnsan Ex vivo Yara Modeli ve Tam Montajlı Boyama Yaklaşımı

Bu protokol, "Bir Çanakta SCar benzeri doku" veya SCAD olarak adlandırılan bir cilt-fasya eksplantının oluşumunu tanımlar. Bu model, skar oluşumu sırasında tek fibroblastların benzeri görülmemiş bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.

SCAD Testi Kullanarak Yara İzi Gelişimini Görselleştirme - Ex-situ Cilt Yara İzi Tahlili

Burada, bir hücre kültürü laboratuvarında rutin araştırmalar için çeşitli 3D cilt modellerini tanıtmak için ucuz ve basit prosedürler sunuyoruz. Araştırmacılar, ticari olarak mevcut modellere güvenmeden ihtiyaçlarına göre uyarlanmış modeller oluşturabilirler.

Çok Sayıda Uygulama için Cilt Modelleri Oluşturma - İki Boyutlu (2D) Monokültürden Üç Boyutlu (3D) Çoklu Kültüre

Bu protokol, insan benzeri yara izini simüle etmek için mekanotransdüksiyon sinyalini artıran bir hipertrofik yara izi oluşturan murin modelinin nasıl oluşturulacağını açıklayacaktır. Bu yöntem, bir farede iyileşen bir kesi boyunca mekanik gerilimi artırmayı ve ayrıntılı histolojik ve biyoinformatik analizler için tekrarlanabilir, aşırı skar dokusu oluşturmak için özel bir cihaz kullanmayı içerir.

Mekanotransdüksiyon Odaklı, İnsan Benzeri Hipertrofik Yara İzinin Bir Fare Modeli

Bu protokol, cilt mimarisini ve işlevini çoğaltmak için düzlemsel, fizyolojik olarak ilgili bir hava-sıvı arayüz kültür sistemi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden saç folikülleri içeren cilt organoidleri üretmek için bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir.

Hava-Sıvı Arayüz Kültür Sistemi Kullanılarak İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Düzlemsel Saç Taşıyan Cilt Organoidlerinin Üretimi

Keşfedin, makromoleküler kalabalık kullanarak insan hipertrofik yara dokusunun in vitro modelini nasıl oluşturulacağını. Bu yöntem, fibroblast davranışlarını ve yara iyileşmesi mekanizmalarını daha gerçekçi koşullarda çalışmaya olanak tanır.

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

Daha fazla video keşfet