Name: MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Öğrenin, MeCP2 protein varyantlarını elektrokemilüminesans immunoassay (ECLIA) ile hassas ve tekrarlanabilir şekilde nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, Western blot ve ELISA'ya göre daha hızlı ve duyarlıdır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eclia aletine verdiği destekten dolayı Dr. Brigitte Sturm'a çok müteşekkiriz.

Araştırma amaçlı cilt biyopsisi alımı için onay Westmead, Avustralya Çocuk Hastanesi İnsan Araştırma Etik Komitesi'nden alındı. Hayvan deneyleri için onay, yerel hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilen Avusturya Federal Bilim, Araştırma ve Ekonomi Bakanlığı'ndan alındı (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOT: ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'degösterilmiştir.
1. Antikor seçimi
<ol><li>Çeşitli MeCP2 antikorları bir dizi için sinyal-gürültü oranı değerlendirmek ve birincil fare monoklonal MeCP2 antikor kombinasyonu içinde en iyi sinyal gücü ve en yüksek özgüllük belirlemek (klon Mec-168) ve tavşan poliklonal MeCP2 algılama antikor (özel yapılmış). İkincil antikor için, aynı zamanda deneysel olarak doğrulanmış bir sisteme özgü antikor(Malzeme Tablosu)kullanın. NOT: Tablo 1, MeCP2-ECLIA gelişimi sırasında doğrulanmış tüm antikorların ve test edilmiş seyreltme aralıklarına genel bir bakış sunar.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Işlev</td>
			<td>Adı</td>
			<td>Klon</td>
			<td>Seyreltme</td>
		</tr>
<tr>
<td>Birincil</td>
			<td>Fare, MeCP2 karşıtı</td>
			<td>Mec-168</td>
			<td>1:500−1:10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Birincil</td>
			<td>Fare, MeCP2 karşıtı</td>
			<td>4B6</td>
			<td>1:250−1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Birincil</td>
			<td>Fare, MeCP2 karşıtı</td>
			<td>Erkekler-8</td>
			<td>1:500−1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Birincil</td>
			<td>Fare, MeCP2 karşıtı</td>
			<td>1B11</td>
			<td>1:500−1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Birincil</td>
			<td>Tavşan, anti-MeCP2</td>
			<td>D4F3</td>
			<td>1:500−1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ikincil</td>
			<td>Tavşan, anti-MeCP2</td>
			<td>Poliklonal</td>
			<td>1:2.000−1:20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ikincil</td>
			<td>Tavşan, anti-MeCP2</td>
			<td>Poliklonal</td>
			<td>1:2.000−1:20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Algılama</td>
			<td>SULFO-TAG anti-tavşan etiketli</td>
			<td>Poliklonal</td>
			<td>1:500−1:1.000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Antikorlar ve kullanılan çalışma seyreltmeleri listesi.
<ol start="2"><li>Alternatif olarak, geleneksel ELISA ile iyi çalışan mecp2 antikorlarının her bir çiftini kullanın.</li>
</ol>2. TAT-MeCP2 füzyon proteini ile HDF tedavisi
NOT: TAT-MeCP2, Escherichia coli ile rekombinant olarak ifade edilmiş ve daha önce8'de açıklandığı gibi standart kromatografik teknikler kullanılarak saflaştırılmış ve -80 °C'de depolanmıştır.
<ol><li>Plaka 1 x 106 insan dermal fibroblast (HDF) hücreleri 100 mm tabaklarda ve hücreleri bir gecede 37 °C'de %5 CO2 ile %90 biraraya gelene kadar büyütür.</li>
	<li>Bir şişe TAT-MeCP2 füzyon proteinini çıkar. Buz üzerinde çözülün ve yavaşça karıştırın.</li>
	<li>TAT-MeCP2'yi 50 mL HDF kültür medyasında 500 nM'lik son konsantrasyona seyreltin.</li>
	<li>Ortamı 100 mm'lik tabaklardan çıkarın ve hücreleri 37 °C'de 500 nM TAT-MeCP2 ile 24 saate kadar çeşitli kuluçka süreleri için kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>TAT-MeCP2 çözeltisini hücrelerden çıkarın. Hücreleri önceden ısıtılmış Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile 2 kat yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 2 mL %0,05 tripsin-EDTA çözeltisi ile 37 °C10'da5 dk tedavi edin.</li>
	<li>Tripsini inaktive etmek ve hücreleri 15 mL tüplerde toplamak için 6 mL HDF kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>Hücreyi 500 x g'da oda sıcaklığında 5 dk santrifüj ile peletleyin.</li>
	<li>Supernatant çıkarın ve buz gibi DPBS ile hücreleri 2x yıkayın. Peleti buz üzerinde saklayın ve numune hazırlamaya devam edin.</li>
</ol>3. Örnek hazırlama
<ol><li>HDF lysates<ol>
<li>Suzuki ve ark.11'egöre sitoplazmik ve nükleer hücre altı bölmelerine subsellüler fraksiyonu için REAP yöntemini kullanarak MeCP2'nin en yüksek protein düzeylerini belirleyin. Kesirlendirmeyi deney başına en fazla altı örnekle sınırlandırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare beyin lysates<ol>
<li>Her hipotonik lisis reaktifi ve ekstraksiyon tamponunun 100 mL'sini hazırlayın.<ol>
<li>Hipotonik lisis reaktifi için 10 mM HEPES, 1,5 mM magnezyum klorür ve 10 mM potasyum klorür karıştırın.</li>
			<li>Ekstraksiyon tamponu için, iyi karıştırın 20 mM HEPES, 1.5 mM magnezyum klorür, 0.42 M sodyum klorür, 0.2 mM EDTA, ve 25% (v / v) gliserol.</li>
			<li>Her iki arabellekteki pH'ı 7,9 olarak ayarlayın.</li>
			<li>Her iki tampona da 1 mM dithiothreitol (DTT) ve 1x proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Kullanmadan önce buz üzerinde soğutun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Toplam fare beyninin 100 mg'ını askıya alın (zorlanma: C57BL/6J, yabani tip erkek ve dişi ve B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous erkek ve heterozigot kadın; yaş: 4−8 haftalık) 1 mL buz gibi hipotonik lisis reaktifinde.</li>
		<li>Homogenizer A (gevşek, büyük açıklık için) ve B (sıkı, küçük açıklık için), sırasıyla 15 vuruş ile önceden soğutulmuş dounce tüm cam doku homogenizer ile beyni homojenize.</li>
		<li>Homojenize edilmiş hücreleri temiz bir tüpe ve 4 °C'de 20 dk için 10.000 x g'de santrifüje aktarın. Supernatant atın (veya daha fazla kullanım için sitoplazmatik fraksiyonu olarak tutun).</li>
		<li>100 mg başlangıç malzemesi başına 140 μL çıkarma tamponu içinde peleti yeniden askıya alın. Tüpü önceden soğutulmuş bir termoblok içine yerleştirin ve 4 °C'de 30 dk hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Tüpü 16.000 g'da 10 dakika 4 °C'de santrifüj edin. Supernatant'ı (yani nükleer fraksiyonu) yeni bir önceden soğutulmuş tüpe aktarın ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. NOT: Fare beyni ve HDF'lerden elde edilen lysatların protein konsantrasyonu BCA protein teşbiile değerlendirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MeCP2-ECLIA protokolü
<ol><li>Yıkama çözeltisinin hazırlanması, tampon ve artüytümün engellenmesi (gün 1)<ol>
<li>PBS çözeltisinde %0,05 Ara 20 hazırlamak için 500 ila 1 L PBS arasında 500 l'lik PBS ekleyin, şiddetle karıştırın ve "yıkama solüsyonu" olarak etiketlendirin. NOT: Sadece taze hazırlanmış yıkama tamponu kullanıldığından emin olun.</li>
		<li>Fosfat tamponlu salinde (PBS) %3 bloker A(Malzeme Tablosu)blokaj çözeltisi hazırlayın. Hafifçe karıştırarak karıştırın, sterilize filtre ve en fazla iki hafta boyunca kullanıma kadar buzdolabında saklayın.</li>
		<li>10 mL PBS'ye 5 mL engelleme çözeltisi ekleyerek, atojen dilüent çözeltisi (PBS'de %1 bloker A) hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yüksek bağlama plakalarının kaplaması<ol>
<li>96-iyi çok dizili tek nokta yüksek bağlama plaka sı. NOT: Yüksek bağlama plakaları daha büyük bir bağlama kapasitesine ve dolayısıyla hidrofobik yüzeylere sahip standart plakalardan daha büyük bir dinamik aralıktadır.</li>
		<li>Monoklonal fare anti-MeCP2 antikorunu buz üzerinde eritin ve antikordan 0.67 μL'lik pbs (PBS'de 1:6.000 antikor seyreltme) ile karıştırın. Girdap iyi karıştırmak ve "kaplama çözeltisi" olarak tüp etiket antikor çözeltisi.</li>
		<li>Çok kanallı bir pipettor kullanarak her kuyunun alt köşesinde 25 μL kaplama çözeltisi dikkatlice dağıtın; buna çözelti kaplama yöntemi denir. Kaplama çözeltisinin her kuyunun altını kapladığından emin olmak için her iki taraftaki 96 kuyulu tablaya hafifçe dokunun.</li>
		<li>Plakayı yapışkan folyo ile kapatın ve tabağı buzdolabında gece leme (12−16 saat) 4 °C'de inküleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Engelleme (gün 2)<ol>
<li>Buzdolabından tabağı çıkarın ve folyo çıkarın.</li>
		<li>Antikor kaplama çözeltisini atık sepetine basarak çıkarın ve kuyulardan tüm kaplama çözümlerini çıkarmak için plakayı kağıt havluya dokunun.</li>
		<li>Kuyu başına 125 μL engelleme çözeltisi ekleyin. Plakayı tekrar kapatın ve yörüngesel bir mikroplaka çalkalayıcısının üzerine yerleştirin.</li>
		<li>800 rpm sürekli sallayarak oda sıcaklığında 90 dakika boyunca plaka kuluçka.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Standartların ve numunelerin hazırlıkları<ol>
<li>Kuluçka süresi boyunca MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2 protein standartlarını ve çeşitli numuneleri hazırlayın. NOT: Standart seyreltme için kullanılan lysis tamponu, analiz edilen numunelerde kullanılanla aynı olmalıdır.</li>
		<li>Bir şişe MePC2 ve/veya TAT-MeCP2 protein stok çözeltisi (250 μg/mL), fare beyin lisatları ve -80 °C'den HDF lysates alın. Onları buzda erit.</li>
		<li>Standart stok çözeltisini (MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2) temiz tüplerde Tablo 2'yegöre seyreltin.</li>
		<li>Örnekleri lysis tamponunda şu şekilde seyreltin: 25 μL lysis tamponu başına 1−20 μg fare beyni lysate ve 25 μL lysis tamponbaşına 0,25−1 g HDF lysate. Her numunenin yeterli hacimli hazırlayın triplicate analizi yürütmek için.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standart</td>
			<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Seyreltme</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 1</td>
			<td>1.800 ng/mL</td>
			<td>1.08 μL Standart stok çözeltisi + 148,92 μL Lysis tampon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 2</td>
			<td>600 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standart 1 + 100 μL Lysis tampon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 3</td>
			<td>200 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standart 2 + 100 μL Lysis tampon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 4</td>
			<td>66,67 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standart 3 + 100 μL Lysis tampon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 5</td>
			<td>22.22 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standart 4 + 100 μL Lysis tampon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 6</td>
			<td>7.41 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standart 5 + 100 μL Lysis tampon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 7</td>
			<td>2.47 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standart 6 + 100 μL Lysis tampon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 8</td>
			<td>0.82 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standart 7 + 100 μL Lysis tampon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 9</td>
			<td>0.27 ng/mL</td>
			<td>50 μL Standart 8 + 100 μL Lysis tampon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standart 10</td>
			<td>0 ng/mL</td>
			<td>150 μL Lysis tamponu</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Standart seri 0 ile 1.800 ng/mL arasındadır.
<ol start="5"><li>Numunelerin ve standart çözümlerin eklenmesi<ol>
<li>Atık sepetine basarak engelleme çözeltisini çıkarın ve kuyulardan tüm engelleme çözümlerini çıkarmak için plakayı kağıt havluya dokunun.</li>
		<li>Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.</li>
		<li>Tek bir kanallı pipet kullanarak kuyunun alt köşesine 25 ul standart ve numune ekleyin.</li>
		<li>Plakayı kapatın ve 800 rpm'de sürekli sallayarak oda sıcaklığında 4 saat boyunca plakayı kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiketsiz algılama antikor<ol>
<li>Çok klonal tavşan anti-MeCP2 antikorbuz üzerinde eritin. Antikor 1:6,000'i tazyikli seyreltme çözeltisi.</li>
		<li>Atık sepetine basarak standartları ve numuneleri çıkarın ve plakayı kağıt havluya dokunun.</li>
		<li>Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.</li>
		<li>Çok kanallı pipettor ile her kuyuya 25 μL etiketsiz algılama antikorekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 800 rpm'de sürekli sallayarak 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spesifik konjuge antikor<ol>
<li>Buzdolabından belirli ikincil antikor(Malzeme Tablosu)alın ve buz üzerine yerleştirin. Antikor 1:666.67'yi tazyik seyreltme çözeltisinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Atık sepetine basarak ücretsiz etiketsiz ikincil antikor çıkarın ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun.</li>
		<li>Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.</li>
		<li>Çok kanallı pipettor ile her kuyuya 25°L spesifik konjuge antikor(Malzeme Tablosu)ekleyin. Oda sıcaklığında 800 rpm sürekli sallayarak 1 saat için plaka ve kuluçka mühür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plakayı okuma<ol>
<li>Ücretsiz konjuge antikor(Tablo Malzemeler)atık sepeti içine flicking ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun çıkarın.</li>
		<li>Plakayı 150 μL yıkama çözeltisi ile 3x yıkayın.</li>
		<li>150 μL 1x Tris tabanlı Altın okuma tamponu ekleyin(Tablo Malzemeler)plaka ışık üretimi için bir co-reatoant olarak tripropylamin içeren sürfaktan ile. Ters pipetleme teknikleri kullanarak herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.</li>
		<li>Plakayı mikro plaka algılama platformuna(Malzeme Tablosu)yerleştirin ve hemen ölçüme başlayın. 96-iyi plaka edinimi için ayarları kullanın.</li>
		<li>Elektromilüminesans sinyallerini, yerleşik bir CCD kamera ile elektrokemilüminesans algılama sisteminde(Malzeme Tablosu)yakalayın ve göreceli ışık birimlerine (RLU) karşılık gelen ve ışığın yoğunluğuyla doğru orantılı olan sinyal sayılarını kaydedin. NOT: Elektrokimyasal stimülasyon üzerine karbon elektrota bağlanan rutenyum etiketi 620 nm'de parlak ışık yayır. Alet eşliğinde yazılım(Malzeme Tablosu)ile verileri analiz edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDebad%2C+JD+%22Electrogenerated+Chemiluminescence%22">Electrogenerated Chemiluminescence</a>. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).</li>
<li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li>
<li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li>
<li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeCP2+mutations%3A+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).</li>
<li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeCP2%2C+a+key+contributor+to+neurological+disease%2C+activates+and+represses+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li>
<li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome%3A+a+complex+disorder+with+simple+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li>
<li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+Syndrome%3A+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li>
<li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).</li>
<li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaccone%2C+FA+%22Synthetic+MeCP2+sequence+for+protein+substitution+therapy%22">Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy</a>. , Canada. CA2647125C (2007).</li>
<li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li>
<li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REAP%3A+A+two+minute+cell+fractionation+method%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294(2010).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells%3A+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li>
<li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li>
<li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MECP2+Duplication+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li>
<li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li>
<li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Endojen MeCP2, rekombinant MeCP2 ve TAT-MeCP2 düzeylerini ölçmek için 96 kuyulu bir eclia plaka geliştirilmiştir. Bu MeCP2 protein fonksiyonukaybı RTT sendromu yol açtığı gösterilmiştir6, hangi tedavi şu anda semptom yönetimi ve fizik tedavi ile sınırlıdır. Bir umut verici tedavi cadde sözde protein replasman tedavisi, MeCP2 düzeyleri kendi ihtiyaç duydukları konsantrasyon12kadar titrated olabilir12 ,13,14</sup...

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), elektrokimyasal olarak uyarıldığında lüminesans yayan etiketleri kullanan bir işleme dayanmaktadır. Bu temel sanayi ve akademik araştırma, gıda endüstrisi nin yanı sıra klinik tanı1biyolojik analitlerin kantitatif tespiti için geniş bir uygulama tekniğidir. Genellikle karbon mürekkep elektrotlu tek kullanımlık 96 kuyuluk bir plaka kullanılır. Bu elektrotlar immünoassay için katı faz taşıyıcı olarak hareket. İkincil bir antikor elektromilüminesans etikete konjuge edilir ve sisteme elektrik uygulandığında kimyasal etiketin ışık salınımı tetiklenir. Ultra düşük gürültü şarj lı bir cihaz (CCD) ışık yoğunluğunu kaydeder ve bu durum, yakalama antikoruna bağlı antijenle doğru orantılıdır ve bu da numunenin hedeflenen analitinin sayısallaştırılmasıile sonuçlanır2. Enzime bağlı immünosorbent çıktısı (ELISA) ile karşılaştırıldığında, ECLIA daha yüksek duyarlılık ve tekrarlanabilirlik yanı sıra daha iyi otomasyon vetutarlılık3 sunduğu için avantajlı olarak kabul edilir.
Burada insan ve mürin kökenli örneklerde metil-CpG bağlayıcı protein 2 (MeCP2) düzeyleri nin yanı sıra yeni geliştirilen ECLIA sistemini kullanarak rekombinant proteinin farklı varyantlarını analiz ettik. MecP2, metillenmiş DNA dizileri ile etkileşime girdiği bilinen X'e bağlı bir nükleik asit bağlayıcı proteindir. Bu protein gen ekspresyonunun düzenlenmesinde yer almıştır4,5. Bu proteini kodlayan gendeki fonksiyon kaybı mutasyonları, ciddi bir nörogelişimsel bozukluk olan Rett sendromuna (RTT) neden olan başlıca suçlulardır6. Başka bir MeCP2 ile ilgili bozukluk, MECP2 çoğaltma sendromu, aynı zamanda RTT ile örtüşebilir nörolojik belirtilere yol açar7. Özellikle, erkekler çoğunlukla MECP2 çoğaltma sendromu6,,7etkilenir ken özellikle, kadınlar çoğunlukla RTT etkilenir.
Bu bozukluklar merkezi sinir sisteminde (CNS) sırasıyla yetersiz veya fazla MeCP2 düzeyleri ile ilişkilidir. Bu nedenle, CNS artan MeCP2 düzeylerini içeren RTT için tedavi seçenekleri MeCP27aşırı ile ilişkili zararlı etkileri önlemek gerekir. Bu nedenle, ECLIA sistemi tarafından sağlanan MeCP2 protein düzeylerinin son derece hassas ve doğru bir niceliği, RTT'nin ilerlemesi ve MECP2 tekrar sendromu araştırması için çok önemlidir. İnsan hücre hatları ve fare doku örneklerinden endojen ve eksojen MeCP2 düzeylerinin kesin ölçümleri ve insan MeCP2 izoform B 'den (izoform e1 olarak da bilinir) oluşan rekombinant protein ve kan-beyin bariyerini aşma potansiyeline sahip minimal N-terminal HIV-TAT transdüksiyon etki alanı (TAT-MeCP2) bu çalışmada8,sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>Hipotonik lizis reaktifi, Ekstraksiyon Tamponu</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Testi Boya Reaktif Konsantresi</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>500-0006</td><td>Numune hazırlama</td></tr><tr><td>Algılama AB SULFO-TAG etiketli anti-tavşan</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R32AB-1</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Keşif tezgahı 4.0</td><td>Meso Scale Discovery</td><td></td><td>Yazılımı</td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>41966-029</td><td>Numune hazırlama</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (steril)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Numune hazırlama, Yıkama solüsyonu, Kaplama solüsyonu</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>Ekstraksiyon Tamponu</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>Numune hazırlama</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>Ekstraksiyon Tamponu</td></tr><tr><td>Altın Okuma Tamponu T (1x) yüzey aktif madde</td><td>Meso Scale ile Teşhis</td><td>R92TG</td><td>MeCP2 ECLIA protokolü</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Hipotonik lizis reaktifi, Ekstraksiyon Tamponu</td></tr><tr><td>KIMBLE Dounce doku öğütücü seti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>Numune hazırlama</td></tr><tr><td>Laboratuvar Çalkalayıcı, sallanma hareketi (düşük hız)</td><td>GFL</td><td>3014</td><td>MeCP2 ECLIA protokolü</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl*6H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Hipotonik lizis reaktifi, Ekstraksiyon Tamponu</td></tr><tr><td>MeCP2 (İnsan) Rekombinant Protein (P01)</td><td>Abnova Corporation</td><td>H00004204-P01</td><td>Hücre tedavisi</td></tr><tr><td>Microseal B contası</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>Farede</td><td></td></tr><tr><td>üretilen Monoklonal Anti-MeCP2, klon Mec-168, saflaştırılmış immünoglobulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818-100UL'de plaka sızdırmazlığı için MSB1001; RRID:AB_262075</td><td>Antikor, Kaplama çözeltisi</td></tr><tr><td>MSD Engelleyici A</td><td>Meso Terazi Teşhisi</td><td>R93BA-4</td><td>Engelleyici</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400</td><td>Meso Terazi Teşhisi</td><td>I30AA-0</td><td>MeCP2 ECLIA protokolü</td></tr><tr><td>Çok Dizili 96 Kuyulu Plaka Meso</td><td>Terazi Teşhisi</td><td>Life Technologies tarafından L15XB-3/L11BX-3</td><td>MeCP2 ECLIA protokolü</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>gibco</td><td>15140122</td><td>Numune hazırlama</td></tr><tr><td>Poliklonal Anti-MeCP2, tavşan</td><td>Eurogentec S.A.</td>'da üretilmiştir.<td>özel tasarlanmış</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td> <td>Merck KGaA</td><td>1049361000</td><td>Hipotonik lizis reaktifi</td></tr><tr><td>Birincil AB Faresi, anti-MeCP2 (1B11)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1404063; RRID: AB_10737296</td><td>Antikoru</td></tr><tr><td>Birincil AB Faresi, anti-MeCP2 (4B6)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004204M1; RRID: AB_1842411</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Birincil AB Faresi, anti-MeCP2 (Mec-168)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818; RRID: AB_262075</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Birincil AB Faresi, anti-MeCP2 (Erkekler-8)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M7443; RRID: AB_477235</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Birincil AB Tavşanı, anti-MeCP2 (D4F3)</td> <td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>3456S; RRID: AB_2143849</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100X)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>8340</td><td>Hipotonik lizis reaktifi, Ekstraksiyon Tamponu</td></tr><tr><td>İkincil AB, Tavşan, anti-MeCP2</td><td>Eurogentec SA</td><td>özel</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>İkincil AB, Tavşan, anti-MeCP2</td><td>Merck</td><td>07-013</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>Ekstraksiyon Tamponu</td></tr><tr><td>SULFO-TAG Etiketli Anti-Tavşan Antikoru (keçi)</td><td></td> <td>Antikor</td><td></td></tr> <tr><td>TAT-MeCP2 füzyon proteini</td><td>şirket içi üretim</td><td></td><td></td></tr> W0015528S Meso Ölçeği Teşhisi Hücre tedavisi<tr><td>Tripsin EDTA %0.25 (1X)</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Hücre tedavisi</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>Yıkama solüsyonu</td></tr></tbody></table>

mecp2 protein varyantları için elektrokemilüminesans bazlı bir test

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

ECLIA, endojen ve rekombinant protein miktarlarını 96-iyi formatta ölçebilen çok yönlü bir yöntemdir. ECLIA verimliliğini göstermek için bu analiz, fare beyin dokusundaki MeCP2'nin içsel düzeylerini ve insan dermal fibroblastlarında TAT-MeCP2 alımını analiz etmek için kullanılmıştır. MeCP2-ECLIA, düşük intra ve inter-assay hatası ile son derece doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üretir. Özetle, yüksek iş itme ekranlarında kullanılabilen MeCP2 protein varyantlarının değerlendirilmesi için nicel bir yöntem geliştirdik.

ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'deaçıklanmıştır. İki MeCP2 varyantı için standart eğriler Şekil 2'degösterilmiştir. Çok çeşitli konsantrasyonlarda (1−1.800 ng/mL) doğru niceleme mümkün oldu. Şekil 3'tefare beyni ve HDF'lerden elde edilen LYSAt'ların MeCP2 düzeyleri analiz edildi. Beyinde mecp2 ekspresyonu heterozigot, yabani tip ve nakavt farelerden karşılaştırıldı, Şekil 3B'de</s...

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), geniş bir çalışma aralığında düşük intra ve inter-assay hatası ile yüksek nicel, doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üreten endojen ve eksojen olarak uygulanan MeCP2 protein varyantlarının kantitatif tespiti için yeni bir yaklaşımdır. Burada, 96-iyi formatta MeCP2-ECLIA için protokol açıklanmıştır.

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIA, MeCP2'nin hücresel seviyelerini ölçmek için basit ama etkili bir yöntemdir. ECLIA hızlı, daha duyarlı ve Batı leke ve ELISA gibi diğer nicelik yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha kolay işlenir. PBS'de %0,5 Ara 20 olan yıkama çözeltisini hazırlamak için 500 mikrolitre Tween 20 ila bir litre PBS ekleyin ve şiddetle karıştırın.%3 Bloker A ve PBS'lik bir engelleme çözeltisi hazırlayın ve hafifçe karıştırın. Filtrasyon çözeltisini sterilize edin. Tazyikli dilüent çözeltisi , %1 Bloker A ve PBS'yi hazırlamak için, 10 mililitre PBS'ye beş mililitre engelleme çözeltisi ekleyin.Sonra buz üzerinde monoklonal fare anti-MeCP2 antikor eritin. PBS dört mililitre ile antikor 0.67 mikrolitre karıştırın, sonra çözelti girdap. 96 kuyulu yüksek bağlama plakasını solüsyon kaplamak için, çok kanallı bir pipet terazisi kullanarak her kuyunun alt köşesine 25 mikrolitre kaplama çözeltisi dikkatlice dağıtın.Kaplama çözeltisinin her kuyunun altını kapladığından emin olmak için 96 kuyulu plakayı her iki tarafa da hafifçe dab. Plakayı yapışkan folyo ile kapatın ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Buzdolabından 96 kuyulu tabağı alın ve folyoçıkarın.Bir atık kabına flicking tarafından kuyularda antikor kaplama çözeltisi çıkarın. Sonra kalan çözeltikaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun. Ardından, her kuyuya 125 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin.Sonra tekrar yapışkan folyo ile plaka mühür. Plakayı 800 RPM olarak ayarlanan yörüngesel bir mikroplaka çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatırın. MeCP2 veya Tat-MeCP2 protein stok çözeltisi, fare beyin lysates ve HDF lysates buz bir şişe üzerinde çözülme.El yazmasının ikinci tablosunda açıklandığı gibi protein stok çözeltisini temiz tüplerde seyreltin. Daha sonra lysate örneklerini seyreltin. Fare nin beyin lysates için, lysis tampon 25 mikrolitre başına 1 ila 20 mikrogram kullanın.HDF lysate için, lysis tampon 25 mikrolitre başına 0,25 ila bir mikrogram ekleyin. 96 kuyulu plaka 90 dakika kuluçkaya yattıktan sonra, bir atık kabına hareket ettirerek blokaj çözeltisini kuyulardan çıkarın. Sonra kalan çözeltikaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun.Daha sonra yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak, 150 mikrolitre yıkama çözeltisi ile plakayı üç kez yıkayın. 96 kuyulu plakanın kuyularına 25 mikrolitre standart ve numune ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında sabit 800 RPM sallayarak dört saat daha kuluçkaya yatırın.Etiketsiz algılama antikorunu, çok klonal tavşan anti-MeCP2'yi buz üzerinde eritin. Titreme dilüent çözeltisi kullanarak antikoru 1 ile 6,000 arasında seyreltin. 96 kuyulu plaka shaker üzerinde kuluçka bittiğinde, bir atık konteyner içine plaka flicking tarafından standartları ve örnekleri kaldırın.Sonra kalan çözeltikaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun. Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak tabağı 150 mikrolitre yıkama çözeltisi ile üç kez yıkayın. Çok kanallı pipetter ile her kuyuya 25 mikrolitre etiketsiz algılama antikor çözeltisi ekleyin.Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 800 RPM'de sürekli sallayarak kuluçkaya yatırın. Buzdolabından belirli ikincil antikor alın ve bir buz yerleştirin. İkincil gövdeyi istinat dilüent çözeltisinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.96 kuyulu plakadan ücretsiz etiketsiz algılama antikorlarını çıkarmak için, atık kabın içine dinleyip plakaya kağıt havluya dokunun. Plakayı üç kez yıkadıktan sonra, çok kanallı pipetter ile her kuyuya 25 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 800 RPM'de sürekli sallayarak kuluçkaya yatırın.Atık kabın içine flicking ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunarak serbest ikincil antikor çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi, üç kez plaka yıkayın. Plakanın her kuyusuna, 1X Tris baz Altın Okuma Tampon'una 150 mikrolitre ekleyip, ışık üretimi için bir eşregülan olarak tripropilamin içeren sürfaktanlı bufferı ekleyin. Hava kabarcıkları üreten önlemek için, ters pipetleme teknikleri kullanın.Elektrokemilüminesans algılama sistemi ile mikroplaka platformu üzerinde 96-iyi plaka yerleştirin. Dahili CCD kamerayı kullanarak, hemen veri yakalamaya başlayın. Göreceli ışık birimlerine karşılık gelen ve ışığın yoğunluğuyla doğru orantılı olan kayıt sinyali sayıları.MeCP2 standart eğrileri birden fazla ölçümde insan MeCP2'den üretildi. ECLIA, rekombinant insan MeCP2'yi mililitre başına bir nanogramile mililitre de 1800 nanogram arasında doğru bir şekilde ölçebilir. ECLIA kullanılarak, MeCP2 protein düzeyleri heterozigot ve dişi yabani farelerden ve bir MeCP2 nakavt faresinden beyin nükleer lysates ölçüldü.ECLIA, sağlıklı bir kontrolden hücre lysates ve Rett sendromu için model olarak kullanılan c. 806delG hücre hattından yapılmıştır. Mutant hücre hatlarında ECLIA veya immünororesans ile MeCP2 proteini saptırılmadı.ECLIA ayrıca MeCP2 eksik hücre hattı fazla mesai tarafından Tat-MeCP2 alımını araştırmak için kullanılmıştır. ECLIA inter ve intra tsay hassasiyeti üç gün üst üste belirlendi. Gelecekteki protein replasman tedavisi için, MeCP2 doğumu ECLIA tarafından protein düzeyi değerlendirmesinden sonra tekrar tekrar optimize edilebilir.

an-electrochemiluminescence-based-assay-for-mecp2-protein-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

43 kadar moleküler hedeflere eş zamanlı olarak algılanması için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi açıklanmıştır. MPCR / RLB Uygulamaları mikrobiyal yazarak ve klinik örneklerde birden fazla patojenlerin tespiti içerir.

Multiplex PCR ve Reverse Line Blot Hibridizasyon Testi (mPCR / RLB)

Bu videoda, farklı numunelerde hedef protein seviyelerinin kantitasyonu için elektrokemilüminesans immünolojik testini gösteriyoruz. Bu tahlil, elektrokimyasal reaksiyonda üretilen lüminesansa dayanmaktadır. Yayılan ışığın yoğunluğu, numunedeki hedef proteinin miktarı ile orantılıdır.

Beyin Lizatında Hedef Protein Seviyelerinin Ölçülmesi için Elektrokemilüminesans Testi

Bu video, immünopresipite lizatların kemilüminesans bazlı western blotlamasını açıklamaktadır. Teknik, protein işleme ve aktivasyonunu belirlemeye yardımcı olur. Tespit edilen kemilüminesan sinyali, aktivasyonu sırasında protein işleme seviyesi ile orantılıdır.

Protein İşleme için Kemilüminesan Western Blot Testi

Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Biz klinik çeviri potansiyeli ile geliştirilen yüksek verim, multipleks ve hedeflenen proteomik beyin omurilik sıvısı (BOS) testi açıklar. Test böyle Apolipoprotein E varyantları (E2, E3 ve E4) olarak nörodejenerasyonun potansiyel belirteçleri ve risk faktörlerini, ölçmek ve onların allelik ifadesini ölçebilirsiniz.

Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Biz bir küçük saç tokası RNA (shRNA) ve düzenleyiciler, x kromozomu inactivation ateş böceği luciferase ile bir fare hücre satırı tanımlamak için sonraki nesil sıralama tabanlı iletişim kuralı raporu ve hygromycin direnç genleri metil için erimiş CpG bağlayıcı protein 2) MeCP2) etkin olmayan X kromozomu üzerindeki gen.

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

Burada, on-on translocation-2 (TET2) iletişim kuralı etkin etiketsiz insan bir verimli tek adım arıtma için mevcut iyon değiştirme Kromatografi ve sıvı kromatografi-tandem mass kullanarak onun tahlil kullanarak 5-metilsitozin dioxygenase spektrometresi (LC-MS/MS)-yaklaşım alarak.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

Burada, rastgele olmayan X kromozom inactivation ile uygulanabilir bir kadın duvar modeli oluşturmak için bir protokol tarif, yani, maternally miras X kromozom hücrelerde% 100 ' de aktif değildir. Ayrıca, pasif X kromozom in vivo farmakolojik reaktivasyonunun fizibilite, tolerabilite ve güvenliğini test etmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli

CENP-A ubiquitylation centromere DE CENP-A birikimi için önemli bir gerekliliktir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez. Burada EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi ni tanımlıyoruz.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Öğrenin, MeCP2 protein varyantlarını elektrokemilüminesans immunoassay (ECLIA) ile hassas ve tekrarlanabilir şekilde nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, Western blot ve ELISA'ya göre daha hızlı ve duyarlıdır.

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

Daha fazla video keşfet