Name: Sucul Ekosistemlerde Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Situ Chemotaxis Tsayda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Öğrenin, ISCA mikroakışkan cihazı kullanarak sucul ekosistemlerde mikrobiyal kemotaksisi in situ nicelendirmeyi. Bu yöntem, mikroorganizmaların metabolik potansiyelini anlamak ve izole etmek için esnek bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma kısmen Gordon ve Betty Moore Vakfı Deniz Mikrobiyolojisi Girişimi tarafından, J.R.S. ve R.S.'ye GBMF3801 ve R.S.'ye bir Araştırmacı Ödülü (GBMF3783) aracılığıyla finanse edilmiştir. yanı sıra Avustralya Araştırma Konseyi Bursu (DE160100636) J.B.R., Simons Vakfı'ndan B.S.L.'ye (594111) bir ödül ve Mikrobiyal Ekosistemler İlkeleri (PriME) İşbirliğinin bir parçası olarak Simons Vakfı'ndan (542395) R.S.'ye hibe.

Sonuçları optimize etmek için alan denemelerini önce bölüm 1'i yürütmenizi öneririz.
1. Laboratuvar optimizasyonu
NOT: Optimizasyon prosedüründe açıklanan birimler tek bir ISCA (20 kuyudan oluşur) için yeterlidir.
<ol><li>İlgi kimyasalının hazırlanması NOT: Her kemoattractant için en uygun konsantrasyon genellikle saha dağıtımları öncesinde laboratuvar koşullarında belirlenmelidir. Kimyasal konsantrasyon alanı kaynaktan uzaklığı ile büyüklüğü azalacaktır (ISCA iyi), hangi ortamda mikroorganizmalar tarafından deneyimli konsantrasyon cihazın içinde mevcut daha düşük olacağı anlamına gelir. ISCA'da kullanılacak en uygun konsantrasyon kemoattractantın difüzyon hızına bağlıdır. Kuyudaki konsantrasyon çok düşükse (mikropların algılama sınırına yakın) pozitif kemotaksis gözlenmez. Tersine, kuyudaki konsantrasyon çok yüksekse, yakın çevrede konsantrasyon da yüksek olacaktır ve mikrobiyal birikim isca kuyularının üzerinde değil, içinde oluşacaktır. Bu nedenle, alan dağıtımları için en uygun konsantrasyonu belirlemek için seyreltme serileri her bir bileşiğin laboratuvar koşullarında yapılmalıdır. İdeal olarak, laboratuvar sonuçlarını doğrulamak için sahada bir konsantrasyon aralığı da test edilmelidir.<ol>
<li>Uygun tuz konsantrasyonu (örneğin, fosfat tamponlu tuzlu [PBS] veya yapay deniz suyu içeren uygun bir ortam 2,5 L hazırlayın. Orta makineyi peristaltik veya vakum pompası ve otoklav kullanarak 0,2 μm filtre ile filtreleyin.</li>
		<li>Steril ortamda 1 mL'de 10 mM'lik kemoattractant çözeltisi hazırlayın. Partikülleri ve potansiyel kirleticileri temizlemek için kemoattractant çözeltisini 0,2 m şırınga filtresi ile filtreleyin. NOT: İdeal olarak, nihai çözeltide kemoattractant dışında hiçbir organik bileşik bulunmamalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Seyreltme serileri ile konsantrasyon aralığı<ol>
<li>Filtrelenmiş chemoattractant stok çözeltisini seri olarak seyreltin, (örneğin) 10 mM ile 100 μM arasında değişen. NOT: Test edilen konsantrasyon başına en az 0,7 mL son hacim gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>ISCA'nın yüklenmesi<ol>
<li>1 mL'lik bir şırıngayı filtrelenmiş kemoattractantla doldurun ve 27 G şırıngaya bağlayın. ISCA'yı yukarı bakacak şekilde tutarken, bağlantı noktasının üstünde küçük bir damlacık belirene kadar maddeyi yavaşça enjekte edin. NOT: 1) Çapraz kontaminasyonu önlemek için her seyreltme veya maddeye ayrı bir şırınga ve iğne enjekte edilmelidir. 2) Bu küçük damlacık, hiçbir hava kabarcığı liman içinde sıkışıp kalmasını sağlar, bu da mikropların liman dan göç yeteneğini bozabilir çünkü önemlidir. 3) Daha fazla analiz için yeterli minimum hacim sağlamak için madde veya konsantrasyon (beş kuyu) başına bir satırın tamamının doldurulması önerilir. 4) ISCA başına bir satır negatif kontrol olarak hareket etmeli ve mikropların askıya alınacağı filtrelenmiş ortamla doldurulmalıdır. Bu tedavi, mikropların rastgele hareketliliğin ISCA kuyularına etkisini hesaplar ve kemoattractant içeren tedavileri normalleştirmek için kullanılmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Laboratuvarda dağıtım<ol>
<li>Bir gecede, %1 deniz suyu (deniz bakterileri için) veya %1 lisojen suyu (LB, tatlı su bakterileri için) ile zenginleştirilmiş 5 mL'lik bir kültürü kuluçkaya yatırın. NOT: Motile bakteriyel izole veya doğal bakteri toplulukları laboratuvar dağıtımları için kullanılabilir.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 12 saat (RT) ve 180 rpm kültür kuluçka. 12 saat sonra, mikrobiyal toplulukların mikroskop altında doğrudan gözlem le hareket eden bir şekilde hareket lediğinden emin olun.</li>
		<li>Kültürü 10 dk için 1.500 x g'da döndürün ve 150 mL'lik 1/100'ü uygun ortama (örn. filtrelenmiş deniz suyu, filtrelenmiş tatlı su) yeniden askıya alın.</li>
		<li>200 mL kapasiteli tepsinin düz yüzeyine iki küçük çift taraflı yapışkan bant yerleştirin (1 mL uçlu kutuların kapakları bu amaç için ideal boyutlara sahiptir ve kolayca otoklavlanabilir). Bir ISCA'yı teybe güvenli bir şekilde takmasını sağlamak için en üste yerleştirin. 50 mL serolojik pipet kullanarak dağıtım tepsisini yavaşça bakteriyel solüsyonla doldurun. NOT: ISCA yaklaşık 1-2 cm sıvı nın altına batırılana kadar tepsiyi doldurun. Birden çok tepsi kullanıyorsanız, tüm genelinde aynı ses düzeyini kullanın.</li>
		<li>Bakteriyel kemotaksis izin vermek için 1 saat kuluçka için ISCA bırakın. 1 saat sonra, türbülanslı akışı en aza indirmek için 50 mL serolojik pipet ile ortayı çok hafifçe çıkarın.</li>
		<li>ISCA'yı üst yüzeye dokunmadan dağıtım tepsisinden alın. ISCA yüzeyinde kalan sıvıyı çıkarmak için bir pipet ve tek kullanımlık silecek kullanın. NOT: Bu işlem sırasında limanlara dokunmaktan kaçınmak önemlidir, çünkü basınçtaki değişiklikler dış ortamdan kuyuya bakteri ekleyebilir veya ekleyebilir ve böylece kuyunun içindeki bakteri yoğunluğunu ve bileşimini saptırır.</li>
	</ol></li>
	<li>Örneklerin alınması<ol>
<li>ISCA'yı port aşağı bakacak şekilde tutarak, 1 mL şırıngaya bağlı steril 27 G şırınga iğnesi kullanarak kuyuların hacmini alın. NOT: Her satır (aynı maddeyi içeriyorsa) yaklaşık 550 μL'lik bir çalışma numunesi sağlamak için bir araya alınabilir. Bu örnek daha sonra gerekli downstream uygulamalarına bağlı olarak farklı tüpler içine aliquoted olabilir.</li>
		<li>Akış sitometrisi12ile numuneleri analiz ederek her kemoattractant konsantrasyonuna çekilen bakteri sayısını belirleyin. Sonraki alan dağıtımları için kemotaksisi en üst düzeye çıkaran kemoattractant konsantrasyonu seçin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Saha konuşlandırması için hazırlık
NOT: Malzemenin hazırlanması ve akış sönümleme muhafazasının (bölüm 2) inşaatı dağıtımdan önce yapılmalıdır.
<ol><li>Malzemelerin hazırlanması<ol>
<li>Tablo 1'delistelenen tüm malzemeleri hazırlayın. NOT: Malzeme miktarları bir ISCA için sağlanmaktadır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış sönümleme muhafazasının yapımı ve hazırlanması NOT: Akış sönümleme muhafazası, ISCA'dan yayılan kimyasal degradelerin oluşmasını engelleyen istenmeyen türbülansları en aza indirir.<ol>
<li>3 mm'lik akrilik bir levhadan lazer kesici ile dağıtım muhafazası için parçaları kesin. NOT: Parçalar için dosya aşağıdaki linkten bulunabilir: <https://figshare.com/articles/Flow_damping_enclosure_for_ISCA_deployments/10630220>.</li>
		<li>Şekil 2'de gösterildiği gibi lazer kesim parçaları akrilik tutkal kullanarak birleştirin. NOT: Parçaları özenle monte edin. Delikler veya yanlış hizalama, dağıtım sırasında sızıntılar oluşturabilir ve bu da veri kalitesini doğrudan etkiler.</li>
		<li>Birleştirilmiş muhafazayı bir gecede kurumaya bırakın.</li>
		<li>Muhafazayı deiyonize suile yıkayın.</li>
		<li>Kasaya deiyonize su dökerek potansiyel sızıntıyı belirleyin. Daha fazla akrilik tutkal ekleyerek herhangi bir potansiyel sızıntı eklemdüzeltmek, sonra adımları tekrarlayın 2.2.3-2.2.5.</li>
		<li>VIDA ipliklerini ISCA'yı sabitlemek için kullanılacak akrilik parçaya kesin. Bu, montaj vidaları ile eşleşen bir çap ve adım ile bir musluk kullanılarak elde edilebilir.<ol>
<li>İlk olarak, bir musluk anahtarı içine musluk yapıştırın, sonra bir tezgah vice dokundu akrilik parça güvenli. En iyi sonuçlar için, akrilik parça mümkün olduğunca seviye olduğundan emin olun. Musluğun akrilik parçaya dik olduğundan emin olun ve musluk anahtarını (saat yönünde) çevirerek musluğa ışık basıncı uygulayın.</li>
			<li>Akrilik parça birkaç tam devrimler sonra, musluk akrilik temizlemek için bir rotasyon dörtte biri için (saat yönünün tersine) dokunun dönüşünü tersine çevirin. Akrilik parçanın tüm derinliği dokunana kadar işlemi tekrarlayın.</li>
			<li>Son olarak, musluğu çıkarın (saat yönünün tersine çevirin) ve bir vida kullanarak ipleri test edin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sahada prosedür
<ol><li>Su filtrasyonu<ol>
<li>Deneye başlamaya hazır olduğunuzda saha alanından su toplayın. 50 mL konik santrifüj tüpüne 0,2 μm şırınga filtresi (50 mL şırınga ile) ile ISCA başına 5 mL su filtreleyin. NOT: Bir ISCA'nın tüm kuyularını doldurmak için yaklaşık 3 mL filtrelenmiş su gereklidir; ancak, dört lü filtrasyon işlemi sırasında ki kayıpları hesaba katmak için cihaz başına 5 mL filtre leme ve 2) filtratların hem akış sitometrisi hem de moleküler prosedürler için negatif kontroller olarak korunması önerilir.</li>
		<li>Filtrasyonu 0,2 μm'lik hidrofilik GP filtre kartuşu (aynı, her iki seferde kullanarak) yeni bir 50 mL şırınga ile yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne iki kez süzün. Filtronu 0,02 m şırınga filtresinden (yeni bir 50 mL şırıngayla) yeni bir 50 mL konik tüpe süzün. NOT: Bu dörtlü filtrasyon su hemen hemen tüm mikroorganizmalar ve parçacıklar kaldırmalıdır. Kullanıma kadar son filtratı herhangi bir ısı kaynağından uzak tutun. Bu su, ISCA'da kullanılan tüm kimyasalları yeniden askıya almak için kullanılacak ve dağıtım yerindeki suyla aynı sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. ISCA kuyuları ile dış ortam arasındaki sıcaklık farklılıklarının tetiklediği konvektif akışlar oluşabilir.</li>
		<li>15 mL konik santrifüj tüplerinde istenilen konsantrasyonlarda ilgi (genellikle kuru) tüm kemoattractants (genellikle kuru) askıya almak için filtrate aliquots kullanın.</li>
		<li>İstenmeyen partikülleri veya suda çözünmeyen bileşikleri (ekstreler kullanıyorsanız) çıkarmak için yeniden askıya alınan kemoçekanları steril 15 mL konik santrifüj tüplerine 10 mL şırınga ile 0,2 m şırınga filtresinden filtreleyin. NOT: Partiküllerin filtreden geçmesini önlemek için hafifçe filtre uygulayın. Ultrafiltrelenmiş sudaki kemoçekanları saha alanından yeniden uzaklaştırmak ve diğer çözeltilere dönüştürmemek önemlidir. Alan alanından su kullanarak (1) yoğunluk odaklı akışını önlemek için toplu çevresel su olarak kuyuiçinde aynı tuz konsantrasyonu elde etmek için gereklidir, ve (2) arka plan besin düzeyleri kuyu içinde ve dışında eşit olduğunu garanti.</li>
	</ol></li>
	<li>ISCA dolumu<ol>
<li>ISCA'yı doldurmak için bölüm 1.3'u gerçekleştirin. NOT: Madde başına bir satır (beş kuyu) doldurulması tavsiye edilir (yani, ISCA başına üç farklı madde ve bir ultra filtrelenmiş deniz suyu kontrolü).</li>
	</ol></li>
	<li>Alanda dağıtım<ol>
<li>ISCA(Şekil 3A)kasanın 9'una(Şekil 2K ve Şekil 3B)vidalayın. NOT: Yukarıda özetlenen akış sönümleme muhafazası, iki ISCA'yı yan yana veya merkezinde yer alan bir ISCA içerebilir.</li>
		<li>Muhafazayı kapatın(Şekil 3C)ve yapışkan bantla kapatın (Şekil 3D). NOT: Kırışıklıklar mükemmel bir mühür sağlamak için kaçınılmalıdır. Tüm tarafları önce mühürleyin, sonra (ikinci bir adımda) örnekleme sonunda kasadan suyu boşaltmak için kullanılacak yan delikleri kapatın. Üst ve alt delikleri mühürlemeyin. ISCA'yı baş aşağı yerleştirmeyin, çünkü yoğuşma içeren kuyularda yoğunlukla çalışan akış oluşabilir, bu da kuyudaki hücre sayısını saptırır.</li>
		<li>Muhafazanın dağıtım sırasında sabit kalması gerektiğinden, bungee kabloları kullanılarak insan yapımı yapılara (örneğin, ponto, merdiven) takılması önerilir. NOT: Kasa, suya dalmadan önce bungee kabloları kullanılarak bir dağıtım koluna (burada, dik platformlu modifiye li modifiye li bir kelepçe) takılabilir. Alternatif olarak, kasa sığ yüzeylerde küçük bir ağırlıkla doldurulabilir ve sabitlenebilir. Dağıtımlar pelajik okyanusta tasarlanmıştırsa, kasa bir tarafında şamandıra, diğer tarafta ağırlık olan bir ağa bağlanabilir.</li>
		<li>Doldurmaya başlamak için muhafazayı tamamen batırın. Doldururken, içaşırı su hareketini önlemek için muhafazayı sıkıca tutun. Suyun seviyesi kasanın üst seviyesine ulaştığında, içeride hava nın sıkışmadığından emin olun. NOT: Bazı hava kabarcıklarının sıkışması durumunda, kapağı yukarı bakacak şekilde yavaşça yatırın, bu da kabarcıkların kaçmasını sağlayacaktır.</li>
		<li>Tamamen dolduktan sonra, alt ve üst delikleri silikon veya kauçuktan veya 20 μL pipet uçlarının ekstremitelerini mühürleyerek yapabilen iki fişle kapatın (Şekil 4). NOT: Bu adım örnekleme sırasında muhafazanın içindeki akışı önler.</li>
		<li>ISCA'yı örnekleme için 1-3 saat bekletin. NOT: İdeal dağıtım süresi öncelikle suyun sıcaklığı ve bakteri topluluğunun iki katına kadar dikte edilir. Su sıcaklığı 20 °C'nin üzerinde olduğunda, ISCA'nın 1 saatten fazla dağıtılması tavsiye edilmez, çünkü hücre bölünmesi 1,5-2.0 saatten sonra kemoattractants içeren kuyularda oluşabilir. Ancak, en uygun dağıtım süresi, doğal toplulukları yüklenen kimyasallarla değiştirerek ve zaman içinde hücre sayısını ölçerek ISCA denemesinden önce test edilebilir.</li>
		<li>Muhafazayı sudan çıkarın. Suyun kasadan boşaltılmasını sağlayan bir kabın üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Yapışkan bandın üst kısmını ön deliklerden çok nazikçe çıkarın. NOT: Kasadan çıkan suyun akışı damlama hızında olmalıdır. Kasanın üstünden en altına kadar her seferinde bir deliğe devam edin. Kasanın tamamen boşaltılaması yaklaşık 10-15 dakika sürmelidir.</li>
		<li>Su hattı ISCA'nın üst kısmı altından geçtikten sonra, alt fişi çıkarın ve suyun geri kalanını boşaltın.</li>
		<li>ISCA'lar hala kasaya bağlıyken, 1 mL pipetle ISCA'nın üzerine sıkışmış suyu dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>IsCA'yı üst yüzeye dokunmadan çıkarın ve yüzeyde kalan sıvıyı çıkarmak için tek kullanımlık bir silme kullanın. NOT: Bu işlem sırasında bağlantı noktalarına dokunmamak önemlidir, çünkü basınçtaki değişiklikler kuyuya dökme bakterileri kaldırabilir veya ekleyebilir ve bakteri sayılarını saptayabilir.</li>
		<li>ISCA'dan 1.5.1 adımını tekrarlayarak örnekleri alın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Downstream uygulamaları
NOT: Hacimler 550 μL'lik bir örneğe (bir ISCA satırı) göre verilir.
<ol><li>Her çekici için kemotaksisi ölçmek için akış sitometrisi için glutaraldehit (%2 nihai konsantrasyon) ile iyi içeriği100 μL düzeltin. NOT: Buzüzerinde (veya 4 °C'de) saklayın ve örnekleri aynı gün analiz edin. Alternatif olarak, analiz aynı gün mümkün değilse, fiksasyon sonrasında sıvı nitrojen dondurulmuş örnekler flaş olabilir. Akış sitometrisi, ISCA kuyularında bulunan hücre sayısını ölçmek için önerilen yöntemdir, çünkü basit, hızlı ve doğru12.</li>
	<li>Sonraki DNA çıkarma ve analiz için sıvı nitrojen de iyi içerik 300 μL snap dondurma11. NOT: Numuneleri analiz edilene kadar -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>10 μL TE-gliserol tamponuna 90 μL kuyu içeriği ekleyin ve tek hücreli genomik13için numuneleri tutturun.</li>
	<li>Bakteriyel izolasyon için istenilen ortamı içeren agar plakalarına 10-20°L yayın.</li>
</ol>

<ol><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+microbes+see+a+sea+of+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marine microbes see a sea of gradients.</a> Science. 338, 628-633 (2012).</li>
<li>Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microbial+motility+and+chemotaxis+in+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).</li>
<li>Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+of+bacteria+from+marine+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Repulsion of bacteria from marine surfaces.</a> Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).</li>
<li>Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+toward+phytoplankton+drives+organic+matter+partitioning+among+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria.</a> PNAS. 113, 1576-1581 (2016).</li>
<li>Matilla, M., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+bacterial+chemotaxis+on+host+infection+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).</li>
<li>Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in bacteria.</a> Science. 153, 708-716 (1966).</li>
<li>Adler, J., Dahl, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+measuring+the+motility+of+bacteria+and+for+comparing+random+and+non-random+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility.</a> Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).</li>
<li>Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for bacterial chemotaxis.</a> Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).</li>
<li>Hol, F. J. H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in+to+see+the+bigger+picture%3A+microfluidic+and+nanofabrication+tools+to+study+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria.</a> Science. 346, 1251821(2014).</li>
<li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).</li>
<li>Lambert, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+situ+chemotaxis+assay+to+study+the+behaviour+of+aquatic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities.</a> Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).</li>
<li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).</li>
<li>Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaworzewska%2C+ET+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , (1982).</li>
<li>Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudation+and+rhizosphere+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Root exudation and rhizosphere biology.</a> Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Sucul mikroorganizmaların ölçeğinde, çevre homojen olmaktan uzaktır ve genellikle mikrobiyal toplulukları1,15yapı fiziksel / kimyasal degradeler ile karakterizedir.15 Hareketli mikroorganizmaların davranış kullanma kapasitesi (yani kemotaksis) bu heterojen mikroortamlarda avlanmayı kolaylaştırır1. Chemotaksilerin doğrudan çevrede incelenmesi, önemli interspesifik etkileşimleri ve kimyasal tercihleri belirleme potansiyeline sahiptir ve bu d...

Çeşitli mikroorganizmalar yamalı besin ortamları yararlanmak için hareketlilik ve kemotaksiler kullanın, konakları bulmak, ya da zararlı koşullarönlemek 1,2,3. Bu mikrobiyal davranışlar sırayla kimyasal dönüşüm oranlarını etkileyebilir4 ve karasal genelinde simbiyotik ortaklıklar teşvik, tatlı su, ve deniz ekosistemleri2,5.
Kemotaksis kapsamlı son 60 yıldır laboratuvar koşulları altında incelenmiştir6. Kemotaksis çalışma için ilk kantitatif yöntem, kılcal dosdoğru, bir putatif kemoattractant bakteri bir süspansiyon batırılmış dolu bir kılcal tüp içerir6. Tüpün dışarı kimyasal difüzyon bir kimyasal gradyan oluşturur, ve kemotaktik bakteriler tüp içine göç ederek bu degrade yanıt7. Kılcal damar tofaş gelişiminden bu yana, hala yaygın olarak bugün kullanılan, birçok diğer teknikler giderek kontrol fiziksel / kimyasal koşullar altında kemotaksis çalışma geliştirilmiştir, en son mikroakışkanların kullanımını içeren8,9,10.
Mikroakışkanlar, yüksek hızlı video mikroskobu ile birlikte, dikkatle kontrol edilen degradelere yanıt olarak tek hücrelerin davranışlarının izlenmesini sağlar. Bu teknikler kemotaksis anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiş olsa da, laboratuvar kullanımıyla sınırlandırılmıştır ve çevre sistemlerinde saha dağıtımına kolayca çevrilmemektedir. Sonuç olarak, doğal bakteri topluluklarının doğal ekosistemler içinde kemotaksis kullanma kapasitesi incelenmemiştir; bu nedenle, kemotaksisin potansiyel ekolojik önemine yönelik mevcut anlayış yapay laboratuvar koşullarına ve sınırlı sayıda laboratuvar kültürlü bakteri izoleedilmesine yöneliktir. Son zamanlarda geliştirilen ISCA bu sınırlamalar11üstesinden .
ISCA kılcal damar tözünün genel prensibine dayanmaktadır; ancak, doğal ortamda ilgi bileşikleri doğru kemotaksis nicelleştirilmesi için son derece çoğaltılmış, kolayca dağıtılabilir deneysel platform sunmak için modern mikroüretim teknikleri kullanır. Ayrıca kemotaktik mikroorganizmaların doğrudan izolasyon veya moleküler tekniklerle tanımlanmasını ve karakterizasyonunu sağlar. İlk çalışma cihazı kendi kendine imal edilmiş ve cam ve PDMS11inşa edilmiş iken, en son enjeksiyon kalıplı versiyonu polikarbonat oluşur, son derece standart üretim prosedürü kullanarak (cihazın en son sürümü ilgi için, ilgili yazarlar temasa geçilebilir).
ISCA kredi kartı büyüklüğündedir ve her biri dış su ortamına küçük bir bağlantı noktası (800 μm çapında) ile bağlanan 5 x 4 kuyu halinde dağıtılan 20 kuyudan oluşur; Şekil 1). Kuyulara yüklenen putatif kemoattractants liman üzerinden çevreye yayılır ve kemotaktik mikroplar limandan kuyuya yüzerek tepki verir. Doğal ortamdaki bir ISCA deneyinin sonucunu etkileyen birçok faktör olduğundan, bu adım adım protokol yeni kullanıcıların olası engelleri aşmasına ve etkili dağıtımları kolaylaştırmasına yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Akrilik yapıştırıcı</td><td>Evonik</td><td>1133</td><td>Acrifix 1S 0116</td></tr><tr><td>Akrilik levha</td><td>McMaster-Carr</td><td>8505K725</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Yapışkan bant</td><td>Scotch</td><td>3M 810</td><td>Scotch Magic bant</td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Systec</td><td>D-200</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002451</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Bungee cord</td><td>Paracord Planet</td><td>667569184000</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü - 2 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR780546-500EA</td><td>Eppendorf tüpü</td></tr><tr><td>Konik santrifüj tüpü - 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11507411</td><td>Falcon tüpü</td></tr><tr><td>Konik santrifüj tüpü - 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10788561</td><td>Falcon tüpü</td></tr><tr><td>Dağıtım kolu</td><td>Irwin</td><td>1964719</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Dağıtım muhafaza fişi</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>El yazmasındaki alternatiflere bakın</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık silecekler</td><td>Kimtech - Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>Beckman</td><td>C09756</td><td>CYTOFlex</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde %25</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Yeşil floresan boya</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9430</td><td>SYBR Yeşil I - 1:10.000 son seyreltme</td></tr><tr><td>Hidrofilik GP filtre kartuşu - 0,2 & m</td><td>Merck</td><td>C3235</td><td>Sterivex filtre</td></tr><tr><td>Yerinde Kemotaksis Testi (ISCA)</td> <td>-</td><td></td> <td>İlgili yazarlarla iletişime geçin</td></tr><tr><td>Lazer kesici</td><td>Epilog Laser</td><td>Fusion pro 32</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Deniz Suyu 2216</td><td>VWR</td><td>90004-006</td><td>Difco</td></tr><tr><td>Naylon oluklu düz başlı vidalar</td><td>McMaster-Carr</td><td>92929A243</td><td>M 2 & kez; 4 & kez; 8 mm</td></tr><tr><td>Pipet seti</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Pipet uçları - 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-2A</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Pipet uçları - 20 & L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Pipet uçları - 200 & L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-1</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Deniz tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9883</td><td>Yapay deniz suyu için</td></tr><tr><td>Serolojik pipet - 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SIAL1490-100EA</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi - 0.02 ve mikro; m</td><td>Whatman</td><td>WHA68091002</td><td>Anatop filtre</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi - 0.2 ve mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>10695211</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Şırınga iğnesi 27G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td>0.4 & kez; 12 mm</td></tr><tr><td>Şırıngalar - 1 mL</td><td>Codau</td><td>329650</td><td>İnsülin Luer U-100</td></tr><tr><td>Şırıngalar - 10 mL</td><td>BD</td><td>303134</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Şırıngaları - 50 mL</td><td>BD</td><td>15899152</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Tüpü raf - 15 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Tüp rafı - 50 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Kaplamasız Yüksek Hız Çeliği Genel Amaçlı Musluk</td><td>McMaster-Carr</td><td>8305A77</td><td>Veya farklı şirket</td></tr><tr><td>Vakum filtresi - 0.2 ve mikro; m</td><td>Merck</td><td>SCGPS05RE</td><td>Steritop filtresi</td></tr></tbody></table>

sucul ekosistemlerde mikrobiyal davranışı İncelemek için situ chemotaxis tsay'da

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Motilite ve kemotaksis (bir hücrenin kimyasal bir degradeye yanıt olarak hareketini değiştirme yeteneği) gibi mikrobiyal davranışlar bakteriyel ve arke-dizilme deresi arasında yaygındır. Kemotaksiler heterojen ortamlarda önemli kaynak edinimi avantajlarına neden olabilir. Ayrıca biyojeokimyasal bisiklet gibi simbiyotik etkileşimler, hastalık ve küresel süreçlerde de önemli bir rol oynar. Ancak, mevcut teknikler laboratuvariçin kemotaksis araştırma kısıtlamak ve alanında kolayca uygulanabilir değildir. Burada sunulan in situ chemotaxis test (ISCA), doğrudan doğal ortamda mikrobiyal kemotaksilerin sağlam sorgulama sağlayan bir cihaz dağıtım için adım adım protokoldür. ISCA, 20 kuyu dizisinden oluşan ve ilgi çekici kimyasalların yüklenebileceği bir mikroakışkan cihazdır. Sulu ortamlarda konuşlandırıldıktan sonra kimyasallar kuyulardan dışarı yayılır ve mikropların hissedip tepki verdiği konsantrasyon degradeleri oluşturur. Kuyu içeriği daha sonra örneklenebilir ve kullanılabilir (1) akış sitometri yoluyla belirli bileşiklere kemotaktik yanıtların gücünü ölçmek için, (2) izole ve kültür duyarlı mikroorganizmalar, ve (3) moleküler teknikler yoluyla yanıt veren popülasyonların kimlik ve genomik potansiyelini karakterize. ISCA, deniz, tatlı su ve toprak ortamları da dahil olmak üzere sulu faza sahip her sistemde konuşlandırılabilen esnek bir platformdur.

Bu bölümde, deniz mikroplarının toprak bakterisini cezbettiği bilinen bir amino asit olan glutamin konsantrasyon aralığına kemotaktik tepkisini test etmek için ISCA kullanılarak laboratuvar sonuçları vermiştir14. Laboratuvar testlerinde en güçlü kemotaktik yanıtı ortaya çıkaran glutamin konsantrasyonu, deniz ortamında kemotaksi testi yapmak için kullanıldı.
Laboratuvar testleri gerçekleştirmek için, Sydney kıyı suyundan örneklenen deniz suyu toplulukları, Avustralya, ba...

Burada sunulan bir in situ kemotaksis test için protokol, çevrede doğrudan mikrobiyal davranış çalışmaları sağlayan yeni geliştirilen mikroakışkan bir cihaz.

Sucul Ekosistemlerde Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Situ Chemotaxis Tsay'da

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread ...

Protokolümüz, mikrobiyal kemotaksileri doğrudan kendi yaşam alanlarında sağlam bir şekilde ölçmemizi sağlar. Ve bu şekilde mikroorganizmaları izole edebilir ve metabolik potansiyeli daha iyi ölçebilir ve anlayabiliriz. In situ chemotaxis tsay, ya da kısaca ISCA, mikrobiyal davranışlar ve bu nedenle rol ve sıvı faz olan herhangi bir ortamda mikroorganizmaların işlevi içine yeni bir fikir sağlayan esnek, kullanıcı dostu ve basit bir cihazdır.Hem laboratuvarda hem de sahada konuşlandırma prosedürünü gösteren estelle Clerc, şu anda araştırma grubumda doktora öğrencisi. Kemoattractant'ı hazırlamadan önce ortamı 0,2 mikrometre filtreile filtreleyin ve filtrelenmiş çözeltiyi otomatik olarak tökezleyin. Daha sonra, steril ortamın 1 mililitresinde 10 milimolar kemolar çözelti hazırlayın ve herhangi bir partikül ve potansiyel kirletici maddeyi çıkarmak için kemoattractant çözeltisini 0,2 mikrometreşırık filtresiile filtreleyin.Daha sonra, deneysel protokole göre, seri olarak filtrelenmiş kemoattractant stok çözeltisi seyreltin. Bir ISCA'yı doldurmak için, 1 mililitrelik şırıngaya 27 kalibrelik bir iğne takın ve filtrelenmiş kemotomisin her konsantrasyonu için bir şırınga yükleyin. Cihazı bağ

in-situ-chemotaxis-assay-to-examine-microbial-behavior-aquatic

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Kayma akışı içinde derme çatma bir besin bir deniz manzarası ve yüzme davranışı içinde bakteri deniz mikropların kemotaktik toplayıcı davranış eğitimi için mikroakışkan kanalları ve deneylerde bunların uygulanmasını imalat açıklanmıştır.

Mikro Ölçekli Besin Katmanlar Deniz Mikro-organizmalar kemotaktik Tepki

Mikroakiskan kullanarak Bakteriyel Kemotaksis Çalışmaları - Röportaj

Bu protokol, chemoeffectors istikrarlı konsantrasyon gradyanlar bakteriyel kemotaksis soruşturma için bir mikroakışkan aygıt geliştirme açıklar.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

ECIS / Taksiler sistemi hücresel kemotaksis ölçer otomatik, gerçek zamanlı bir testtir. Bu deneyde, bir hedef hücreler elektrot varmak için agaroz bir katmanı altındaki hareket eder. Hücresel hareketi AC akım 0 direnç başlangıcı ile ölçülür.

ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü

Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir...

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Bu çalışma, kirleticilerin ekotoksisitesini değerlendirmek için nanomalzemeler gibi gelişmekte olan bulaşıcılar da dahil olmak üzere deniz bakterisini Vibrio anguillarum kullanarak yeni bir protokolü açıklamaktadır . Bu yöntem, LC 50'nin veya 6 saatlik maruz kaldıktan sonra bakteri kültürlenebilirliğinde% 50 azalmaya neden olan ölüm konsantrasyonunun belirlenmesine izin verir.

Deniz Bakterileri ile Ekotoksikolojik Yöntem<emVibrio anguillarum</em&gt; Çevresel Kirleticilerin Akut Zehirliliğini Değerlendirmek

Nematodun, Caenorhabditis elegans'ın , nüfusa dayalı bir deneyde çözünür bileşikler için tercihinin otomatik analizini sağlayan bir davranış kayıt kurulumu ve protokolü sunuyoruz. Bu makale bir davranış odasının inşasını, davranışsal analiz protokolünü ve video analiz yazılımının kullanımını anlatıyor.

Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

Mikroakışkan ve miliakışkan kurulumlar içinde fotolik tarafından dinamik kimyasal manzara üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hem tek hücre hem de popülasyon düzeyinde, hareketli davranış, besin alımı veya mikroorganizmaların kimyasallarına adaptasyon dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için uygundur.

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

Burada, geliştirilmiş bir kemotaksi test protokolü sunuyoruz. Bu protokolün amacı, geleneksel bakteriyel kemotaksi yöntemlerinin adımlarını ve maliyetlerini azaltmak ve bitki-mikrop etkileşimlerini anlamak için değerli bir kaynak olarak hizmet etmektir.

Kök Eksüdalarında Rhizobacterial Kemoattractants'ın Hızlı Tanımlanması için Geliştirilmiş Bir Kemotaksi Tahlili

Santrallerden kaynaklanan baca gazı alg büyüme için ucuz bir CO 2 kaynağıdır. Biz sistemleri "ekimi alg için baca gazı" prototip inşa ve alg ekimi işlemini büyütmek için nasıl tarif var. Biz, Chlorella sp büyümesi için baca gazının optimum operasyon ve tasarım simülasyonu için kütle transferi bio-tepki modelinin kullanımı göstermiştir. alg fotoğraf biyoreaktörlerde.

Bilgisayar simülasyonları ile fotobiyoreaktörler içinde Mikroalgler Büyüme teşvik için Baca Gazı ayarlarını optimize

Öğrenin, ISCA mikroakışkan cihazı kullanarak sucul ekosistemlerde mikrobiyal kemotaksisi in situ nicelendirmeyi. Bu yöntem, mikroorganizmaların metabolik potansiyelini anlamak ve izole etmek için esnek bir yaklaşım sunar.

Sucul Ekosistemlerde Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Situ Chemotaxis Tsay'da

Daha fazla video keşfet