Name: Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Keşfedin Drosophila testislerinde tüm kazdağları immünostaining protokolü ile 3D konfokal analiz yöntemini. NP40 ve heptan kullanan bu teknik, antikor penetrasyonunu artırarak büyük spermatositlerde güvenilir protein lokalizasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Antikorlar için P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura ve sinekler için A. Debec, Bloomington ve Viyana stok merkezlerine teşekkür ederiz. Öneriler ve teşvik edici tartışmalar için C. Jackson'a teşekkürler.

1. Drosophila testis koleksiyonu
NOT: Genç erkekler (eklozyon sonrası 0-15 saat) diploid mikrop hücrelerini (spermatogonia ve spermatositler) incelemek için gereklidir.
<ol><li>Spermatidler geliştirmeden kaynaklanan paraziti en aza indirmek için mümkün olduğunca genç sinekleri seçin.</li>
	<li>Karbondioksite kısa bir süre maruz kalarak sinekleri uyuşturun ve bir sineklik pedine aktarın14,15.</li>
	<li>Bir diseksiyon mikroskobu (10x büyütme) altında, başı çıkarmak için tokmak kullanın.</li>
	<li>Siyah bir arka plan desteği üzerine silikon kaplı cam kaydırakta 5 ila 10 kafa kesilmiş sinekleri 100 μL Ringer tamponu (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, komple protein inhibitörü, pH 6.8) aktarın.</li>
	<li>40x büyütmede mikroskobun parçalanmasıyla, toraks ile karın arasında bir sinek tutmak için bir çift 5 numaralı toparlama kullanın ve diğer toparlamalarla birlikte karnı torakstan çekin. Testisleri ve bitişik dokuları sinek karkası15'ten hızla izole edin ve ringer tamponunun yeni bir damlasına aynı slaytta yerleştirin.</li>
	<li>Tüm testisler hazır olduğunda, testisleri kalan dokulardan (aksesuar bezi ve dış cinsel organ) temizleyin.</li>
	<li>Parçalanmış testisleri içeren damladan fazla tamponu çıkarın. Tipik olarak, 200 μL ucun üzerine monte edilmiş 10 μL uçlu bir p200 pipet kullanın. Bu, sıvı fazlalığının küçük bir diyafram açıklığından çıkarılmasını sağlar. Parçalanmış testisleri içeren damlanın üzerine% 4 paraformaldehit fiksatif bir damla yerleştirin ve ardından testisleri hızlı bir şekilde taze fiksatif çözelti içeren bir tüpe aktarın.</li>
</ol>2. Paraformaldehit fiksasyonu
<ol><li>Kullanımdan hemen önce 2 mL fiksatif çözelti hazırlayın: 2 mL silikonlu mikrosenj tüpte 30 μL NP40% 20 artı 1200 μL hepatik ile fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilmiş% 4 paraformaldehitin 600 μL'si. 600 μL aliquots olarak hazırlanan ve -20 °C'de depolanan PBS'de %4 paraformaldehit kullanın. Dikkat: Heptan ve paraformaldehit toksiktir ve duman kaputunda ele alınmalıdır. Ev sahibi enstitünün yönetmeliklerine göre bunları atın.</li>
	<li>Testleri geniş diyafram ucuna sahip bir p200 mikropipette kullanarak PFA/NP40/heptane çözeltisine aktarın. Tüpü elle 30 sn boyunca yukarı ve aşağı sallayın. Testisleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döner karıştırıcıya sabitleye devam edin.</li>
	<li>Döner karıştırıcıyı durdurun ve faz ayrımına izin vermek ve testislerin tüpün dibine yerleşmesini sağlamak için tüpü bir tüp rafı içine yerleştirin.</li>
	<li>Tüm heptane ve fiksatif çözeltiyi çıkarın ve testisleri 1x PBS ile üç kez hızlı bir şekilde durulayın.</li>
	<li>Temiz bir 200 μL bireysel tüpe aktarın. Kullanılan antikor miktarlarını en aza indirmek için bu küçük tüplerdeki tüm inkübasyonları gerçekleştirin.</li>
	<li>Hem P200 hem de P10 ucu takılı 200 μL mikropipette kullanarak fazla tamponu çıkarın. Testisleri aspire etmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Tüm numuneler hazır olana kadar testisleri buz üzerinde 1x PBS'de tutun.</li>
</ol>3. Çözeltide antikor lekesi
<ol><li>PBS'yi atın ve hücre zarlarını permeabilize etmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca testisleri% 0,3 PBS-T'de bırakın.</li>
	<li>Aynı tamponda önceden inkübasyon artı 1 saat boyunca% 5 normal keçi serumu (NGS).</li>
	<li>%0,3 PBS-T artı %5 NGS(Malzeme Tablosu)ile seyreltilmiş birincil antikorun 200 μL'sini ekleyin.</li>
	<li>Birincil antikoru bir gecede 4 °C'de (veya oda sıcaklığında) bir rocker üzerinde hafif ajitasyonla kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 15 dakika boyunca% 0.3 PBS-T'de 3 kez yıkayın. Testislerin yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmesine izin verin.</li>
	<li>DyLight konjuge serisinden 1:500 seyreltilmiş 200 μL ikincil antikor ekleyin.</li>
	<li>İkincil antikorun oda sıcaklığında 4 saat boyunca karanlık bir odada kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 15 dakika boyunca% 0.3 PBS-T'de yıkayın. Daha sonra her seferinde oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 30 dakika boyunca% 0.2 PBS-T ve% 0.1 PBS-T ile tekrarlayın. Deterjanı çıkarmak için 30 dakika boyunca 1x PBS'de son bir yıkama yapın.</li>
	<li>15 dakika boyunca 1x PBS'de 1 μg/mL'de 180 μL DAPI çözeltisi ekleyin. Stok çözeltisi H2O'da 10 mg/mL'dir. PBS'de stok çözeltisi yapmaktan kaçının, bu da daha büyük spermatositlerde dağınık kromatin üzerindeki DAPI boyama sinyalini azaltabilir.</li>
	<li>Her biri 5 dakika boyunca 3x yıkayın.</li>
	<li>Temiz bir slayt üzerinde bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.</li>
	<li>Testisleri aspire edin ve slayda koyun. Geniş diyafram ucunun %0,1 PBS-T ile önceden durulanmasını test etmenin uyrmaya yapışmasını önler. Fazla PBS'yi kaldırın.</li>
	<li>Citifluor AF1'den bir damla (yaklaşık 100 μL) ekleyin.</li>
	<li>Hava kabarcıklarını hapsetmekten kaçınmaya dikkat ederek, dokunun üzerine hafifçe bir cam kapak yerleştirin.</li>
	<li>Kapak kapağını şeffaf oje kullanarak kaydırağa kapatın.</li>
	<li>Slaytları mikroskopta gözlemleyin.</li>
</ol>4. Kolokalizasyon analizleri
<ol><li>Konfokal görüntüler elde edin. Z çözünürlüğünde 0,5 veya 1 μm çözünürlüğünde zeiss LSM 710 konfokal mikroskop (63x Plan Apokromatik yağ) kullandık.</li>
	<li>Bağımsız testislerden farklı hücreler seçin.</li>
	<li>Görüntüleri işleme yazılımına (örneğin, imaris) içe aktarın.</li>
	<li>Komşu çekirdeği dışlamak için çekirdeği manuel segmentasyonla tanımlayın. Coloc yazılımını kullanın; Pearson'ın korelasyon katsayılarını (PCC' ler) 2 florofor arasındaki tüm hacimde toplar.</li>
</ol>

<ol><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li>
<li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).</li>
<li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li>
<li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li>
<li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li>
<li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAD1%3A+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).</li>
<li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li>
<li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).</li>
<li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li>
<li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li>
<li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).</li>
<li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup154%2C+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li>
<li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li>
<li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue%2C+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Immunostaining+of+Drosophila+testes%22">Immunostaining of Drosophila testes</a>. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%22">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes</a>. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%3A+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li>
<li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li>
<li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, tüm mount yetişkin Drosophila testislerinin başarılı bir şekilde immünoblabeling için bir yöntem sağlar. Diğer prosedürlerde bildirildiği gibi, spermatositleri engelleme riski taşıyan spermin varlığını en aza indirmek için genç erkeklerin kullanılması gerekir (hatta eklosyondan sonra yaşı 20 saatten daha az bir süreye kısalttık). Diseksiyon hızlı olmalı ve antikor seyreltmesi sinyal-gürültü oranını optimize etmek için ayarlanmalıdır21,22,<...

Drosophila testisleri nükleer mimarinin incelenmesi için değerli bir modeldir. Mitotik spermatogonyal hücrelerde, nükleer hacim büyük ölçüde kromatin tarafından işgal edilir. Bu hücreler dört tur bölünmeye uğrar ve 16 birincil spermatosit kisti üretir. Sonraki birkaç gün boyunca, spermatositler 6 gelişim aşamasından (S1-S6) geçer, hacim olarak büyük ölçüde artar, yaklaşık olarak 20 kat1,2. Nükleer morfolojilerini de değiştiriyorlar. Lamin Dm0 tarafından ortaya çıkan çekirdeğin ana hatları düzensiz hale gelir ve derin invaginasyonları gösterir1,3. Buna kromatin organizasyonu 1 , 4 ,5,6,7 'de kapsamlı gen ekspresyasyonu değişiklikleri ve modifikasyonları eşlikeder. Ara evre kromozomları, S4-S5 evresinde iyi tanımlanmıştır ve 2 büyük çift değerli otomoz ve çekirdekle sabitlenmiş X-Y çiftine karşılık gelen üç ayrı kütle oluşturur.
Mad1 başlangıçta mitotik kontrol noktasının önemli bir bileşeni olarak izole edildi(8'degözden geçirildi). Interfazda, öncelikle nükleer zarfta değil, aynı zamanda nükleoplazma9, 10,11'dede bulunur. Drosophila testislerinde, Mad1'in nükleoplazmada belirgin olduğunu, iki büyük otozomal kromatin kütlesi ile yakından ilişkili olduğunu ve XY kromatin ile daha az ölçüde ilişkili olduğunu bildirdik. Kromatinle ilişkili bu yapıyı MINT (Mad1 içeren IntraNükleer Bölge)12olarak tanımladık. Diğer dört protein spermatositlerdeki MINT'lerle ilişkiliydi: nükleoporin Mtor / Tpr, SUMO peptidaz Ulp1, mitotik kontrol noktası proteini Mad2 ve Polikomla benzeri bir kompleksin alt bireyi Raf212.
MINT'lerin tanımını tamamlamak için antikor kullanmamız gerekiyordu ve testislerde genellikle immünostaining ile karşılaşılan teknik sorunlarla karşı karşıya kaldık: testislerin derinliğinde, özellikle de büyük spermatositlerde önemli bir homojenlik ile sonuçlanan zayıf bir geçirgenlik. Squashed preparatları antikor erişimini artırdı, ancak sıkıştırılmış görüntülere yol açtı, 3D analizleri kısıtladı ve kolokalizasyon da dahil olmak üzerenicel floresan ölçümünü önledi. Antikor penetrasyonu sorunu da % 0.3 Na deoksikollat13gibi permeabilizasyon edici ajanlar tarafından ele alınabiliyordu, ancak bu prosedür elimizde tekrarlanabilir sonuçlar vermedi. Birçok ortak etiketleme deneyi yaptığımız için, permeabilizasyon protokolünü geliştirmeye baktık. % 1 NP40 artı heptan kombinasyonu, özellikle büyük spermatositlerin incelenmesinde daha fazla tekrarlanabilirlik ile sonuçlandı.
Bu protokol, süspansiyondaki testislerin sabitlenmesi ve immünostainingini gerçekleştirir, numune kalitesini artırır, tekrarlanabilirliği artırır ve konfokal mikroskopi için uygun hale getirir. Protokolü, bazı nükleer zarf proteinlerinin büyük spermatositlerin nükleoplazmik yapılarıyla olan mekansal ilişkilerini daha iyi tanımlamak için kullandık. Bu yöntem, spermatosit gelişimine eşlik eden değişikliklerin, örneğin kromatin, nükleoplazma ve nükleer gözenekler de dahil olmak üzere çekirdeğin dinamik yapısal değişikliklerinin daha iyi araştırılmasına izin verecektir.

<table><tbody><tr><td>Drosophila srains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td><td></td><td></td><td>A. Debec'ten Hediye (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, Fransa)</td></tr><tr><td>Mad1-GFP</td><td></td><td></td><td>J Cell Sci. 2011 15 Mayıs; 124(Pt 10):1664-71.</td></tr><tr><td>Mtor RNAi&nbsp;</td><td>Vdrc</td><td>ID 110218</td><td>Viyana Drosophila RNAi Merkezi</td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td>Stok çözeltisi H2O</td></tr><tr><td>Dumont # 5 İnce Forseps&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBP Geniş Delikli Pipet</td><td>Uçları Fisherbrand</td><td>11917744</td><td>Geniş diyafram ucu</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; 0.2 mL Bireysel Tüp</td><td>Thermo</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>2 ml mikro santrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA&nbsp;</td><td>Silikonize 2ml tüp</td></tr><tr><td>Citifluor AF1</td><td>Citifluor</td><td>AF1</td><td></td></tr><tr><td>Dakopen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu (NGS)</td> <td>Sigma</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit% 4</td> <td>Sigma</td><td>P6148-500G ve nbsp;</td><td>paraformaldehit (% 4) PBS 1X&nbsp;; alikot 600 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>14190094</td><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td></tr><tr><td>%0,1 (%0,2 veya %0,3) PBS-T&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS 1X&nbsp; %0.1 (%0.2 veya %0.3) Triton X-100</td></tr><tr><td>Triton X-100 içeren, moleküler biyoloji için,&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP güçlendirici</td><td>Chromotek</td><td>gba488</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Fare anti-Mtor</td><td></td><td></td><td>1/40 J. Johansen'den hediye, Iowa Eyalet Üniversitesi</td></tr>, <tr><td>Sıçan anti-Nup62</td><td></td><td></td><td>H. Ohkura'dan 1/200 hediye (Edinburgh Üniversitesi, İngiltere</td></tr><tr><td>Gine domuzu anti-Ulp1</td><td></td><td></td><td>C. P. Verrijzer, Erasmus Üniversitesi, Rotterdam'dan 1/200 hediye</td></tr><tr><td>Tavşan anti-Raf2</td><td></td><td></td><td>C. P. Verrijzer, Erasmus Üniversitesi, Rotterdam'dan 1/200 hediye</td></tr><tr><td>DyLight konjuge serisi&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>1/500 Eşek anti-(kobay, fare, & nbsp; tavşan veya sıçan) ikinci antikor olarak</td></tr></tbody></table>

büyük spermatositlerin 3d konfokal analizi için tüm kazdağları drosophila testlerinin İmmünostaining

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Drosophila testisleri kök hücre biyolojisi, nükleer mimari, meiosis ve sperm gelişimi dahil olmak üzere biyolojik süreçleri incelemek için güçlü bir model sistemidir. Bununla birlikte, tüm Drosophila testislerinin immünolabelingi genellikle antikor penetrasyonu nedeniyle lekelemenin önemli ölçüde homojen olmayanlığı ile ilişkilidir. Ezilmiş preparatlar, analizlerin 3D kalitesini azalttığı için sorunun sadece kısmen üstesinden gelmektedir. Burada, sıvı ortamda immünolabeling ile birlikte fiksasyon sırasında NP40 ve heptane kullanan tam montajlı bir protokol açıklıyoruz. Konfokal mikroskopiye uygun hacmi tekrarlanabilir ve güvenilir etiketleme ile birlikte korur. Konfokal bölümlerden spermatosit çekirdeğinin 3D rekonsesinin farklı örneklerini gösteriyoruz. İntra-ve inter-testes tekrarlanabilirliği, farklı genotiplerden tek hücreler arasındaki floresanların 3D nicelleştirilmesine ve karşılaştırılmasını sağlar. Bu protokolü ve testislerin en büyük hücreleri olan S4-S5 spermatositleri üzerindeki uygulamalarını göstermek için intranükleer MINT yapısının (Mad1 içeren Intra Nükleer Bölge) farklı bileşenlerinin yanı sıra nükleer gözenek kompleksi ile ilişkili iki bileşen kullandık.

Drosophila testislerinin yeterli lekelenmesine yönelik en büyük engel, ezilmiş preparatlar kullanılarak kısmen çözülmüş olan ancak 3D analizlerin (örneğin 3D temsili veya kolokalizasyon ölçüsü) kısıtlanması pahasına antikorların sınırlı penetrability'dir. Prosedür tek tip etiketlemeye izin veriyor ve testislerin tüm hücrelerinin hacmini koruyor. Burada yöntemin illüstrasyonunu S4-S5 spermatositlerinin 3D temsiline odakladık, çünkü en büyük hücrelerdir ve böylece ezilme deformasyonuna karşı daha hassastırlar. Nükleoporinl...

Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Testis örnekleri gibi Drosophila dokularının tam montajlı boyanması, sınırlı antikor penetrasyonu nedeniyle genellikle sorunludur. NP40 ve heptan kullanan sabitleme protokolümüz, tek tip ve tekrarlanabilir bir etiketlemeye izin verir. Bu prosedür, derin antikor penetrasyonuna izin verirken doku şeklini koruyarak, hem tek başına hem de kolokalizasyon çalışmalarında üç boyutta immün boyamanın tekrarlanabilir, ölçülebilir edinimini kolaylaştırır.Diploid germ hücresi değerlendirmesi için, eklosiyondan sıfır ila 15 saat sonra, kısa bir karbondioksite maruz bırakarak sinekleri uyuşturun ve sinekleri bir sinek pedine aktarın. Pedi 10X büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve kafaları beş ila 10 erkek sineğin kafalarını çıkarmak için forseps kullanın. Kafası kesilmiş sinek gövdelerini, siyah bir arka plan desteği üzerinde silikon kaplı bir cam slayt üzerinde 100 mikrolitre Ringer tamponuna aktarın ve göğüs kafesi ile karın arasındaki bir sineği kavramak için 40X büyütme ve bir çift beş numaralı forseps kullanın.Daha sonra karnı torakstan uzaklaştırın ve testisleri ve bitişik dokuları sinek karkasından hızla izole edin. Tüm testisler toplandıktan sonra, kalan doku örneklerini temizleyin ve diseke edilen testislerin etrafındaki fazla tamponu çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Daha sonra testislerin üzerine% 4'lük bir damla paraformaldehit koyun ve dokuları hızlıca% 20 NP40 ve heptan ile desteklenmiş iki mililitre taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit çözeltisi içeren bir tüpe aktarın.Testis örneklerinin tam olarak sabitlenmesi için, testisleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döner bir karıştırıcı üzerinde inkübe etmeden önce tüpü 30 saniye dikey olarak çalkalayın. İnkübasyonun sonunda, tüpü bir tüp rafına aktarın ve testislerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Tüm heptan ve fiksatif solüsyonu çıkarın ve testisleri PBS ile üç kez hızlıca durulayın.Son yıkamadan sonra, testisleri 200 mikrolitrelik yeni bir tüpe aktarın ve fazla tamponu çıkarmak için 10 mikrolitrelik pipet ucu ile donatılmış 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra tüpe 200 mikrolitre taze PBS-Ekleyin ve testisleri buzun üzerine yerleştirin. Testis örneklerinin antikor etiketlemesi için, PBS'yi oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için 200 mikrolitre% 0.3 PBS-T ile değiştirin.Geçirgenlikten sonra,% 0.3 PBS-T ve% 5 normal keçi serumu ile oda sıcaklığında bir saat boyunca% 0.3 PBS-T ve% 5 normal keçi serumu ile seyreltilmiş 200 mikrolitre primer antikor eklemeden önce% 5 normal keçi serumu ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı bloke edin. Ertesi sabah, numuneleri taze% 0.3 PBS-T ile 15 dakikalık üç yıkama ile yıkayın ve yıkama başına oda sıcaklığında sallayın ve testislerin yerçekimi ile tüpün dibine çökmesine izin verin. Gösterildiği gibi, numuneleri yıkama başına taze% 0.3 PBS-T ile yıkamadan önce ışıktan korunan oda sıcaklığında sallanan dört saatlik bir inkübasyon için tüpe 200 mikrolitre uygun bir ikincil antikor ekleyin.%0,3 PBS-T yıkamasından sonra, numuneleri külbütör üzerinde yıkama başına 30 dakika boyunca %0,2 PBS-T'de bir kez ve %0,1 PBS-T'de bir kez yıkayın, ardından yalnızca PBS'de son 30 dakikalık bir yıkama yapın. PBS yıkamasından sonra, numuneleri PBS'de mililitre başına bir mikrogram DAPI çözeltisinin 180 mikrolitresi ile ışıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika boyunca etiketleyin, ardından yıkama başına taze PBS'de 5 dakikalık üç yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, temiz bir slayt üzerine bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın ve testisleri slayta aktarmak için %0,1 PBS-T astarlı pipet ucu kullanın.Fazla PBS'yi aspire edin ve 100 mikrolitre Citifluor AF1 ekleyin. Hava kabarcıklarının sıkışmamasına dikkat ederek dokunun üzerine nazikçe bir cam örtü astarı yerleştirin ve konfokal floresan mikroskobu ile slaytları gözlemlemeden önce kapak kaymasını slayta kapatmak için şeffaf oje kullanın. Numunelerin konfokal görüntülerini aldıktan sonra, görüntüleri uygun bir görüntü analiz yazılım programına aktarın.Ardından, her hücre içindeki çekirdeği tanımlamak için manuel segmentasyonu kullanın ve iki florofor arasındaki tüm hacim içindeki Pearson korelasyon katsayılarını belirleyin. Bu protokol, 3D sulandırma için tedavi edilecek yeterli kalitede konfokal görüntülerin elde edilmesine izin verir. Örneğin, bir evre S5 spermatositinin bu dört bitişik seri bölümünde, nükleer zarfta düşük bir Mad1 seviyesi gözlenir ve çekirdek içinde DAPI boyaması ile birlikte yüksek düzeyde bir Mad1 birikimi görselleştirilebilir.Bu 3D sulandırılmış görüntüde, nükleer yüzeyde Mad1'in düşük seviyeli varlığı ve çekirdek içinde yüksek seviyeli Mad1 birikimi DNA ile birlikte gözlemlenebilir. Bu 3D sulandırmalarda, Nucleoporin 62 ve Mad1 veya Importin-beta ve DAPI ile boyanmış büyük S5 spermatositleri gözlenebilir. Her iki rekonstrüksiyonda da, nükleer gözenekle ilişkili bileşenler, düzensiz boyutta noktalar olarak nükleer kenar üzerinde eşit olmayan bir şekilde dağılmış gibi görünmektedir.Hücrelerin 3D hacmini korurken, bu protokol aynı zamanda ilgilenilen antikorların her hücrenin derinliğine düzgün bir şekilde nüfuz etmesini kolaylaştırır ve kolokalizasyon gibi kantitatif analizlere izin verir. Protokol, bağımsız testislerden alınan kolokalizasyonların güvenilir bir şekilde ölçülmesine izin verdiğinden, farklı sinek genotiplerinde lekelenmeyi karşılaştırmak için de kullanılabilir. Kullanılan NP40 miktarı, yeterli geçirgenlik için kritik öneme sahiptir.Prosedür yakından takip edilirse, tekrarlanabilir etiketleme ve 3D nükleer yapı koruması sağlanabilir. Drosophila içindeki dokuların tam montajlı boyanması zor olsa da, bu protokol diğer numuneler için kolayca uyarlanabilir.

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Drosophila spermatogenez sırasında centrosomal proteinlerin Görüntüleme sentrozom biyoloji için önemli bir yeni proteinleri tespit etmek yanı sıra, bu işlem bilinen oyuncu belirli bir işlevi aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir.

Fly Testislerin görüntüleme centrosomes

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster'ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Burada, tam montajlı immünoboyama, çoklu foton mikroskobu ve 3D görselleştirme ve analiz kullanarak kantitatif ve kalitatif analizler için tüm yumurtalıkları görüntülemek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, toksikoloji, klinik teşhis ve yumurtalık fonksiyonunun genomik tahlilleri için geçerli olan yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir işlemeyi kapsar.

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Burada, konvansiyonel lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için erken Drosophila embriyolarında genişleme mikroskobunun uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Keşfedin Drosophila testislerinde tüm kazdağları immünostaining protokolü ile 3D konfokal analiz yöntemini. NP40 ve heptan kullanan bu teknik, antikor penetrasyonunu artırarak büyük spermatositlerde güvenilir protein lokalizasyonu sağlar.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

Daha fazla video keşfet