Name: Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin, rekombinant vaccinia virüslerinin hızlı ve iz bırakmadan üretimi için konak aralığı seçimi ve floresan belirteçleri kullanmayı. Bu yöntem, aşı geliştirme ve gen ifadesi çalışmaları için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI114851) tarafından SR'ye finanse edilmiştir.

1. Rekombinasyon vektörü oluşturma
<ol><li>Seçim kasetini oluşturmak için astarlar tasarlayın. Birkaç online astar tasarım araçları herhangi birini kullanarak, aynı zamanda Gibson montaj olarak adlandırılan DNA moleküllerinin izomal enzimatik montaj kolaylaştırmak için komşu amplicons ve vektör ile örtüşen dizileri ile her bir amplicon tasarım. NOT: Bu protokol geleneksel kısıtlama endonükleaz bazlı klonlama yöntemleri kullanılarak da tamamlanabilir. Bu durumda, çakışan diziler yerine uygun kısıtlama siteleri ile tasarım astarları.</li>
	<li>1.1 adımda tasarlanan astarları kullanarak, PCR aşağıdaki elementleri 5' ila 3'(Şekil 1):~500 e3L (5' kol), EGFP veya ilgi geninin VACV genomik bölgesi5' nükleotitleri sırasına göre yükseltin, ~150 nükleotit VACV genomik bölgeden hemen 3' E3L (kısa 3' kol), sentetik bir erken / geç poxvirüs organizatörü25,mCherry-E3L füzyon geni, ve ~ 500 nükleotitler VACV genomik bölge 3' kısa 3'kol (uzun 3' kol dahil olmak üzere VACV genomik bölge 3'.<ol>
<li>Bir PCR tüpünde, reaktifleri her amplicon için aşağıdaki sıraya ekleyin: 17 μL DNase serbest su, her astar1,2 μL (başlangıç konsantrasyonu = 10 μM, son konsantrasyon = 0,5 μM), 5 μL 5x PCR reaksiyon tamponu, şablon DNA (plazmidlerden güçlendirilmiş ampliconlar için 10 ng: EGFP ve E/L promotör-mCherry-E3L kaset; viral genomik DNA'dan güçlendirilmiş ampliconlar için 100 ng: 5' ve 3' kollar) ve 0,5 μL DNA polimeraz. Son reaksiyon hacmi 50°L olarak eklenen suyun hacmini ayarlayın. NOT: Şablon DNA konsantrasyonu ampirik olarak belirlenmelidir, ancak genellikle 10 ng/reaksiyon la başlarız.</li>
		<li>Tüpü bir termocycler yerleştirin ve DNA'yı 98 °C'de 30 s'de eritin ve ardından üç adımlı PCR protokolünün 25 mermisini kullanın: 5 s için 98 °C, 10 s için 55 °C ve 1 dk için 72 °C. NOT: Her astar seti için üreticinin önerdiği Tm'ye göre erime sıcaklığını belirleyin. Her amplicon (1 dakika/kb) uzunluğuna göre uygun uzatma süresini belirleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplifikasyon ürünlerini %1 agarose jel üzerinde görselleştirin. Her bir DNA ürününden 10 μL ve her kuyuya 2 μL yükleme tamponu ekleyin ve 8 V/cm'de 1 saat çalıştırın.</li>
	<li>Jel bir DNA jeli çıkarma kiti ve üreticiprotokolü kullanarak her amplicon arındırMak. 50 μL DNase serbest su ve hemen santrifüj ekleyerek sütundan amplicons elute.</li>
	<li>EcoRI enonukleaz sindirimi kullanarak pUC19 klonlama vektörü doğrusallaştırın. Bir tüpe 1 μg pUC19, 17 μL hacimde su, 2 L reaksiyon tamponu ve 1 μL (20 birim) EcoRIekleyin. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>Amplifikasyon ürünlerini 8 V/cm'de %1 agarose jel üzerinde görselleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir ana karışım kiti kullanarak tüm bireysel, jel saflaştırılmış amplicons ve doğrusalvektör ligate.<ol>
<li>Bir PCR tüpüne 0,2 pmol doğrusallaştırılmış pUC19 ve her amplicon (5' kol, EGFP, kısa 3' kol, E/L promotör-mCherry-E3L kaset, 3'kol) ekleyin. DNase serbest suyu 10 μL'lik son bir hacme ekleyin ve ardından 10 μL DNA montaj ana karışımı ekleyin. 50 °C'de 1 saat boyunca kuluçka örnekleri.</li>
	</ol></li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi adım 1.6 dan monte ürünün 2 μL ile kimyasal yetkili E. coli dönüştürün26,27. 100 μg/mL ampisilin içeren LB agarose plakaları üzerindeki dönüştürülmüş hücrelerin 100 μL plakası. Plakaları bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>İyi izole edilmiş kolonileri seçin ve 100 μg/mL ampisilin içeren Luria suyu içeren tüplere ayrı kolonileri aktarın. Tüpleri gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve 225 rpm'de titreyin.</li>
	<li>Plazmidleri plazmid miniprep kiti kullanarak gece kültüründen izole edin. Spektrofotometre kullanarak DNA'nın konsantrasyonu ve saflığını kontrol edin. 1.8 ile 2.0 arasında a260/A280 oranı kabul edilebilir.</li>
	<li>İstenilen klonlama üründoğru olup olmadığını belirlemek için Sanger sıralama için plazmidler gönderin. DNA'yı -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Rekombinant virüs oluşturma
<ol><li>6 kuyulu bir plakada 1.0 (MOI = 1.0) enfeksiyonun çokluğuyla yeniden biraraya getirilecek virüsile uygun hücrelerden oluşan bir monotabakası enfekte edin. Enfekte hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra orta aspire ve taze DMEM ile değiştirin. Enfekte hücreleri 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın. NOT: K3L22yoksun bir vaccinia virüs gibi çoğaltma yetkili virüsler için, Avrupa tavşan böbrek hücre hattı RK13 (ATCC #CCL-37) veya BSC-40 gibi bir hücre hattı uygundur. Ancak, çoğaltma eksik virüsler için, bu makalede hem PKR antagonistleri E3L ve K3L yoksun virüs gibi, trans veya PKR knock-down veya knock-out hücreleri bu iki gen ifade tamamlayıcı bir hücre hattı gereklidir.</li>
	<li>Üreticinin protokolünü izleyerek ticari olarak kullanılabilen bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 1.10 adımda oluşturulan ve doğrulanmış vektörün 500 ng'si ile enfekte hücreleri dönüştürün. Hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 48 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Hem E3L hem de K3L'den yoksun bir vaccinia virüsü kullanıyorsanız, PKR aracılı selektif basınç yeniden birleştirilmiş virüslerin seçilmesini sağlayacak ve bu hücrelerde mCherry-E3L füzyon proteininin ekspresyonunu koruyacaktır. İstenirse, tüm plazmid yerine transfeksiyon için kullanılacak sadece kesici uç pcr yükseltmek de mümkün olmalıdır.</li>
	<li>Enfeksiyondan 48 saat sonra, enfekte monolayer'ı hasat edin. Bazı durumlarda, hücreler pipetleme ile hasat edilebilir, ancak hala sıkıca yapıştırılır, bir hücre kazıyıcı ile hasat. Hücreleri üç kez dondurun ve %50 genlikte 15 s'ye sonicate edin. Kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Seri olarak 10 kat seyreltin adım 2.3 10-10 -6 -6 1080 μL DMEM (10-1)için lysate 120 μL ekleyerek ve daha sonra dmem 1080 μL (10-2), ve bu dört kez daha tekrarlayarak bu seyreltme. Bu durumda RK13 hücrelerinin bir PKR yetkili hücre hattının bir birey, confluent iyi her seyreltme 1 mL ekleyin.<ol>
<li>Enfekte hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra ortamı aspire edin ve enfekte hücreleri 37 °C ve %5 CO2'detaze DMEM Kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Enfeksiyon sonrası 24 ila 48 saat, floresan mikroskopi ile rekombinant virüsleri tanımlayın. Rekombinant virüslerden gelen plaklar mCherry-E3L füzyon geninin entegrasyonu nedeniyle kırmızı floresanifade eder (Şekil 2). Başlangıçta PKR inhibitörlerinden yoksun bir virüs kullanılmışsa, tüm plaklar rekombinant virüs içerecektir.</li>
	<li>Plak RK13 hücrelerinde rekombinant virüsleri üç kez arındırın. Plak arınması son turdan sonra, tüm plaklar kırmızı floresan ifade etmelidir.</li>
	<li>VACV PKR inhibitörleri E3L ve K3L (RK13+E3L+K3L hücreleri28)ifade eden rk13 hücrelerinin bir confluent 6-iyi plaka enfekte adım 2.6 plak saflaştırılmış kırmızı floresan virüs ile. Her kuyuda yaklaşık 50-100 plak hedefleyin. NOT: Bu hücreler trans VACV PKR antagonistleri sağlamak ve mCherry-E3L füzyon geni korumak için PKR aracılı seçici basınç hafifletmek, böylece rekombinant virüsün "scarless" nesil teşvik.</li>
	<li>EVOS2 mikroskobu ve GFP filtre küpü (Uyarma: 470/22, Emisyon: 525/50) ve RFP filtre küpü (Ekscb: 531/40, Emisyon: 593/40) kullanarak çökmüş virüsleri tanımlayın. NOT: MCherry-E3L füzyon geninin kaybolma sıklığı yaklaşık %2.5 'dir(Tablo 2). EGFP bir marker geni olarak dahil edilmezse, mCherry-E3L füzyon genini kaybetmiş mutant virüslerden gelen plaklar renksiz olacaktır.</li>
	<li>Plak, RK13+E3L+K3L hücrelerinde üç kez sadece yeşil (VC-R4) veya renksiz plakları (E3L) arındırır. Hiçbir plak floresan kırmızı emin olun.</li>
	<li>MCherry-E3L kaybını ve PCR ve Sanger dizilimi ile beklenen mutasyonun varlığını doğrulayın. NOT: İlgide pkr inhibitör aktivitesi yoksa RK13+E3L+K3L hücrelerinde veya eşdeğer PKR inhibitlü veya PKR eksik hücre hattında rekombinant virüsler yetiştirilmelidir(Şekil 3).</li>
</ol>

<ol><li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li>
<li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies%3B+a+link+between+Jenner+and+Pasteur%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li>
<li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+Poxviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+virology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li>
<li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li>
<li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li>
<li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxviruses+as+vaccine+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Immunology%2C+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li>
<li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li>
<li>Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li>
<li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus%3A+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li>
<li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+vaccinia+virus%3A+demonstration+of+marker+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li>
<li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li>
<li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li>
<li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccinia+Virus+and+Poxvirology%22%5BJournal%5D)">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li>
<li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li>
<li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1%3A+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li>
<li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects%3A+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li>
<li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+%28eIF2%29+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li>
<li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+eIF2%CE%B1+kinases%3A+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+of+the+Protein+Synthesis+Machinery+and+Its+Regulation%22%5BJournal%5D)">Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li>
<li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li>
<li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced%2C+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li>
<li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3%3A+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li>
<li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li>
<li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li>
<li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-Specific+Host-Virus+Interactions%3A+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li>
<li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact%2C+synthetic%2C+vaccinia+virus+early%2Flate+promoter+for+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+%28recombinant+DNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li>
<li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA%2FDHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465(2013).</li>
<li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li>
<li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li>
<li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Burada son rekombinant virüs yabancı DNA tutmadan rekombinant vaccinia virüsleri oluşturmak için geçici bir marker seçim stratejisi 32 bir varyasyonu sıyoruz. Stratejimiz, antibiyotikler gibi diğer seçici basınç biçimleri yerine ev sahibi antiviral protein PKR aracılığındaki seçici basıncı kullanır. Konak antiviral genlerin kullanımı hücrelerde kimyasal kaynaklı fenotipik değişiklikler olasılığını ortadan kaldırır, ya da seçim ilaçları nedeniyle mutasyon riskinin artması. Ayrıca, ilaç seçiminden f...

Vaccinia virüsü (VACV) bir insan patojeni ilk başarılı eradikasyon için aracı oldu, variola virüsü (VARV), doğadan. Variola virüsünün yok edilmesinden bu yana, VACV dahil olmak üzere poxviruses hem insan hem de hayvan tıbbı için yararlı terapötik virüsler olmaya devam edilmiştir. Örneğin, bir VACV tabanlı kuduz virüsü aşısıAvrupa'da sylvatic kuduz bulaşmasını önlemede çok etkili olmuştur 1 ve Amerika Birleşik Devletleri2. Daha yakın zamanda, anti-tümör molekülleri çeşitli ifade rekombinant poxviruses (örneğin, tek zincirli antikorlar veya insan eritropoietin) onkolitik ajanlar olarak teşvik başarı gördük3,4,5. VACV genetik manipülasyon için kolayca münasip olduğu için bir vektör olarak özellikle çekici, geniş bir konak aralığına sahiptir, ve çeşitli koşullar altında istikrarlı, alanında kolay ulaşım ve aşı canlılığı sağlayan6,7. Laboratuvar deneyleri ve aşı üretimi için rekombinant VACV üretmek için birden fazla teknik geliştirilmiş olsa da, bu virüsleri üretmek için mevcut stratejiler önemli sınırlamalar vardır.
VACV'un yararı nedeniyle, rekombinant virüsler oluşturmak için birden fazla strateji geliştirilmiştir. İlk strateji, transgen ve antibiyotik direnç geni gibi seçilebilir marker geni içeren bir kaset tanıtmak için homolog rekombinasyon kullanır. Kaset iki ~ 500 nükleotit (nt) veya daha büyük kollar viral genom, daha sonra stably çift crossover olaylar8,9,10ile entegre belirli bir siteye gen yönlendiren çevrilidir. Bu strateji hızlı ve verimlidir; ancak, beklenmeyen etkilere neden olabilir marker geni şeklinde ekstra genetik malzeme ile sonuçlanır. Ayrıca, mevcut benzersiz seçilebilir belirteçlerin sayısı ile sınırlı olarak tanıtılabilir transgen lerin sayısı için pratik bir üst sınır vardır. Geçici baskın seçilim (TDS) stratejileri "scarless" rekombinant virüslerin oluşumunu kolaylaştırarak bu sorunu ele almış11. Bu strateji kullanılarak, mutant VACV geni ve seçilebilir marker geni içeren bir plazmid viral genoma entegre edilmiştir, ancak vacv DNA'sını ekleyen bir kanaat olmadan. Bu yaklaşım, tek bir crossover olayı ile bütünleşme sonucunda VACV geninin tamamının geçici entegrasyonu ve çoğaltılması ile sonuçlanır. Bu ara, seçim baskısı altında muhafaza edildiği sürece stabildir ve bu yapının zenginleşmesine izin verilir. Seçim kaldırıldığında, VACV çoğaltma yaklaşık 50:50 oranında yabani tip (wt) veya rekombinant virüsün plazmid ve sonraki oluşumunun kaldırılması ile sonuçlanan ikinci bir crossover olay sağlar. TDS yabancı DNA'nın istikrarlı bir şekilde piyasaya sürülmesini gerektirmeden rekombinant virüsler üretirken, birden fazla virüs klonu, potansiyel olarak zaman alıcı ve maliyetli bir adım olan dizianalizi ile beklenen mutasyon için taranmalıdır.
Burada, bu yaklaşımların her birinin en iyi yönlerini birleştiren rekombinant poxviruses üreten bir yaklaşım savuruyoruz, replikasyon yetersiz modifiye vaccinia Ankara12için açıklanan bir yaklaşım a benzer12 ,13,14. Bu strateji, çift crossover olaylarla hızla rekombinant virüsler oluşturmak ve daha sonra homolog rekombinasyon ile seçilebilir marker genini ortadan kaldırmak için görsel ve ana bilgisayar aralığı seçimini birleştirir. Bu yaklaşım, homolog rekombinasyon aracılığı ile mutantların hızlı nesil izin verir, TDS yaklaşımlarının "scarless" doğası ile, vahşi tip ve mutant virüsleri ayırt etmek için bir sonraki tarama adımı gerektirmez iken. Yöntemimiz aynı zamanda antibiyotik seçimi yerine konak aralığı seçimi kullanır, hücre hattında kimyasal olarak indüklenen phenotik değişiklikler riskini ortadan kaldırarak. Bu yaklaşım için, rekombinant VACV oluşturmak için selektif ajan olarak konak antiviral protein kiril R (PKR) kullanmayı seçtik. PKR çoğu hücre türünde etkin olmayan bir monomer olarak ifade edilir15. N-terminal dsRNA bağlayıcı etki alanlarında çift iplikli RNA (dsRNA) bağlanan üzerine, PKR dimerizes ve otofosforile16. PKR fosforilatbu aktif formu ökaryotik inisiyasyon faktörü 2 (eIF2) alfa alt birimi, sonuçta ribozom için başlatıcı metiyonil-tRNA teslim inhibe, böylece hücre içi çeviri önlenmesi ve geniş birçok virüs ailelerinin çoğaltılmasını inhibe17,18.
PKR geniş ve güçlü antiviral aktiviteyanıt olarak, birçok virüs PKR aktivasyonu önlemek için en az bir strateji gelişti. Çoğu poxviruses iki PKR antagonistleri ifade, VACV E3L ve K3L genleri tarafından kodlanmış, hangi iki farklı mekanizmalar aracılığıyla PKR antagonize19. E3 çift iplikli RNA20bağlayarak PKR homodimerization önler,21, K3 doğrudan aktive PKR bağlanarak bir psödosubstrat inhibitörü olarak hareket ederken ve bu nedenle substrat eIF2α22ile etkileşimi inhibe . Daha da önemlisi, bu iki PKR antagonisti tüm türlerden PKR'yi mutlaka engellemez. Örneğin, koyun çiçeği virüsüK 3 homolog kuvvetle koyun PKR inhibe ederken, koyun E3 homolog önemli PKR inhibisyonu23,,24. Bu çalışmada, e3L ve K3L (VC-R4) için silinen bir VACV rekombinant oluşturmak için floresan seçimi ile birlikte PKR aracılı selektif basınç kullanmak için bir yöntem sürünüldü, hangi PKR yetkili hücrelerde farklı türlerden elde edilen çoğalamaz. Bu rekombinant virüs yerli E3L organizatörü kontrolü altında genleri ifade rekombinant virüslerin hızlı nesil için mükemmel bir arka plan sağlar.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492L</td><td>PCR Ampisilin'de kullanılan yüksek kaliteli polimeraz</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11593027</td><td>Bakteriyel seçici ajan</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Hücre Sıyırıcılar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-100-242</td><td>Enfekte hücreleri hasat etmek için hücre sıyırıcı</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 Hücre görüntüleme sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD2000</td><td>Floresan mikroskop</td></tr><tr><td>EVOS Işık Küpü, GFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4651</td><td>GFP Küpü</td></tr><tr><td>EVOS Işık Küpü, RFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4652</td><td>RFP Küpü</td></tr><tr><td>GenJet</td><td>SignaGen Laboratuvarları</td><td>SL100489</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Et suyu</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>Bakteri üreme ortamı</td></tr><tr><td>Monarch DNA jel ekstraksiyon kiti</td><td></td><td>Amplikonları ve doğrusallaştırılmış vektörleri saflaştırmak için kullanılan</td>NEB <td>T1020L</td> Jel saflaştırma kiti</tr><tr><td>Monarch Plazmid Miniprep kiti</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td>Miniprep kiti, plazmitleri saflaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>RNA ve DNA konsantrasyonunu ölçmek için kullanılan</td><td>NanoDrop One</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td> Spektrofotometre</tr><tr><td>NEBuilder Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>Rekombinasyon vektörü Q500 Sonicator'ı oluşturmak için kullanılan izotermal enzimatik montaj kiti</td></tr><tr><td>Sonica</td><td></td><td>Q500-110</td><td>Virüs lizatları için sonikatör</td></tr><tr><td>RK13 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-37</td><td>Tavşan böbrek hücreleri</td></tr><tr><td>VWR Multiwell Hücre Kültürü plakaları</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Hücre kültürü plakaları</td></tr></tbody></table>

host aralığı ve görsel seçimi kullanarak rekombinant poxviruses hızlı, sorunsuz nesil

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virüsü (VACV) variola virüsünün (VARV) kökünün kazınmasına yardımcı oldu. Vacv, aşı olarak ilk kullanımından bu yana terapötik aşılar için vektör ve onkolitik virüs olarak geliştirilmiştir. Bu uygulamalar, VACV'un kolayca manipüle edilen genomundan ve çeşitli terapötik uygulamalarla rekombinant virüsler oluşturmak için olağanüstü bir platform olarak geniş ana bilgisayar aralığından yararlanır. Marker seçimi yöntemleri ve geçici baskın seçki dahil olmak üzere rekombinant VACV oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Burada, rekombinant virüslerin görsel tanımlaması ile birleştiğinde bir ana dizi seçim yöntemi nin bir iyileştirmesi salıyoruz. Yöntemimiz, iki VACV PKR antagonistinden biri olan mCherry etiketli E3L'yi ifade eden floresan füzyon geni ile birleşen konak antiviral protein kiazaz R (PKR) tarafından oluşturulan seçici basınçtan yararlanır. Kaset, ilgi geni ve mCherry-E3L füzyon uvacv genomundan elde edilen diziler ile çevrilidir. İlgi geni ve mCherry-E3L arasında homolog rekombinasyon ve seçim den sonra mCherry-E3L geni kaybıteşvik etmek için, 3 'kol ilk ~ 150 nükleotitler aynı daha küçük bir bölgedir. Bu yöntemin, mutant virüsler için ilaç seçimi veya kapsamlı tarama gerektirmeden çeşitli hücre tiplerinde verimli ve sorunsuz rVACV üretimine izin verdiğini gösteriyoruz.

Şekil 1'de diyagramlanan yordamı, Hem PKR antagonistleri E3L hem de K3L'den yoksun bir VACV oluşturmak için, E3L'yi K3L (vP872) için silinmiş bir virüste EGFP ile değiştirerek kullandık. Şekil 2 PKR yetkili RK13 hücrelerinde kırmızı floresan plaklar mCherry-E3L viral ekspresyonu gösteren yanı sıra RK13 +E3L+K3L hücrelerinde e3L kaybını ve mCherry-E3L seçim belirteci çöküşünü doğrulayan EGFP'yi göstermektedir. Şekil 3 bu rekombinant ...

Bu konak aralığı seçimi ve rekombinant virüslerin görsel kimlik kullanarak "scarless" rekombinant vaccinia virüsler oluşturmak için bir yöntemdir.

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Yöntemimiz, çeşitli hücre tiplerinde rekombinant vaccina virüsünün verimli ve sorunsuz üretimi için konak aralığı seçimi ve floresan belirteçleri kullanır. Bu teknik, homolog rekombinasyon hızını geçici baskın seçilimin yarasız doğasıyla birleştirir. Buna ek olarak, kimyasal olarak indüklenen değişiklikler olasılığını ortadan kaldırmak için aralık seçimi ev sahipliği.Bu yöntem aynı zamanda aşı oluşturmak için, örneğin, yabancı genleri ifade etmek için vaccinia virüs veya diğer çiçek virüsleri değiştirmek için kullanılabilir. Bu protokolü yalnızca floresan seçimiyle gerçekleştiriyorsanız, PKR seçici basınç olmadan nispeten nadir bulunan rekombinanları algılayacak kadar virüs taradığınızdan emin olmalısınız. Bu yöntem, rekombinasyon kasetlerini elde etmiş virüsleri başarılı bir şekilde seçmek ve yara sız yeniden biraraya gelmiş virüsleri tespit etmek için floresan belirteçlerin kazanımı ve kaybına dayanır.Bir rekombinasyon vektörü oluşturmak için, ilk olarak 17 mikrolitre DNase serbest su, her astarın 1,2 mikrolitresi, 5x PCR reaksiyon arabelleği, şablon DNA ve 0,5 mikrolitre DNA polimeraz mikrolitresini amplicon başına bir PCR tüpüne ekleyin. 50 mikrolitre her tüpte son hacmi getirm

rapid-seamless-generation-recombinant-poxviruses-using-host-range

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100'den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Kaynak: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, viral antigenomu ve temel yardımcı proteinleri kodlayan plazmidleri üretici hücrelere iletmek için lipozomlar kullanılarak rekombinant kızamık virüslerinin üretilmesini göstermektedir. Transkribe edilen ve replike olan RNA, immünostimülatör ve floresan raporlayıcı proteinler eksprese eden viral partiküllerin oluşumuna yol açar. Ardından,...

İmmünostimülatör Protein Kodlayan Rekombinant Kızamık Virüsünün Üretimi

Kaynak: Marzook, N. B., et al., Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (2014)Bu video, enfekte epitelyal hücrelerde plazmit aracılı homolog rekombinasyon kullanılarak rekombinant vaccinia virüslerinin üretilmesini göstermektedir. Floresan ve metabolik belirteçler, etiketli proteinleri eksprese eden virüslerin seçilmesini ve tanımlanmasını sağlar.

Metabolik ve Floresan Seçim Kullanılarak Rekombinant Vaccinia Virüsü Enfekte Hücrelerin Tanımlanması

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus yaygın bir vektör platform olarak kuş hastalıkların bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için kullanılır. Bu makalede bir entegre NHEJ-CRISPR/Cas9 ve Cre-Lox sistemi kullanılarak rekombinant galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik aşı üretimi için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar.

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Burada, eklerin 3' ucunda uygun kısıtlama bölgelerini tanıtarak pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektörü doğrusallaştırabilir ve DNA parçalarını vektöre tek tek birleştirebiliriz.

Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüs Ekspresyon Vektör Yapısı için Kesintisiz Bir Klonlama Yaklaşımı

Öğrenin, rekombinant vaccinia virüslerinin hızlı ve iz bırakmadan üretimi için konak aralığı seçimi ve floresan belirteçleri kullanmayı. Bu yöntem, aşı geliştirme ve gen ifadesi çalışmaları için güvenilir bir protokol sunar.

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

Daha fazla video keşfet