Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Virüs-bakteriyel etkileşimler başarılı viral enfeksiyon ve bir konak bağışıklık yanıtı stimülasyonu için önemli olabilir. Ama şu anda, son derece konsantre ve insan norovirüs saf stok laboratuvarda üretilemez. Bu teknik, virüs benzeri parçacıklar veya canlı virüs mevcut olan bakterilere bağlanan herhangi bir virüs ile kullanılabilir.

Bu virüsler ve bakteriler arasındaki etkileşimleri ölçmemizi sağlar. Doğrudan dondurulmuş gliserol stokbir agar plaka enterobacter cloacae tek bir izole koloni ile sıvı orta beş mililitre aşılamak. Bakterileri bir gecede büyütün.

Ertesi gün, iki ayrı 1,5 mililitre santrifüj tüpler içine kültürün 1.3 mililitre aliquots aktarın. Tüpleri 10, 000 x g'de beş dakika santrifüj edin. Süpernatantları çıkarın, ardından her yıkama için bir mililitre steril 1X PBS kullanarak numuneleri iki kez yıkayın.

Örnekleri tekrar 10, 000 x g'da beş dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve steril 1X PBS 1.3 mililitre pelet resuspend. Yıkanmış kültür 0,5 mililitre ile başlayarak, 1X PBS'deki bakterileri 10'dan eksi 10'a eksi 10'dan eksi dörde kadar seri olarak seyreltin.

Bir spektrofotometre kullanarak, yıkanmamış kültürün optik yoğunluğunu ve her dört seyreltmenin her birini 600 nanometrede ölçün. Önceki seyreltmelerin her biri için 1X PBS'de 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. Her örnek için mililitre başına koloni oluşturan birimlerin sayısını belirlemek için her seri için son üç seyreltme 100 mikrolitrea agar plakaları üzerine yayın.

Tabakların oda sıcaklığında beş dakika kurumasını bekleyin. Plakaları ters çevirin ve kuvöze yerleştirin. El yazmasında açıklandığı gibi reaktifler, antikorlar ve bakteriler hazırlandıktan sonra tüm malzemeleri BSL-2 biyogüvenlik kabininde bir araya getirin.

İnsan norovirüs için virüs benzeri parçacıklar BSL-2 patojenleri olarak listelenir ve VLP kullanılarak yapılan tüm çalışmalar sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Her bakteri tüpüne 10 mikrogram insan norovirüs VLP'si ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Tüpleri 37 santigrat derecede sabit rotasyonla bir saat kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra tüpleri 10,000 x g'de beş dakika santrifüj edin. Aspire ve supernatant atın ve PBS bir mililitre bakteriyel pelet resuspend. Yıkama adımlarını bir kez tekrarladıktan sonra tüpleri 10,000 X g'de beş dakika santrifüj edin.

Supernatant atın ve% 5 engelleme tampon 150 mikrolitre VLP-bakteri pelet resuspend. Oluşan yaygın bir hata tüplertakas ve yanlış tedavi eklenir olmasıdır. Bunu önlemek için, doğru tedaviye karşılık gelen satırlarda tüm tüpleri düzenlemek ve tüplere aynı anda bir tedavi ekleyin.

Her bakteri örneği için, seyreltilmiş insan norovirüs GII antikor 50 mikrolitre hazırlamak. %5 engelleme tamponu kullanarak, E.cloacae örnekleri için antikor 1 ila 125 seyreltin. Aynı seyreltme oranlarını kullanarak her bakteri örneği için seyreltilmiş isotip antikor 50 mikrolitre hazırlayın.

Her ek test numunesini temiz 1,5 mililitrelik santrifüj tüplere aktararak 350 mikrolitrelik aliquots'a bölün. Lekesiz kontroller oluşturmak için, her bakteri örneğinden ilk aliquot için engelleme tampon 50 mikrolitre ekleyin. Lekeli numuneler için, ikinci aliquot setine 50 mikrolitre GII antikor seyreltme ekleyin.

Üçüncü aliquot setine seyreltilmiş isotip antikorunun 50 mikrolitresini ekleyerek iyotip kontrollerini oluşturun. Tüm örnekleri buzda ve karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra beş dakika boyunca 10, 000 X g tüm örnekleri santrifüj.

Süpernatantları atın ve her numuneyi 150 mikrolitre FCSB'de yeniden askıya alın. Yine, beş dakika boyunca 10, 000 X g tüm örnekleri santrifüj. Yine, supernatants atın ve FCSB 100 mikrolitre örnekleri resuspend.

Numuneleri son bir kez santrifüj ettikten ve süpernatantları attıktan sonra, fcsb'nin 150 mikrolitresinde numuneleri yeniden askıya alın. Her numuneyi toplam 550 mikrolitre hacim için 400 mikrolitre FCSB içeren bir tüpe aktarın. Numuneleri akış sitometrisi tarafından analiz edilene kadar 4 derece santigrat derecede saklayın.

VLP eki akış sitometrisi kullanılarak ölçüldü. İlk olarak, yoğunluk arazileri hücresel enkaz dışarı kapı için kullanılan, bakteriyel doublets ve hücresel kümeleri kaldırmak için sonraki nokta arsa gating izledi. Temsili histogramlar, sadece bakteri örneklerinde PE sinyali eksikliği ni ve VLP:bakteri örneklerinde lekesiz ve isotip kontrollere göre PE sinyal yoğunluğunda bir kayma olduğunu göstermektedir.

10 mikrogram VLP ile bir saatlik kuluçkadan sonra akış sitometrisi hem E.colacae hem de L.gasseri'ye bağlanan parçacık tespit etti. Bu teşp için bağlayıcı nicelik sınırını belirlemek için, bakterilere ilave edilmeden önce VLP'lerin seyreltme serisi oluşturulmuştur. VLP miktarındaki azalmalar, VLP ile sınırlanan bakterilerin yüzdesine karşılık gelen azalmalarla sonuçlandı.

Virüsün bakteri oranını bilmek ve deneyler arasındaki oranı tutarlı tutmak sonuçların yorumlanmasında önemlidir. Bakteriyel ve viral mutantlar özellikle bu etkileşim aracılık mikrobiyal yüzey yapılarını belirlemek için oluşturulabilir. Bu teknik, araştırmacıların virüs genotipindeki değişikliklerin, bakteriyel büyüme koşullarının ve bakteri yüzey yapılarındaki değişikliklerin viral bağlanmayı nasıl değiştirdiği de dahil olmak üzere norovirüs-bakteriyel etkileşimleri etkileyen durum ve koşullarla ilgili soruları yanıtlamalarına olanak tanır.