Name: Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Keşfedin akış sitometrisi kullanarak insan norovirüs benzeri partiküllerin kommensal bakterilere bağlanmasını ölçme yöntemini. Bu teknik canlı virüs gerektirmeden virüs-bakteri etkileşimlerini nicelendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sutonuka Bhar ve Chanel Mosby-Haundrup'a yazılı el yazmasının eleştirel incelemesi için teşekkür etmek istiyoruz, ayrıca Alfonso Carrillo'ya bakteriyel standart eğriler üretme konusunda yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (R21AI140012) bir hibesi ve Florida Üniversitesi, Gıda ve Tarım Bilimleri Enstitüsü'nden bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir.

NOT: Protokolde belirtilen bakteriyel büyüme koşulları Enterobacter cloacae ve Lactobacillus gasseriiçin standart kültür koşullarıdır. Virüsün diğer bakteri türleri ile bakteri eki testi gerçekleştirmek için, seçilen bakteriler bakteri için uygun standart koşullar altında kültürlü olmalıdır.
1. Bakteriyel Büyüme Ortamının Hazırlanması
<ol><li>
Enterobacter cloacae büyüme ortamı<ol>
<li>10 g tripton, 5 g maya ekstresi ve 10 g sodyum klorür (NaCl) 1 L'lik de-iyonize (DI) suda eriterek sıvı ortamı hazırlayın (bkz. Malzemeler Tablosu). Tüm ortamları iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.</li>
		<li>10 g tripton, 5 g maya özü, 10 g NaCl ve 1L DI suda 15 g agar eriterek katı ortam hazırlayın. Tüm ortamları iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lactobacillus gasseri büyüme ortamı<ol>
<li>De Man, Rogosa ve Sharpe 55 g eriterek sıvı orta hazırlayın (MRS; Malzeme Tablosubakınız) 1 L DI su tozu. Hazırlıktan sonraki bir ay içinde orta kullanın. Sterilize etmek için, kaynama ya da 15 dk otoklavlama kadar 15 dk için ısı orta.</li>
		<li>55 g MRS tozu ve 1 L DI suda 15 g agar eriterek katı orta hazırlayın. Sterilize etmek için, kaynama ya da 15 dk otoklavlama kadar 15 dk için ısı orta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Optik Yoğunluk (OD) ve Bakteri Konsantrasyonu Ile İlgili Standart Bir Eğri Oluşturulması
<ol><li>Bir agar plaka(E. cloacae)veya doğrudan dondurulmuş gliserol stok(L. gasseri)tek, izole koloni ile uygun sıvı orta 5 mL aşılamak.</li>
	<li>Uygun atmosferik koşullar altında, bir gecede bakteri büyümek (Enterobacter cloacae: 37 °C aerobik sallayarak 200 rpm; L. gasseri: Hava geçirmez bir kapta titremeden 37 °C su banyosu).</li>
	<li>2 x 1.3 mL gecelik kültürü iki ayrı 1.5 mL santrifüj tüpüne ve santrifüj bakterisine 10.000 x g 5 dakika aktarın.</li>
	<li>Supernatant'ı çıkarın ve 1 mL steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Toplam 2 yıkama için bu yıkama adımını tekrarlayın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 10.000 x g'de numuneleri tekrar santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve 1,3 mL steril 1x PBS'de yeniden askıya alın.</li>
	<li>Yıkanmış kültürün 0,5 mL ile başlayarak, 10-1 ila 10 -4arasında 1x PBS bakteri seyreltmek.</li>
	<li>Bir spektrofotometre kullanarak, yıkanmış, seyreltilmemiş kültürün optik yoğunluğunu ve 600 nm 'deki dört seyreltmenin her birini ölçün (OD600).</li>
	<li>Adım 2.6 her seyreltme için 1x PBS 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. Her numunenin mililitre başına koloni oluşturan birim sayısını (CFU/mL) belirlemek için her seri için son 3 seyreltmenin 100°L'sini uygun katı ortama yayın. Plaka her seyreltme triplicate içinde.</li>
	<li>Plakaların oda sıcaklığında 5 dk. Uygun atmosferik koşullarda(E. cloacae: aerobik 37 °C, bir gecede inkübül plakaları) ters ve kuluçka yada kurumasını bekleyin; L. gasseri: 37 °C'de anaerobik, hava geçirmez bir kapta 48 saat boyunca anerobik hava poşetleri ile inkübasa plakaları (Bkz. Malzeme Tablosu).). NOT: 2,5 L kavanoz başına 1 anaerobik hava poşeti veya 7,0 L kavanoz başına 3 poşet kullanın (bkz. Malzemeler Tablosu).</li>
	<li>5 numunenin her biri için CFU/mL'yi belirlemek için plaka sayılarını kullanın (yani, seyreltilmemiş, 10-1,10-2, 10-3, 10-4). OD600 ile CFU/mL karşılaştırması için standart bir eğri oluşturun. Bu çizginin denklemi VlP-bakteri eki tahlillerinde OD600'edayalı CFU/mL'yi belirlemek için kullanılacaktır.</li>
</ol>3. VLP-bakteri Ek Teşp
DİkKAT: İnsan norovirüs VLP'leri biyogüvenlik seviyesidir (BSL)-2 tehlikesi vardır ve VLP'leri içeren tüm çalışmalar bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Ek tetkiklerinden önce bakteri kültürlerinin hazırlanması organizmaya uygun güvenlik koşulları kullanılarak yapılmalıdır.
<ol><li>Reaktif hazırlama<ol>
<li>1x fosfat tamponlu salin (PBS)<ol>
<li>1 L DI suda bir paketin tamamını eriterek 1 L 10x PBS hazırlayın.</li>
			<li>30 dk için otoklav çözeltisi.</li>
			<li>Yukarıdaki çözeltiyi 1:10'u DI suyunda seyrelterek 1x çözeltihazırlayın.</li>
			<li>Filtre, çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>%5 BSA<ol>
<li>%5 (w/v) çözeltisi oluşturmak için 100 mL PBS'ye 5 g büyükbaş serum albumin (BSA) tozu ekleyin.</li>
			<li>Çözeltiyi girdap yaparak veya bir karıştırma plakası üzerinde metal bir karıştırma çubuğu kullanarak kümeler eriyene kadar karıştırın.</li>
			<li>Filtre 0,22 μm filtre kullanarak sterilize.</li>
			<li>Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Akış sitometri leke tampon (FCSB)<ol>
<li>Filtre 0,22 μm filtre ile fcsb satın aldı (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
			<li>Kalan çözeltiyi 4 °C'de saklayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>%5 Engelleme Tamponu (BB) NOT: Her seferinde taze hazırlayın.<ol>
<li>10 mL steril FCSB'ye 0,5 g BSA ekleyin.</li>
			<li>Girdap tamamen örnek karıştırmak ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Antikor çekimi<ol>
<li>Konjuge insan norovirüs GII antikor (Malzeme Tablosubakınız) r-phycoerythrin ile (PE) üreticinin talimatlarına göre bir R-PE antikor etiketleme kiti kullanarak (Malzeme Tablosubakınız).</li>
		<li>VLP-bakteri eki tahlil analizinde ileride kullanılmak üzere konjuge antikorları karanlıkta 4 °C'de saklayın. NOT: Primer antikor, akış sitometrisi analizi için gerekli konsantrasyonu belirlemek için VLP-bakteri ek tahlillerinde kullanılmadan önce titre edilmelidir. Konjugasyon reaksiyonu her yapıldığında ve ek tahmında kullanılan her bakteri için antikor titrasyonu yapılmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Antikor titrasyonu<ol>
<li>Konjuge anti-insan norovirüs GII antikor 100 kat seyreltmek, 1:100 bir başlangıç seyreltme ve 1:600 bir bitiş seyreltme (toplam altı seyreltme).</li>
		<li>Aşağıdaki istisna dışında açıklandığı gibi bir virüs eki testi yapın: adım 3.5.7% 5 BB 350 μL bakteriyel pelet resuspend.</li>
		<li>Örneği yedi 50 μL aliquots'a bölün.</li>
		<li>Bir tüpe her antikor seyreltme 50 μL ekleyin.</li>
		<li>Lekesiz bir kontrol olarak yedinci tüpe %5 BB 50 μL ekleyin.</li>
		<li>Aşağıda açıklandığı gibi tüm örneklerüzerinde akış sitometrisi gerçekleştirin.</li>
		<li>Seyreltilmiş antikor örneklerini lekesiz kontrollerle ve birbirleriyle karşılaştırın. Daha sonraki tahlillerde kullanılmak üzere pozitif sinyalin azalmasına veya kaybına yol açan en düşük antikor konsantrasyonu seçilmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bakterilerin hazırlanması<ol>
<li>Bakteriler sabit fazda olana kadar uygun atmosferik koşullar altında uygun sıvı ortamda 40 mL bakteri büyümek.<ol>
<li>37 °C'de Luria Broth'ta bir gecede Aerobik E. cloacae kültürleri büyümek, sabit fazulaşmak için 200 rpm sallayarak.</li>
			<li>Sabit faza ulaşmak için 37 °C'ye kadar 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda sallayarak siyah vidalı kapak tüplerinde MRS suyu yla L. gasseri kültürleri yetiştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bakterileri peletlemek için 10 dk için 2.288 x g'de 50 mL konik tüpleri ve santrifüj örneklerini temizlemek için sabit faz kültürleri aktarın.</li>
		<li>13 mL steril 1x PBS'de süpernatantı çıkarın ve yeniden askıya alın. Toplam iki yıkama için bu yıkama adımını tekrarlayın.</li>
		<li>Numuneleri tekrar santrifüj edin, süpernatant'ı çıkarın ve 1x PBS'nin 20 mL'inde yeniden askıya alın. NOT: Hücre peleti küçükse, geri süspansiyon hacmi azaltılabilir.</li>
		<li>Kültürün OD600'ü ölçün.</li>
		<li>Daha önce hazırlanmış standart eğriyi kullanarak, yıkanan kültürün mL başına CFU'yu belirleyin.</li>
		<li>Kültür konsantrasyonu 1 x 108 CFU/mL'ye ayarlamak için bakterileri gerektiği gibi 1x PBS ile seyreltin.</li>
		<li>1 x 108 CFU/mL bakteri kültürünün 1 mL'sini gerekli sayıda 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın.</li>
		<li>Tüpleri 10.000 x g'de 5 dk santrifüj edin.</li>
		<li>Steril 1 mL%5 BSA'da bakteriyel peleti yeniden askıya alın.</li>
		<li>Tüpleri 37 °C'de sabit bir dönüşle 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Virüs eki<ol>
<li>Bir BSL-2 biyogüvenlik kabini içinde çalışırken, PBS'de yeniden asılı bakteri içeren her tüpe 10 μg HuNoV VLPs (Bkz. Malzeme Tablosu)ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. NOT: VLP konsantrasyonu her VLP hazırlığıile farklılık gösterir. Bu nedenle, bakterilere eklenen hacim hazırlama gruplar arasında değişir ve deneydeki her tüpe 10°G eklenecek şekilde buna göre ayarlanmalıdır. Bakteriler in yalnızca kontrolleri için (örneğin, VLP içermeyen numuneler), deneysel numunelere eklenen VLP hacmine eşit bir PBS hacmi ekleyin.</li>
		<li>37 °C'de 1 saat boyunca sürekli dönüşlü tüplerin kuluçkaya yatırın. NOT: Kuluçka sırasında 40 rpm'ye ayarlanmış bir tüp tabancası (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanılır.</li>
		<li>Kuluçkadan sonra numuneleri 10.000 x g'de 5 dk santrifüj edin.</li>
		<li>Supernatant atın ve PBS 1 mL bakteriyel pelet resuspend.</li>
		<li>Yıkama adımlarını 3.5.3 ve 3.5.4 olarak tekrarlayın.</li>
		<li>5 dakika için 10.000 x g de santrifüj örnekleri.</li>
		<li>Supernatant atın ve% 5 BB 150 μL bakteriyel pelet resuspend.</li>
	</ol></li>
	<li>Antikor boyama<ol>
<li>Taze %5 BB hazırlayın. NOT: Floresan etiketli antikor kullanılarak yapılan tüm çalışmalar karanlıkta yapılmalı ve antikor, BB ve FCSB buzüzerinde tutulmalıdır.</li>
		<li>Seyreltilmiş insan norovirüs GII antikor 1:125 E. cloacae örnekleri için ve 1:150 L. gasseri örnekleri için 5% BB, numune başına seyreltilmiş antikor 50 μL hazırlanması.</li>
		<li>İzotip antikoru, insan norovirüs GII antikorunun her bakteri için %5 BB oranında seyreltilmiş olması gibi seyreltin ve numune başına 50 μL seyreltilmiş isotip kontrolü hazırlanın.</li>
		<li>Her ek test numunesini 3,3.7 adımdan temiz 1,5 mL santrifüj tüplere aktararak üç 50°L'lik aliquots'a bölün.</li>
		<li>İlk örnek kümesine 50°L BB ekleyin. Bu küme lekesiz (Uns) denetimleri olacaktır.</li>
		<li>İkinci sete, GII antikor seyreltme 50 μL ekleyin. Bu e. cloacae için 1:250 ve L. gasseriiçin 1:300 son antikor konsantrasyonu ile sonuçlanır. Bu örnek kümesi lekeli (AB) numuneler olacaktır.</li>
		<li>Üçüncü sete seyreltilmiş isotip antikordan 50 μL ekleyin. Bu küme, İzotip denetimleri (IC) olacaktır. Pipetleme ile iyice karıştırın. 30 dakika boyunca buz ve karanlıkta örnekleri kuluçka.</li>
		<li>5 dk için 10.000 x g tüm örnekleri santrifüj.</li>
		<li>Supernatant'ı atın ve 100 μL FCSB'de numuneleri yeniden askıya alın.</li>
		<li>Tüm numuneleri 10.000 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın ve 100 μL FCSB'de numuneleri yeniden askıya alın.</li>
		<li>5 dk için 10.000 x g tüm örnekleri santrifüj.</li>
		<li>Supernatant'ı atın ve 150 μL FCSB'de numuneleri yeniden askıya alın.</li>
		<li>Her numuneyi toplam 550 μL hacim için 400 μL FCSB tampon içeren bir FCSB tüpüne aktarın.</li>
		<li>Numuneleri akış sitometrisi tarafından analiz edilene kadar 4 °C'de tutun. NOT: Akış sitometrisi antikor boyama 4 saat içinde yapılır.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Akış Sitometri
NOT: Aşağıda açıklanan gerilim ayarları, Malzeme Tablosu'nda listelenen akış sitometresine ve yazılıma dayanmaktadır ve büyük olasılıkla farklı akış sitometrelerine göre değişiklik gösterir. Ayarlar her bakteri için optimize edilmelidir. Tüm grafikler için eksenlerin biexponential fazda olduğundan emin olun.
<ol><li>Çalışma alanını ayarlama NOT: Çalışma alanını oluşturmak için kullanılan çizimleriçin kurulum, gating ve veri analizinde kullanılanlardan farklıdır. Çalışma alanını ayarlamanın amacı hücre popülasyonunu görselleştirmek, akış analizini etkileyebilecek bakteri hücrelerinin aşırı kümelenmesini sağlamak ve veriler toplanırken lekeli ve lekesiz hücreleri ayırt etmektir.<ol>
<li>Bakterilerin bir araya kümelenmediğinden emin olmak için bir dizi yoğunluk alanı ayarlayın.<ol>
<li>Toplam popülasyonu görselleştirmek için bir ileri dağılım alanı (FSC-A) ve yan dağılım alanı (SSC-A) oluşturun.</li>
			<li>Hem ileri (FSC-W) hem de yan dağılım genişliğini (SSC-W) ile iletme (FSC-H) ve yan dağılım yüksekliği (SSC-H) ile karşılaştıran iki grafik oluşturarak tek hücre ve hücre kümelerini değerlendirmek için çizimler ayarlayın.</li>
			<li>Yalnızca PE pozitif popülasyonu (PE-A vs. SSC-A) gösteren bir çizim oluşturun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Temel gerilimi E. cloacae için 500'e, L. gasseriiçin 340'a ayarlayın. Bunlar daha sonra düzeltilecektir.</li>
		<li>Sayılan toplam olayları 10.000 olaya ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri çalıştırma<ol>
<li>SSC-A, FSC-A veya PE-A'ya karşı çizilmiş sayıyı gösteren üç ayrı histogram çizimi oluşturun.</li>
		<li>Akış sitometresine lekesiz bir örnek yerleştirin ve SSC-A için histogramdaki maksimum tepenin 102 ila 103'te, FSC-A histogramındaki maksimum tepenin ise x ekseninde 104 ila 105 arasında olmasını sağlayarak örnek olaylarını elde edin. Değilse, zirveler belirtilen aralıklara düşmez, FSC ve SSC gerilimlerini buna göre ayarlayın.</li>
		<li>Akış sitometresine lekeli bir örnek (AB) yerleştirin ve x ekseninde maksimum tepe noktası olan 103'ü geçmek için PE gerilimini ayarlayın.</li>
		<li>Bu ölçümlere dayanarak, pozitif PE kapısını ayarlayın ve geçidi PE-A ile SSC-A yoğunluk grafiğine ayarlayın.</li>
		<li>Tüm örnekleri belirlenen ayarların altında düşük veya orta hızda çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li>
<li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li>
<li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li>
<li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017(2016).</li>
<li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699(2016).</li>
<li>Rodríguez-Díaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559(2017).</li>
<li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li>
<li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li>
<li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li>
<li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768(2017).</li>
<li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li>
<li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li>
<li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
<li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009(2019).</li>
<li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659(2015).</li>
<li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607(2019).</li>
<li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li>
<li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li>
<li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li>
<li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GII.4+Human+Norovirus%3A+Surveying+the+Antigenic+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li>
<li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).</li>
<li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li>
<li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586(2014).</li>
<li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles%2C+the+small+P+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yok.

Enterik virüslerin bakterilere bağlanmasını ölçebilme yeteneği, bu bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirme mekanizmalarını açıklamak için kritik bir ilk adımdır. Burada açıklanan yöntemler hem E. cloacae (gram-negatif bakteri) hem de L. gasseri (gram-pozitif bakteri) ile insan norovirüs VLP etkileşimlerini ölçmek için optimize edilmiştir, ancak herhangi bir memeli virüsü ve ilgi bakterisi ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. VLPs ek tahlillerde kullanılmak üzere virüs ...

İnsan norovirüsler (HuNoVs) gastrointestinal hastalığın dünya çapında önde gelen nedeni, 685 milyon enfeksiyonlar ve 200.000 üzerinde ölümher yıl1sorumlu. Diğer enterik virüsler gibi, kommensal bakterilerin varlığı bu patojen enfeksiyonu geliştirmek için gösterilmiştir yanı sıra onun vekil virüs, murine norovirus2,3. Ayrıca bakterilerin insan norovirüs4,5,5,6tarafından enfeksiyonu inhibe edebilir çelişkili raporlar vardır. Çeşitli virüsler için, virüs ve bakteriler arasındaki doğrudan etkileşim viral enfeksiyon etkileyen mekanizmaların altında yatan görünür2,7,8,9,10, ve insan norovirüsler bakterilerin yüzeylerine doğrudan bağlamak elektron mikroskopisi ile gösterilmiştir11,12. Bu nedenle, bu etkileşimleri karakterize hangi bakteri viral enfeksiyon etkisi mekanizmaları belirlemek için kritik hale gelmiştir. Bu karakterizasyon klasik konak mikrobiyombileşenleriolan bakteri türlerinin bir dizi viral bağlayıcı niceleme ile başladı7 ,12,13. Bu eki tahliller sadece bakteri bağlı virüs miktarını ortaya çıkarmak değil, aynı zamanda viral fitness ve hayatta kalma bu etkileşimin etkisini belirlemede yardımcı.
Viral eki ölçmek için, geleneksel olarak kullanılan yöntemler viral genomlar ölçmek PCR tabanlı tahliller içerir12 veya radyoetiketli virüs üretimi ve viral parçacıklar ölçmek için sintillation sayma kullanımı7,8,9,13. Bu yöntemlerin kullanımı genellikle yüksek titer virüs stokları ve bunları oluşturmak için in vitro ekim teknikleri erişim gerektirir. İnsan norovirüs için çeşitli kültür sistemleri şimdi var iken2,14,15, hiçbiri kısıtlar veya pcr ve sintillation kullanımını ortadan kaldırır bu son derece konsantre stokları oluşturmak için gerekli sağlam çoğaltma desteği insan norovirüs / bakteriyel etkileşimleri ölçmek için sayma.
Bu sorunu aşmak için, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) insan norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri araştırmak için virüs yaşamak için bir vekil olarak kullanılabilir16,17. VLP'ler, türetildiği virüse yakından benzeyen enfeksiyöz olmayan parçacıklardır. İnsan norovirüs durumunda, bu parçacıklar VP1 (ve bazen VP2) protein, kendi kendine genetik malzeme (yani, Noroviruses için RNA) eksik bozulmamış viral kapsidler oluşturmak için monte ifadesi oluşturulur. Bu VLP'ler iyi karakterize edilmiştir, yapısal ve antijektolojik olarak onlar türetilmiştir hangi vahşi tip virüsler benzer18,19,20,21,22,23. Bu nedenle, VLPs insan norovirüs ve kommensal bakteriler arasındaki yüzey etkileşimleri araştırmak için ideal bir vekil olarak hizmet vermektedir. VLP'lerin genetik materyalden yoksun olduğu göz önüne alındığında, PCR tabanlı testler viral bağlanmayı ölçmek için kullanılamaz. Antikor bazlı akış sitometri yöntemi daha önce tanımlanmış ve yarı-nicel bir şekilde bakterilere bağlama VLP bağlama düşük seviyelerde tespit edebiliyoruz16. Bu yöntem, hem gram-negatif hem de gram-pozitif kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP'nin doğru nicelemesi için optimize edilerek optimize edildi16.

<table><tbody><tr><td>Hücre Süzgeç Kapaklı 5ml Polistren Yuvarlak Tabanlı Tüpler</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Antikor boyamadan sonra, numune akış sitometrisi analizi için tüplere aktarılır.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A7002</td><td>Ortam hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>AnaeroPack</td><td>Thermo Scientific</td><td>R681001</td><td>Lactobacillus gasseri kültürü için kullanılan anaerobik gaz paketi</td></tr><tr><td>BD FacsDiva yazılımı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa akış sitometresi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP1605</td><td>Akış sitometrisi için kullanılır</td></tr><tr><td>Akış Sitometrisi Leke Tamponu (FCSB)</td><td>BD Biosciences</td><td>554657</td><td>Akış sitometrisi</td>,</tr><tr><td>Fare, IgG2b, kappa İzotip Kontrolü (eBMG2b), PE, eBioscience,</td><td>Thermo Fisher, Scientific</td><td>12473281</td>, <td>İzotip kontrolü için kullanılır. Bu antikor, üreticiden konjuge formda satın alınır.</td></tr><tr><td>MRS Powder</td><td>BD Biosciences</td><td>288130</td><td>Besiyeri hazırlama ve Lactobacillus gasseri'yi kültürlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Norovirüs kapsid G2 Monoklonal Antikor (L34D)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-18241</td><td>Norovirüs GII antikoru. Bu antikor sadece konjuge olmayan formda mevcuttur ve bu nedenle belirtilen akış sitometrisi tahlillerinde kullanılmadan önce floresan olarak konjuge edilmelidir. Bu protokolde, PE seçilen flordu, ancak diğer floresan molekülleri, araştırmacı tarafından kullanılan akış sitometresine en uygun şekilde seçilebilir.</td></tr><tr><td>Norovirüs GII.4 VLP</td><td>Yaratıcı Biyoyapı</td><td>CBS-V700</td><td>insan norovirüs virüsü benzeri parçacık, VLP'ler bakulovirüs sistemi kullanılarak üretildi ve %10 gliserol ile fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse edildi. Yazarlar, VLP'lerin parçacık konsantrasyonunu belirlemek için bağımsız nanosight izleme analizi gerçekleştirdiler. Konsantrasyon, mililitre başına yaklaşık 1011 VLP'dir. VLP'lerin protein konsantrasyonuna bağlı olarak, VLP bağlanma deneylerinde bakteri başına yaklaşık 200 parçacık eklenir.</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP665</td><td>Kullanmadan önce 1X'e kadar seyreltin.</td></tr><tr><td>SiteClick R-PE Antikor Etiketleme Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S10467</td><td>Konjuge olmayan antikorun lablenasyonu için kullanılan konjugasyon kiti.</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td>Ortam hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Oksoit</td><td>LP0042</td><td>Ortam hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Tüp Revolver</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88881001</td><td>Virüs: bakteri bağlanma tahlilinde kullanılır. Maksimum hıza (40 rpm) ayarlayın.</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td>Ortam hazırlama için kullanılır</td></tr></tbody></table>

akış sitometrikullanarak commensal bakterilere bağlanan İnsan norovirüs benzeri partiküllerin Ölçülmesi

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Kommensal bakteriler ökaryotik virüslerin enfeksiyonunu etkilemek için iyi kurulmuştur. Patojen ve konak mikrobiyom arasında doğrudan bağlanma bu virüslerin çoğu için enfeksiyon değiştirme sorumludur. Bu nedenle, virüs-bakteri bağlanmasının doğası nın karakterize ilerlediği, bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirdiği mekanizmanın (lar) aydınlatılabilmek için gerekli temel bir adımdır. Insan norovirüs için, kommensal bakteriler B hücre enfeksiyonu geliştirmek. Virüs doğrudan bu bakterilere bağlanır, bu doğrudan etkileşim enfeksiyon geliştirme mekanizması nda yer aldığını gösteren. Radyoetiketli virüslerin sinilasyon sayımı ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dahil olmak üzere bakteri ve virüsler arasındaki etkileşimleri ölçmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Her iki yöntem de laboratuvarda oluşturulması gerekebilir canlı virüs, kullanımını gerektirir. Şu anda, insan norovirüs için mevcut kurulan in vitro kültür sistemlerinin hiçbiri son derece konsantre viral stokların üretimi için izin vermek için yeterince sağlam. Canlı virüs yerine, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri karakterize etmek için kullanılmıştır. Burada bir akış sitometri yöntemi gram-negatif ve gram-pozitif bakterilere VLP bağlayıcı ölçmek için virüs özgü antikorlar kullanır ile açıklanmıştır. Sadece bakterilerin ve izotip kontrollerinin dahil edilmesi, arka plan antikor bağlanmasını ve TEST EDILEN bakterilere VLP ekinin doğru nicelemeyi azaltmak için tahminin optimizasyonuna izin ver. Yüksek VLP:bakteri oranları VLP'lerin bakteri popülasyonunun büyük yüzdelerine bağlanmasına neden olur. Ancak, VLP miktarları azaldığında, bakterilerin yüzde bağlı da azalır. Sonuç olarak, bu yöntem norovirüs düzenleyen belirli koşulları ve yapısal bileşenleri açıklığa kavuşturan gelecekteki deneylerde kullanılabilir: bakteri etkileşimleri.

Kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP'yi ölçmek için kullanılan gating stratejileri Şekil 1'degösterilmiştir. Temsili yoğunluk nokta, hücresel enkaz ve hücre kümelerini ortadan kaldırmak için numunelerin nasıl geçitlendiğine genel bir bakış sağlar, böylece VLP eki tekli popülasyonlarda belirlenir(Şekil 1A). Temsili histogramlar, sadece norovirüs VLP'si olmayan bakterilerde düşük anti-norovirüs antiko...

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Virüs-bakteriyel etkileşimler başarılı viral enfeksiyon ve bir konak bağışıklık yanıtı stimülasyonu için önemli olabilir. Ama şu anda, son derece konsantre ve insan norovirüs saf stok laboratuvarda üretilemez. Bu teknik, virüs benzeri parçacıklar veya canlı virüs mevcut olan bakterilere bağlanan herhangi bir virüs ile kullanılabilir.Bu virüsler ve bakteriler arasındaki etkileşimleri ölçmemizi sağlar. Doğrudan dondurulmuş gliserol stokbir agar plaka enterobacter cloacae tek bir izole koloni ile sıvı orta beş mililitre aşılamak. Bakterileri bir gecede büyütün.Ertesi gün, iki ayrı 1,5 mililitre santrifüj tüpler içine kültürün 1.3 mililitre aliquots aktarın. Tüpleri 10, 000 x g'de beş dakika santrifüj edin. Süpernatantları çıkarın, ardından her yıkama için bir mililitre steril 1X PBS kullanarak numuneleri iki kez yıkayın.Örnekleri tekrar 10, 000 x g'da beş dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve steril 1X PBS 1.3 mililitre pelet resuspend. Yıkanmış kültür 0,5 mililitre ile başlayarak, 1X PBS'deki bakterileri 10'dan eksi 10'a eksi 10'dan eksi dörde kadar seri olarak seyreltin.Bir spektrofotometre kullanarak, yıkanmamış kültürün optik yoğunluğunu ve her dört seyreltmenin her birini 600 nanometrede ölçün. Önceki seyreltmelerin her biri için 1X PBS'de 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. Her örnek için mililitre başına koloni oluşturan birimlerin sayısını belirlemek için her seri için son üç seyreltme 100 mikrolitrea agar plakaları üzerine yayın.Tabakların oda sıcaklığında beş dakika kurumasını bekleyin. Plakaları ters çevirin ve kuvöze yerleştirin. El yazmasında açıklandığı gibi reaktifler, antikorlar ve bakteriler hazırlandıktan sonra tüm malzemeleri BSL-2 biyogüvenlik kabininde bir araya getirin.İnsan norovirüs için virüs benzeri parçacıklar BSL-2 patojenleri olarak listelenir ve VLP kullanılarak yapılan tüm çalışmalar sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Her bakteri tüpüne 10 mikrogram insan norovirüs VLP'si ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Tüpleri 37 santigrat derecede sabit rotasyonla bir saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra tüpleri 10,000 x g'de beş dakika santrifüj edin. Aspire ve supernatant atın ve PBS bir mililitre bakteriyel pelet resuspend. Yıkama adımlarını bir kez tekrarladıktan sonra tüpleri 10,000 X g'de beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın ve% 5 engelleme tampon 150 mikrolitre VLP-bakteri pelet resuspend. Oluşan yaygın bir hata tüplertakas ve yanlış tedavi eklenir olmasıdır. Bunu önlemek için, doğru tedaviye karşılık gelen satırlarda tüm tüpleri düzenlemek ve tüplere aynı anda bir tedavi ekleyin.Her bakteri örneği için, seyreltilmiş insan norovirüs GII antikor 50 mikrolitre hazırlamak. %5 engelleme tamponu kullanarak, E.cloacae örnekleri için antikor 1 ila 125 seyreltin. Aynı seyreltme oranlarını kullanarak her bakteri örneği için seyreltilmiş isotip antikor 50 mikrolitre hazırlayın.Her ek test numunesini temiz 1,5 mililitrelik santrifüj tüplere aktararak 350 mikrolitrelik aliquots'a bölün. Lekesiz kontroller oluşturmak için, her bakteri örneğinden ilk aliquot için engelleme tampon 50 mikrolitre ekleyin. Lekeli numuneler için, ikinci aliquot setine 50 mikrolitre GII antikor seyreltme ekleyin.Üçüncü aliquot setine seyreltilmiş isotip antikorunun 50 mikrolitresini ekleyerek iyotip kontrollerini oluşturun. Tüm örnekleri buzda ve karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra beş dakika boyunca 10, 000 X g tüm örnekleri santrifüj.Süpernatantları atın ve her numuneyi 150 mikrolitre FCSB'de yeniden askıya alın. Yine, beş dakika boyunca 10, 000 X g tüm örnekleri santrifüj. Yine, supernatants atın ve FCSB 100 mikrolitre örnekleri resuspend.Numuneleri son bir kez santrifüj ettikten ve süpernatantları attıktan sonra, fcsb'nin 150 mikrolitresinde numuneleri yeniden askıya alın. Her numuneyi toplam 550 mikrolitre hacim için 400 mikrolitre FCSB içeren bir tüpe aktarın. Numuneleri akış sitometrisi tarafından analiz edilene kadar 4 derece santigrat derecede saklayın.VLP eki akış sitometrisi kullanılarak ölçüldü. İlk olarak, yoğunluk arazileri hücresel enkaz dışarı kapı için kullanılan, bakteriyel doublets ve hücresel kümeleri kaldırmak için sonraki nokta arsa gating izledi. Temsili histogramlar, sadece bakteri örneklerinde PE sinyali eksikliği ni ve VLP:bakteri örneklerinde lekesiz ve isotip kontrollere göre PE sinyal yoğunluğunda bir kayma olduğunu göstermektedir.10 mikrogram VLP ile bir saatlik kuluçkadan sonra akış sitometrisi hem E.colacae hem de L.gasseri'ye bağlanan parçacık tespit etti. Bu teşp için bağlayıcı nicelik sınırını belirlemek için, bakterilere ilave edilmeden önce VLP'lerin seyreltme serisi oluşturulmuştur. VLP miktarındaki azalmalar, VLP ile sınırlanan bakterilerin yüzdesine karşılık gelen azalmalarla sonuçlandı.Virüsün bakteri oranını bilmek ve deneyler arasındaki oranı tutarlı tutmak sonuçların yorumlanmasında önemlidir. Bakteriyel ve viral mutantlar özellikle bu etkileşim aracılık mikrobiyal yüzey yapılarını belirlemek için oluşturulabilir. Bu teknik, araştırmacıların virüs genotipindeki değişikliklerin, bakteriyel büyüme koşullarının ve bakteri yüzey yapılarındaki değişikliklerin viral bağlanmayı nasıl değiştirdiği de dahil olmak üzere norovirüs-bakteriyel etkileşimleri etkileyen durum ve koşullarla ilgili soruları yanıtlamalarına olanak tanır.

quantifying-human-norovirus-virus-like-particles-binding-to-commensal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Source: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (2017)The video demonstrates a protocol for monitoring the heat-induced aggregation of virus-like particles using dynamic light scattering (DLS). It begins with preparing a monodisperse suspension of purified particles. The sample is then loaded into a preheated DLS instrument. As the capsid proteins denature with heat, exposed hydrophobic regions cause particle...

Tracking Aggregation of Virus-Like Particles Using Dynamic Light Scattering

Bu video, vitronektinin bakteriyel yüzey proteinleri ile etkileşiminin tespitini göstermektedir. Akış sitometrisi analizi, vitronektine bağlı floresan etiketli antikorların floresan sinyalini ölçer ve bakteri yüzeyindeki varlığını doğrular. Bu teknik, konak-patojen etkileşimleri ve potansiyel bakteriyel enfeksiyon tedavileri hakkında bilgi sağlar.

Vitronektinin Bakteri Yüzeylerine Bağlanmasının Flow Sitometri Kullanılarak Tespiti

Bu video, insan bağırsak bakterilerine bağlanan insan norovirüs virüsü benzeri parçacıkların (VLP'ler) miktarını belirlemek için bir testi göstermektedir. Bakteriyel süspansiyonlar VLP'lerle karıştırılır ve VLP-bakteri komplekslerinin oluşumuna izin vermek için inkübe edilir. Kompleksler daha sonra florofor etiketli VLP'ye özgü antikorlarla etiketlenir, ardından VLP'ye bağlı bakterilerin yüzdesini belirlemek için akış sitometrisi tabanlı görselleştirme ve miktar tayini yapılır.

İnsan Norovirüs VLP'lerinin Bağırsak Bakterilerine Bağlanmasını Ölçmek İçin Bir Test

Burada, Buffalo Green Monkey böbrek hücresi hattını kullanarak toplam kültürlenebilir virüsleri ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Prosedür, çevresel ve içme sularında bulaşıcı virüslerin oluşumunu ölçmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

Burada, ters transkripsiyon-kantitatif PCR kullanarak çevresel ve içme sularında enterovirüs ve norovirüsü ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. EPA Metodu 1615'ten alınan bu standardize prosedürle yeraltı sularından ortalama virüs geri kazanımı, poliovirüs için %20 ve murin norovirüsü için %30 idi.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

İnfluenza A virüsünün A549 hücrelerine bağlanmasını ve ayrıca virüs partiküllerinin akış sitometrisi ile hedef hücrelere içselleştirilmesini ölçmek için yarı kantitatif bir yöntemi tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Burada, ifade ve E. (P) etki çıkıntılı yüksek kaliteli Norovirus arındırmak için bir yöntem tarif E. coli X-ışını kristalografisi çalışmalarında kullanılmak üzere. Bu yöntem, diğer calicivirüs P etki, hem de yapısal olmayan proteinleri de uygulanabilir, yani., Virüs protein genom bağlı (VPg), proteaz ve RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp).

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

Virüsler veya hücre dışı veziküller, yüzey antijenlerini tanıyan antikorlara bağlı 15 nm manyetik nanopartiküller ile immüno-yakalandı. Yakalanan virionlar veya veziküller, diğer yüzey antijenlerine karşı floresan antikorlarla etiketlendi. Elde edilen kompleksler yüksek manyetik alanda ayrıldı ve floresan üzerinde tetiklenen geleneksel akış sitometreleri ile analiz edildi.

Virionlar antijenik Spectra ve ekstrasellüler veziküllerin Analiz Virometry Akış

Çevresel sert yüzeylerde norovirüsün tespiti ve miktarının belirlenmesi için makro köpük tabanlı bir örnekleme metodolojisi geliştirilmiş ve değerlendirilmiştir.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Keşfedin akış sitometrisi kullanarak insan norovirüs benzeri partiküllerin kommensal bakterilere bağlanmasını ölçme yöntemini. Bu teknik canlı virüs gerektirmeden virüs-bakteri etkileşimlerini nicelendirmeyi sağlar.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet