Name: Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Öğrenin, patates virüsü X bazlı mikroRNA susturma yöntemiyle Solanum tuberosum'da endojen mikroRNA'ların hızlı fonksiyonel karakterizasyonunu. Bu sistem, stabil dönüşüm gerektirmeden etkili analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PVX-LIC vektörü sağladığı için Tsinghua Üniversitesi'nden Dr. Yule Liu'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Texas A&M AgriLife Research ve USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü'nden JS'ye TEX0-1-9675 Hatch Projesi'nden bir başlangıç fonu tarafından desteklendi.

1. Patates Bitkileri Yetiştirin.
<ol><li>In vitro patates bitkilerini kültür tüplerinde (25 x 150 mm) Murashige ve Skoog (MS) medyası ve Gamborg vitamini (MS bazal tuz karışımı, Gamborg'un vitamini, 30 g/L sakkaroz, 3,5 g/L agar, pH = 5,7) ile yay. Tüpleri büyüme odasına 20-22 °C, 16 saat ışık/8 saat koyu fotoperiyod ve ışık yoğunluğu 120 μmol/m2⭐s1'in altına yerleştirin. NOT: Yeni sürgünler ve kökler normalde bitkilerden 1-2 hafta içinde gelişir. Bitkileri her ay taze MS/Gamborg vitamin ortamı ile yayın.</li>
	<li>Dört hafta sonra, in vitro bitkileri toprağa nakledin ve 20-22 ° C, 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyod ve ışık yoğunluğu 120 μmol / m2 ⭐ s1 altındaki bir serada yetiştirin. NOT: Yeni geliştirilen kökleri ve yaprakları olan bitkiler ekim için uygundur. Yeni nakledilen bitkiler için nemi ilk 3-4 gün koruyun.</li>
</ol>2. VbMS vektörlerini oluşturun.
<ol><li>Kısa tandem TM moleküllerini tasarlayın ve klonla (STTM, Şekil 1)22,53 ilgi miRNA için. NOT: Deneysel verilere dayalı olarak veya miRbase veritabanından miRNA dizileri alın54,55,56,57,58,59. Bu çalışmada kullanılan miR166 dizisi daha önce 60 olarak tanımlanmıştır.<ol>
<li>MiRNA'nın 10-11. nükleotitlerine karşılık gelen sahadaki miRNA'nın ters tamamlayıcı dizisine normalde 5'-CTA-3' uyumsuzluk dizisi ekleyerek TM modülini tasarlayın. NOT: Örneğin, Stu-miR160 dizisi 5'-UGCCUGGCUCCGUAUGCC-3'61'dir ve burada 10-11. Ters kompleman sırası (deoksinükleotidlerde) 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' ve uyumsuz şişkinlik ekleme bölgesi kalın olarak gösterilir. TM molekül dizisi (deoksinükleotid) 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' olmalıdır.</li>
		<li>STTM parçasını klonlamak için astarlar tasarlayın (Şekil 1). PCR klonlama için şablon olarak 48 nt aralayıcı dizisine sahip DNA oligonükleotidlerini kullanın. İleri astar, bir LIC1 bağlayıcıdan (5'-CgACgACAAGACCgT-3'), yukarıdakilerin TM molekülü için tasarlanan ileri dizilimini ve 48 nt aralayıcının kısmi 5' dizisini (5'-GTTGTTTTGTTATGGT-3') oluşur. Ters astar, bir LIC2 bağlayıcıdan (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), TM molekülünün ters tamamlayıcı dizisinden ve 48 nt aralayıcının (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3') 3' dizisine kısmi bir ters tamamlayıcıdan oluşur. NOT: 48 nt aralayıcı sırası 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATGGTCTAAGAAGAAT-3'dür. Örneğin, STTM-miR160 için ileri astar 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3' olmalıdır; ters astar 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' olmalıdır (Şekil 1).</li>
		<li>Şablon olarak sentezlenmiş evrensel 48 nt aralayıcıyı ve yüksek doğrulukta bir DNA polimerazını kullanarak PCR tarafından 50 μL hacimde STTM parçasını güçlendirin.<ol>
<li>Her astarın 0,5 μL'si (40 μM), 0,5 μL'si 48 nt ara oligo (40 μM), 5 μL'si 10x PCR tamponu karıştırarak PCR reaksiyonunun ayarını ayarlayın, 1 μL dNTP karışımı (her biri 10 mM), 0,1 μL yüksek kaliteli DNA polimeraz (10 U/μL) ve 43 μL ddH2O toplam 50 μL hacme aşağıdaki gibi standart PCR amplifikasyonu gerçekleştirin: 3 dakika için 94 °C, 45 s için 94 °C 32 döngü, 45 s için 60 °C ve 60 s için 72 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>STTM parçasını etanol çökeltme ile arındırın. PCR ürünlerine 2,5 hacim etanol ve 1/10 hacimli 3 M sodyum asetat (pH = 4,0) ekleyin. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da kuvvetlice karıştırın ve santrifüj. Süpernatant çıkarın ve peletin% 70 etanol 1 mL ile durulayın. Peletin kurut ve 20 μL ddH2O'da çözün. NOT: STTM PCR ürünlerinin amplifikasyonlarını kontrol etmek için DNA elektroforezi kullanın.</li>
		<li>2,5 μL saflaştırılmış STTM PCR ürünü, 0,5 μL 10x T4 DNA polimeraz tamponu, 0,05 μL 1 M ditiyothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP karıştırarak buz üzerinde T4 DNA polimeraz reaksiyonu ayarlayın, 0,1 μL T4 DNA polimeraz (3 U/μL) ve 1,6 μL ddH2O toplam 5 μL hacme, karışımı 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır, ve T4 DNA polimerazını devre dışı bırakmak için ürünleri 75 °C'de 20 dakika boyunca tedavi edin.</li>
	</ol></li>
	<li>PVX tabanlı VbMS yapısını hazırlayın.<ol>
<li>100 μL hacimde 2,5 μL SmaI (20 U/μL) ile 5 μg PVX-LIC plazmid38 sindirin.</li>
		<li>Sindirilen PVX-LIC ürünlerine eşit miktarda fenol:kloroform:izopropanol (25:24:1, pH = 6.7/8.0) ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Eşit miktarda kloroform ekleyin:izopropanol (24:1) ve girdap kuvvetlice. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj. NOT: PVX-LIC vektörü klonlama için LIC kasetini barındırır. PVX-LIC vektörün LIC kaseti bir ccdB geni ve kloramfenikol dirençli bir gen içerir ve kanamycin (50 μg/L) ve kloramfenikol (15 μg/L) içeren LB ortamı kullanılarak E. coli strain DB3.1'de tutulması/yayılması gerekir.</li>
		<li>Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 2,5 cilt etanol ve 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (pH = 4,0) ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın.</li>
		<li>Peletin% 70 etanol ve girdaptan 1 mL ile kuvvetlice durulayın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Peleti kurutun ve sindirilen PVX-LIC plazmidini 100 μL ddH2O ile çözün.</li>
		<li>Sindirilmiş PVX-LIC vektör DNA'sının 2,5 μL'si, 10x T4 DNA polimeraz tamponunun 0,5 μL'si karıştırılarak buz üzerinde T4 DNA polimeraz reaksiyonunun kurulması, 1 M DTT'nin 0,05 μL'si, 100 mM dTTP'nin 0,25 μL'si ve toplam 5 μL hacimde 0,1 μL T4 DNA polimerazı (3 U/μL) karışımı 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ürünleri 20 dakika boyunca 75 °C'de tedavi edin T4 DNA polimerazını etkisiz hale getir.</li>
	</ol></li>
	<li>STTM dizisini LIC reaksiyon kullanarak PVX-LIC vektörüne klonlayın. T4 DNA polimerazla işlenmiş STTM PCR ürünlerini (5 μL) ve T4 DNA polimerazla işlenmiş PVX-LIC plazmidlerini (5 μL) karıştırın. 70 °C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın, 0,1 °C/s rampada 22 °C'ye kadar soğutun ve PCR makinesi kullanarak 30 dakika boyunca 22 °C'de tutun. NOT: LIC klonlamanın daha yüksek verimliliğini elde etmek için kuluçka süresini 4 °C'de geceleme süresine kadar uzatın.</li>
	<li>LIC reaksiyon ürünlerinin 5 μL'sini E. coli DH5α'ya dönüştürün ve 50 μg/mL kanamycin62,63 içeren bir LB plakasında büyüyün. PVX-LIC vektörü için klonlama astarları ve evrensel astar ve ardından sıralama ile PCR ile pozitif kolonileri seçin ve doğrulayın.<ol>
<li>Pozitif klonları tanımlamak için STTM klonlama için ters astar ile birlikte PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') için ileri astar ile koloni PCR gerçekleştirin. PCR bandının boyutu ~300 bp olmalıdır. NOT: Sonlandırıcı döngüsü sırasıyla STTM parçalarının dizilerini doğrulayın64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>PVX-STTM plazmidlerini doğrulanmış klonlardan ayırın ve bunları GV3101, GV2260 veya EHA10562,63 Agrobacterium suşlarına dönüştürün. Agrobacterium kolonilerini PCR ile doğrulayın. NOT: PVX-LIC için ileri astarı ve STTM klonlama için ters astarı kullanarak Agrobacterium kolonilerini PCR ile onaylayın.</li>
</ol>3. Patates bitkilerinde PVX tabanlı VbMS tahlilleri gerçekleştirin.
<ol><li>4 haftalık tüp patates bitkilerini toprağa nakletin. Nakledilen bitkiler 3-4 gün sonra VbMS testine tabi tutulacaktır.</li>
	<li>Patates bitkilerini PVX-STTM plazmidlerini içeren Agrobacterium ile aşılayın. NOT: Patateste VbMS tahlili için Agrobakteri aracılı infiltrasyon ve kürdan tırmalama inoktülasyonu aynı anda gerçekleştirilir.<ol>
<li>PVX-STTM vektörleri içeren pozitif transformantları 50 μg/mL kanamycin ve 50 μg/mL rifampicin içeren 50 mL sıvı LB'ye alın ve aşılayın. OD600 = 1.0'a kadar 16 saat boyunca 220 rpm'de 28 °C inkübatörde büyüyün.</li>
		<li>Aynı zamanda, pozitif Agrobacterium kolonilerini 50 μg/ mL kanamycin ve 50 μg / mL rifampicin içeren en az iki yeni LB plakasına serin ve 1 gün boyunca 28 ° C'de büyüyün. Kontrol olarak PVX-LIC38,66 vektörünü ve virüs yayılmasını izlemek için PVX-GFP67,68'i dahil edin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.400 x g'da santrifüjleme ile Agrobacterium sıvı kültürünü toplayın. Agrobacterium hücrelerini eşit hacimli sızma tamponu (10 mM MgCl2, 10 mM MES ve 200 μM asetosyringone, pH = 5,6) ile yeniden biriktirin ve OD600 = 1,0'a ayarlayın. Oda sıcaklığında 6 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Agrobacterium kültürünü 1 mL iğnesiz şırınga ile tamamen genişletilmiş yaprakların abaksiyel tarafına sızın.<ol>
<li>Bir yaprağı tek elinizle çevirin ve tutun, ardından bir parmağınızı sızıntı yerindeki adaxial taraftan yaprak laminasını desteklemek için kullanın. Şırınnayı diğer elinizle yaprak yüzeyine dikey tutun ve Agrobacterium kültürünü lamina'nın abaksiyel tarafına sızın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Agrobacterium kültürünü LB plakalarından kazıyın ve sızan patates bitkilerinin ilk bir veya iki internotunun gövde yüzeyini kürdanla çizin. Sapın epidermisini hafifçe çizin. Bitkilere ciddi zararlar verebilecek gövdeden delinmekten kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>22 °C'de 22 °C'de 16 saat açık/8 saat koyu fotoperiyod ve bir serada 120 μmol/m2φ s1 ışık yoğunluğu ile bitkileri yetiştirin. NOT: MiRNA susturma nedeniyle fenotipler genellikle postinokokasyon sonrası 2-4 hafta içinde ortaya çıkar (Şekil 2, Şekil 3). VbMS fenotipinin sızmadan sonra görünmesi genellikle 10-20 gün sürer. VbMS fenotipi, spesifik miRNA ve hedef genlerin özelliklerine, büyüme koşullarına ve patates çeşitlerine bağlıdır.</li>
</ol>4. İfade analizi yapın.
<ol><li>Fenotipler 2-4 haftalık postinokokasyonda ortaya çıktığında, vbMS bitkilerinden fenotipli sürgünler, yapraklar, çiçekler veya kökler gibi dokuları ve kontrol tesislerinden gelen dokuları makasla toplayın. Toplanan dokulardan toplam RNA'ları izole edin.</li>
	<li>RNA kalitesini elektroforez62,63 ile kontrol edin ve OD260 absorbansını spektrofotometre ile ölçerek RNA konsantrasyonunu ölçün.</li>
	<li>MiRNA ifadesini analiz etmek için stem-loop gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) kullanın.<ol>
<li>Belirli miRNA'lar için bir kök döngü ters transkripsiyon astarı tasarlayin. Stem-loop RT primer'lar evrensel 5' omurga ve belirli bir miRNA'nın 3' 6 nt uzantısını içerir. Bir kök döngü yapısı oluşturan 5' evrensel omurga (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') tasarlayın. (Büyük harf ters tekrarlanan bir sıraya ve döngü bölgesine küçük harfe karşılık gelir).</li>
		<li>Bir döngü oluşturan 5' omurga dizisinin bir kısmı, sonraki PCR amplifikasyonu için ters astar görevi görür (omurga dizisinde kalın-italik sıra). Ters transkripsiyon için özgüllük sağlamak üzere kök döngü astarı için ilgi miRNA'nın 3' ucuna ters tamamlayıcı olan 6 nt'lik bir uzantı dizisi ekleyin (Ek Şekil 1A). NOT: Chen ve ark.69 ve Erika Varkonyi-Gasic ve ark.70,71,72 tarafından tanımlandığı gibi kök-döngü ters transkripsiyon astarını tasarlayın. Örneğin, Stu-miR160 için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-GTCTCCTCTGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGGACGGCATA-3' olarak tasarlanmıştır. Patates miR165/166 ailesi için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-GTCTCCTCTGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGG(A/G)A-3' olarak tasarlanmıştır. (Kalın büyük harf dizileri, belirli miRNA'lar için ters transkripsiyonun özgüllüğünü sağlar).</li>
		<li>Toplam RNA'nın 50-200 ng'si, kök döngü ters transkripsiyon astarının 1 μL'si (100 μM), 2 μL 10x tamponu karıştırarak ters transkripsiyon reaksiyonunu ayarlayın, Buz üzerinde 0,2 μL RNaz inhibitörü (40 U/μL), 0,25 μL dNTP (her biri 10 mM) ve 1 μL ters transkriptaz (200 U/μL). Toplam 20 μL hacme çekirdeksiz ddH2O ekleyin.</li>
		<li>Darbeli ters transkripsiyon prosedürünü kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin. Ters transkripsiyon reaksiyon karışımını 30 dakika boyunca 16 °C'de kuluçkalayın, 30 s için 30 °C, 30 s için 42 °C ve 1 s için 50 °C sıcaklık döngüsünü toplam 60 döngü boyunca gerçekleştirin ve ters transkriptazı 5 dakika boyunca 85 °C'de inkübasyonla etkisiz hale koyun.</li>
		<li>MiRNA ifadesinin gerçek zamanlı PCR analizi için, ileri astarı miRNA dizisine göre tasarlayın, ancak yukarıda tasarlanan kök döngü ters transkripsiyon astarı ile çakışır dizileri içermez. Uzunluğu, erime sıcaklığını ve GC içeriğini optimize etmek için ileri astarın 5' kısmına 3–7 nt uzantı ekleyin (Ek Şekil 1). NOT: Evrensel ters astar 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'' dür. Örneğin, Stu-miR160 için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3' olarak tasarlanmıştır. MiR165/166 ailesi için kök-döngü ters transkripsiyon astarı 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3''dür. Kalın diziler, astar optimizasyonu için 5' uzantı görevi eder. MiRNA için kök döngü ters transkripsiyon astarları ve gerçek zamanlı PCR astarları miRNA Primer Tasarım Aracı73 kullanılarak tasarlanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Hedef mRNA'ların cDNA'larını standart ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) ile sentezleyin. Ters transkripsiyon reaksiyon karışımını 37 °C'de 60 dakika kuluçkaya yatırın ve 5 dakika boyunca 85 °C'ye ısıtarak ters transkriptazı devre dışı bırakın. NOT: (1) Hedef mRNA'lar bilinmiyorsa psRNATarget programı74 kullanarak hedef mRNA'ları tahmin edin. (2) mRNA için evrensel ters transkripsiyon astarı, 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3' bağlantılı bir astardır.</li>
	<li>Hem ilgi çekici miRNA hem de hedef mRNA'lar için gerçek zamanlı PCR reaksiyonlarını ayarlayın. Buz üzerinde toplam 5 μL hacimde 0,5 μL şablon cDNA, 5 μL 2x gerçek zamanlı PCR tamponu SYBR yeşili, her ileri ve ters astarın 0,05 μL'si (40 μM) ve 4,4 μL ddH2O'yu karıştırın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 95 °C'de kuluçkaya yaslanın, 3 s için 95 °C'lik 40 döngü ve 30 sn için 60 °C. Sonraki erime eğrisi analizini aşağıdaki gibi yapın: 15 s için 95 °C'de kuluçkalayın, 20 °C/s'lik bir rampada 60 °C'ye kadar soğutun, 60 s için 60 °C'de tutun, 0,2 °C/s'lik bir rampada 95 °C'ye ısıtın ve 15 s için 95 °C'de tutun. ΔΔCt yöntemlerini kullanarak Ct değerlerini analiz edin76,77 ve standart hatalarla araçları çizin. NOT: (1) Hedef mRNA'lar için gerçek zamanlı PCR astarları açıklandığı gibi tasarlanabilir75. (2) Patates poliubiquitin 10 geni patateste normalleşme için bir iç kontrol görevi görebilirsiniz. Patates poliubiquitin 10 geni için ileri astar 5'-ATGTTGCCTTTTTTGTGGTTG-3' ve ters astar 5'-TTATTTATTCACATAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Gerçek zamanlı PCR analizi için kontaminasyon ve astar-dimer oluşumu yanlış pozitif sonuçlar üretebilir. Spesifik olmayan amplifikasyonu izlemek ve gerçek zamanlı PCR analizinin sorumluluğunu artırmak için, şablonsuz kontrollerin dahil edilmesi ve gerçek zamanlı PCR tahlilleri için ters transkriptaz yapılması önerilir.</li>
</ol>

STTM tasarımını PVX vektörüne entegre ederek patatesteki endojen miRNA'ların işlevini karakterize etmek için PVX tabanlı bir miRNA susturma sistemi sunuyoruz. VbMS sisteminin, bitki türleri arasında yüksek oranda korunmuş bir miRNA ailesi olan patateste miRNA165/166'nın susturılmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır.
TM yaklaşımı, hedeflenen miRNA'nın elenmesi ve etkinliğinin tutuklanmasıyla sonuçlanan miRNA tamamlama sırasında beklenen bölünme bölgesinde uyumsuz bir döngü oluşturmak için tasarl...

Bitki mikroRNA'ları (miRNA'lar) 20-24 nükleotid uzunluğunda, nükleer kodlu düzenleyici RNA'lar1 olarak karakterize edilir ve büyüme ve gelişme2,3, fotosentez ve metabolizma4,5,6,7, hormon sentezi ve sinyalizasyon8,9, biyotik ve abiyotik yanıtlar dahil olmak üzere bitki biyolojik süreçlerinin hemen hemen her alanında temel roller oynar10, 11,12,13 ve besin ve enerji düzenlemesi14,15. Tesis miRNA'larının düzenleyici rolleri iyi programlanır ve genellikle transkripsiyon sonrası seviyelerde hedef mRNA'ları ayırarak veya çeviriyle bastırarak yerine getirilir.
Patateste miRNA'ların tanımlanması, transkripsiyonal profil oluşturma ve hedef tahminine doğru muazzam ilerleme kaydedildi16,17,18,19,20,21. Bununla birlikte, patates de dahil olmak üzere bitkilerdeki miRNA'ların fonksiyonel karakterizasyonu, verimli ve yüksek verimli genetik yaklaşımların olmaması nedeniyle diğer organizmaların gerisinde kaldı. Standart fonksiyon kaybı analizi ile bireysel miRNA'nın fonksiyonel analizini yapmak zordur, çünkü çoğu miRNA önemli genetik artıklığa sahip ailelere aittir22. Buna ek olarak, tek bir miRNA birden fazla hedef geni kontrol edebilir23 ve birkaç farklı miRNA aynı moleküler yolu işbirliği içinde modüle edebilir24,25. Bu özellikler, belirli bir miRNA veya miRNA ailesinin işlevini karakterize etmeyi zorlaştırır.
MiRNA'ların fonksiyonel analizinin çoğu, belirgin sınırlamaları olan işlev kazancı yaklaşımlarına büyük ölçüde güvenmektedir. Yapay miRNA (amiRNA) yöntemi, miRNA'ları yüksek düzeyde üretmek için endojen primer transkriptlerden (pri-miRNA' lar) yararlanır ve hedef gen ekspresyonunun inhibisyonunu önler26,27,28,29. Bununla birlikte, güçlü bir constitutive 35S promotörü kullanarak aktivasyon etiketleme ve miRNA aşırı ekspresyonu genellikle in vivo koşulları temsil etmeyen ve bu nedenle miRNAs30'un endojen işlevini yansıtmayabilecek miRNA'ların yüksek ekspresyonuna yol açar. Bağlama ve/veya bölünme bölgelerinde temizlenemez mutasyonlar içeren hedef genlerin miRNA'ya dirençli formlarının ekspresyonini içeren alternatif bir yaklaşım geliştirilmiştir31,32,33. Ancak bu yaklaşım, transgenik eserler nedeniyle miRNA dirençli hedef transgeneden türetilen fenotipin yanlış yorumlanmasına da neden olabilir. Bu nedenle, bu fonksiyon kazanım çalışmalarından sonuçlar dikkatle çıkarılmalıdır34. Yukarıda açıklanan yaklaşımların bir diğer önemli sınırlaması, emek yoğun ve zaman alıcı olan dönüşümü gerektirmeleridir. Ayrıca, transgene bağımlı yaklaşımlar dönüşüm-recalcitrant bitki türleri için neredeyse geçerli değil. Bu nedenle, miRNA'ların işlevini çözmek için hızlı ve verimli bir işlev kaybı yaklaşımı geliştirmek önemlidir.
Dönüştürme prosedürünün ön koşulunı atlamak için, hedef mimik (TM) stratejilerini virüs türevli vektörlerle birleştirerek virüs tabanlı mikroRNA susturma (VbMS) oluşturulmuştur. VbMS sisteminde, yapay olarak tasarlanmış TM molekülleri geçici olarak bir virüs omurgasından ifade edilir ve bitki endojen miRNA'ların işlevini parçalamak için güçlü, yüksek verim ve zaman kazandıran bir araç sunar35,36. VbMS başlangıçta tütün çıngırak virüsü (TRV)35,36,37 ile N. benthamiana ve domates geliştirilmiştir ve Arabidopsis genişletilmiştir, pamuk, buğday ve mısır, patates virüsü X (PVX)38, pamuk yaprağı buruşuk virüs (ClCrV)39, salatalık mozaik virüsü (CMV)40,41,42, Çin buğday mozaik virüsü (CWMV)43 dahil olmak üzere diğer çeşitli virüs ifade sistemlerini kullanarak ve arpa şerit mozaik virüs (BSMV)44,45.
Patates (Solanum tuberosum), yüksek besin değeri, yüksek enerji üretimi ve nispeten düşük girdi gereksinimleri nedeniyle dünyanın en önemli dördüncü gıda ürünü ve en yaygın olarak yetiştirilen noncereal mahsulüdür46. Patatesin çeşitli özellikleri onu çekici bir dikotilendonöz model bitki yapar. Yüksek outcrossing oranı, heterozygozite ve genetik çeşitliliğe sahip bitkisel olarak yayılan bir poliploid mahsulüdür. Bununla birlikte, bugüne kadar, VbMS kullanarak patatesteki miRNA'ların işlevini karakterize eden bir rapor yoktur. Burada, patates bitkilerinde miRNA'ların işlevini değerlendirmek için ligasyondan bağımsız klonlama (LIC) uyarlanmış patates PVX tabanlı VbMS yaklaşımını sunuyoruz38. MiR165/166 ailesini VbMS testini göstermek için seçtik, çünkü miR165/166 ailesi ve hedef mRNA'ları ve Sınıf III homeodomain/Leu fermuarı (HD-ZIP III) transkripsiyon faktörleri 22.47.48 olarak kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. HD-ZIP III genleri meristem gelişimin ve organ polaritesinin temel düzenleyicileridir ve miR165/166 işlevinin bastırılması HD-ZIP III genlerinin ekspresyonunun artmasına neden olarak, apikal hakimiyetin azalması ve yaprak polaritesinin anormal örüntüleri gibi pleotropik gelişimsel kusurlara neden oluyor22,35,38,41 . MiRNA165/166'nın susturuğu ile ilişkili kolayca dekore edilebilir gelişimsel fenotipler, PVX tabanlı VbMS testinin etkinliğinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Bu çalışmada, PVX tabanlı VbMS sisteminin patatesteki miRNA'ların işlevini etkili bir şekilde engelleyebileceğini gösteriyoruz. PVX tabanlı virüs kaynaklı gen susturma (VIGS) sistemi bir dizi patates çeşidinde kurulduğundan49,50,51,52, bu PVX tabanlı VbMS yaklaşımı büyük olasılıkla çok çeşitli diploid ve tetraploid patates türlerine uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>100 ve mikro; M dATP ve 100 &mikro; M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, ABD</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodyum asetat, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, ABD</td><td></td><td></td></tr>#S0297 <tr><td>Asetosiringon</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, ABD</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens suşları: GV3101, GV2260 veya EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>VWR Kurumsal, Radnor, PA 19087-8660, ABD</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit, DMSO</td><td>TCI Amerika, Portland, VEYA 97203, ABD</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Kurumsal, Radnor, PA 19087-8660, ABD</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td>, <td>ccdB genini içeren PVX-LIC ve pTRV2e'nin bakımı için</td></tr><tr><td>E. coli DH5 ve alfa;</td><td></td><td></td><td>LIC klonlama Gübre tarafından oluşturulan hedef yapılar için</td></tr><tr><td>: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Karanlık Hava Yemi</td><td>ICL Özel Gübreler, Summerville, SC 29483, ABD</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek kaliteli PCR reaktifleri: dNTP'li KAPA HiFi DNA Polimeraz</td><td>Roche Dizileme ve Yaşam Bilimleri, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, ABD</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>İzoamil alkol</td><td>VWR Kurumsal, Radnor, PA 19087-8660, ABD</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Saf Etanol & ndash 200 Kanıt</td><td>Decon Labs, Prusya Kralı, PA 19406, ABD</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES TCI</td><td>Amerika, Portland, VEYA 97203, ABD</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, ABD</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Ters Transkriptaz</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 ABD</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Nano damla spektrometresi: NanoDrop OneC Wi-Fi özellikli Mikro Hacimli UV-Vis Spektrofotometresi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, ABD</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR makinesi: Bio-Rad MyCycler PCR Sistemi</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, ABD</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>PCR makinesi: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, ABD</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, ABD</td><td>Masaüstü pH / mV Metre - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1), pH 6.7 / 8.0.</td><td>VWR Kurumsal, Radnor, PA 19087-8660, ABD</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, ABD</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS vektörü: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao ve diğerleri, 2016</td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı PCR makinesi: QuantStudio 6 Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, ABD</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı PCR reaktifi: KAPA SYBR&reg; HIZLI qPCR Master Mix (2x) Kiti</td><td>Roche Dizileme ve Yaşam Bilimleri, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, ABD</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Kısıtlama enzimi: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 ABD</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Ters transkripsiyon reaktifleri: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, ABD</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyon Kiti: E.Z.N.A. Bitki RNA'sı Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, ABD</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 ABD</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, ABD</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Toprak: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Bahçe Bitkileri, Agawam, MA 01001-2907, ABD</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimeraz ve tampon</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 ABD</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

patates virüsü x bazlı mikrorna susturma (vbms) patateste.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Virüs bazlı mikroRNA susturma (VbMS), bitkilerdeki mikroRNA'ların (miRNA'lar) fonksiyonel karakterizasyonu için hızlı ve verimli bir araçtır. VbMS sistemi Nicotiana benthamiana, domates, Arabidopsis, pamuk ve buğday ve mısır gibi monokot bitkileri de dahil olmak üzere çeşitli bitki türleri için geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Burada, patatesteki endojen miRNA'ları susturmak için PVX tabanlı VbMS vektörlerini kullanarak ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Belirli bir miRNA'nın ifadesini yıkmak için, ilgi çekici miRNA'nın hedef mimik (TM) molekülleri tasarlanmış, bitki virüs vektörlerine entegre edilmiş ve patateste Agrobacterium infiltration ile doğrudan ilgi çekici sonojen miRNA'ya bağlanmak ve işlevini engellemek için ifade edilir.

Şekil 2 , PVX-STTM165/166 patates bitkilerini (Katahdin) damarlar boyunca yaprak laminanın abaksiyel tarafından yaprak dokularının ektopik büyümesi ile göstermektedir. Trompet şeklinde yaprak oluşumu gibi daha şiddetli fenotipler de gözlenmiştir. Buna karşılık PVX kontrol tesislerinde fenotipik anormallik gözlenmedi. Bu sonuçlar, VbMS sisteminin tetraploid patates bitkilerinde endojen miRNA fonksiyonunu bastırmada etkili olduğunu ve PVX-VbMS sisteminin spesifik miRNA'ların veya miRNA aileler...

Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

Bitkilerdeki mikroRNA'ların işlevini analiz etmeye yönelik geleneksel yaklaşım, öncelikle kararlı knockdown tesislerinin üretilmesine dayanır. Bu virüs tabanlı mikroRNA susturma sistemi, sıkıcı ve zaman alıcı bir dönüşüm gerektirmez. Virüs bazlı mikroRNA susturma, çok çeşitli diploid ve tetraploid patates türlerine uygulanabilen bitkilerdeki mikroRNA'ların fonksiyonel karakterizasyonu için hızlı ve verimli bir araçtır.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırma görevlisi olan Jinping Zhao olacak. Hedef taklit modülünü tasarlamak için, mikroRNA'nın 10. ila 11. nükleotidlerine karşılık gelen bölgedeki ilgilenilen mikroRNA'nın ters tamamlayıcı dizisine bir uyumsuzluk dizisi ekleyin. Kısa tandem hedef taklit fragmanını amplifiye etmek için, ilgilenilen her primer, bir 48 nükleotid boşluk oligosu, 10 kat PCR tamponu, bir dNTP karışımı, yüksek kaliteli PCR DNA polimeraz ve 50 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar çift damıtılmış su ile bir PCR reaksiyonu ayarlayın.Ardından, belirtildiği gibi parametreleri kullanarak mikroRNA'yı standart PCR ile amplifiye edin. Kısa tandem hedef taklitlerini saflaştırmak için, PCR ürününe 2.5 hacim etanol ve 1/10 hacim üç molar sodyum asetat ekleyin. Reaksiyonu 10 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjlemeden önce kuvvetlice karıştırın.Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti bir mililitre %70 etanol ile durulayın ve peletin kurumasını bekleyin, ardından peleti 20 mikrolitre çift damıtılmış suda çözün. Bir T4 DNA polimeraz reaksiyonu oluşturmak için, saflaştırılmış kısa tandem hedef taklit PCR ürününü 10 kez T4 DNA polimeraz tamponu, bir molar ditiyotreitol, 100 milimolar dATP, T4 DNA polimeraz ve çift damıtılmış su ile buz üzerinde beş mikrolitrelik bir nihai hacme kadar karıştırın. Daha sonra karışımı 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin, ardından T4 DNA polimerazı inaktive etmek için 75 santigrat derecede 20 dakikalık bir inkübasyon yapın.PVX tabanlı VBMS yapısını hazırlamak için, toplam 100 mikrolitre hacimde 2,5 mikrolitre SMA1 ile beş mikrogram PVX ligasyonundan bağımsız klonlama plazmitlerini sindirin. Kloroforma izoamil alkole eşit hacimde fenol ekleyin, sindirilmiş PVX ligasyonundan bağımsız klonlama ürünlerine kuvvetli karıştırma ile 25 ila 24 ila bir oran ekleyin ve ürünü santrifüjleme ile toplayın. Tüp içeriğini ikinci bir santrifüjlemeye tabi tutmadan önce, girdaplama ile süpernatana 24'e bir oranında izoamil alkole eşit hacimde kloroform ekleyin.Döndürmenin sonunda, süpernatanı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve kuvvetli bir karıştırma ile 2.5 hacim etanol ve 1/10 hacim üç molar sodyum asetat ekleyin. Tüpü santrifüjleyin ve peleti bir mililitre% 70 etanol ve kuvvetli girdap ile durulayın. Tüpü tekrar santrifüjleyin ve peletin kurumasını sağlamak için süpernatanı çıkarın.Daha sonra sindirilmiş PVX ligasyonundan bağımsız klonlama plazmid peletini 100 mikrolitre çift damıtılmış suda çözün. T4 DNA polimeraz reaksiyonunu kurmak için, sindirilmiş PVX ligasyonundan bağımsız klonlama vektör DNA'sını 10 kez T4 DNA polimeraz tamponu, bir molar ditiyotreitol, 100 milimolar dTTP ve T4 DNA polimeraz ile buz üzerinde beş mikrolitrelik bir nihai hacme karıştırın. Daha sonra karışımı 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin, ardından T4 DNA polimerazı inaktive etmek için 75 santigrat derecede 20 dakikalık bir inkübasyon yapın.Kısa tandem hedef taklit dizisini PVX ligasyonundan bağımsız klonlama vektörüne klonlamak için, T4 DNA polimeraz ile muamele edilmiş kısa tandem hedef taklit PCR ürününün beş mikrolitresini T4 DNA polimeraz ile muamele edilmiş PVX ligasyonundan bağımsız klonlama plazmidi ile karıştırın ve karışımı 70 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, tüp içeriğini bir PCR makinesinde saniyede 0,1 santigrat derece hızında 22 santigrat dereceye soğutun ve hedef sıcaklığa ulaşıldığında tüpü 30 dakika boyunca termosiklerde bırakın. İnkübasyonun sonunda, standart dönüşüm protokollerini kullanarak beş mikrolitre ligasyondan bağımsız klonlama reaksiyonu ürününü E.coli DH5 alfa'ya dönüştürün ve dönüştürülmüş bakterileri mililitre kanamisin başına 50 mikrogram içeren bir LB plakası üzerinde büyütün.Sonlandırıcı döngü dizilimi ile kısa tandem hedef taklit fragmanlarının dizilerini doğruladıktan sonra, PVX VBMS plazmitlerini doğrulanmış klonlardan izole edin ve bunları uygun Agrobacterium suşlarına dönüştürün. Dört haftalık in vitro patates bitkilerini PVX VBMS plazmidleri içeren Agrobacterium ile aşılamak için, PVX VBMS vektörlerini içeren pozitif transformatörleri seçin ve dönüştürücüleri mililitre başına 50 mikrogram kanamisin ve mililitre başına 50 mikrogram rifampisin içeren 50 mililitre sıvı LB içinde 16 saat boyunca 28 santigrat derecede ve dakikada 220 devir. Kuluçka sırasında, pozitif Agrobacterium kolonilerini kanamisin ve rifampisin içeren en az iki yeni LB plakasına sürün ve kültürleri bir gün boyunca 28 santigrat derecede büyütün.600 nanometredeki optik yoğunluk 1.0'a ulaştığında, Agrobacterium sıvı kültürünü santrifüjleme ile toplayın ve 600 nanometredeki optik yoğunluğu 1.0'a ayarlamak için peleti yeterli hacimde bir sızma tamponunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında altı saatlik bir inkübasyondan sonra, bir mililitre iğnesiz şırıngayı Agrobacterium süspansiyonu ile yükleyin ve bir patates bitkisinden genişletilmiş bir yaprağı çevirmek ve tutmak için bir elinizi kullanın. Bir parmağınızı kullanarak, istenen sızma bölgesinde yaprak laminasını adaksiyal taraftan destekleyin.Ve şırıngayı diğer elinizle yaprak yüzeyine dikey tutarak, 100 ila 200 mikrolitre Agrobacterium kültürünü laminanın abaksiyal tarafına sızdırın. Daha sonra, Agrobacterium kültür plakalarından kolonileri toplamak için bir kürdan kullanın ve sızan patates bitkilerinin ilk bir veya iki internodunun ve sapın epidermisinin gövde yüzeyini çizin, ardından sızan bitkileri serada iki ila dört hafta boyunca büyütün. Fenotipler ortaya çıktığında, VBMS'den fenotipli örnekleri toplamak ve bitkileri kontrol etmek için makas kullanın.Toplanan dokulardan toplam RNA'yı izole edin ve her numunede mikroRNA'yı ve hedef mRNA ekspresyonunu analiz etmek için ters transkriptaz PCR kullanın. Bu görüntülerde, 165/166 patates bitkilerini taklit eden PVX kısa tandem hedef, yaprak laminasının abaksiyal tarafından damarlar boyunca yaprak dokularının ektopik büyümesi ile gözlenebilmektedir. Trompet şeklindeki yaprak oluşumu gibi daha şiddetli fenotipler de gözlenmiştir.Buna karşılık, PVX kontrol tesislerinde fenotipik anormallikler gözlenmez, bu da VBSM sisteminin tetraploid patates bitkilerinde endojen mikroRNA fonksiyonunu baskılamada etkili olduğunu gösterir. PVX kısa tandem hedef taklidi 165/166 patates bitkileri, yaprak laminasının abaksiyal tarafından lamina damarları boyunca ektopik yapraktan dokuya büyüme sergiler ve bu da PVX VBMS sisteminin başlıca patates çeşitleri de dahil olmak üzere diğer patates çeşitlerine uygulanabileceğini gösterir. Yaprakların aynı anda sızması ve aynı bitkinin sapının aynı Agrobacterium kültürü ile aşılanması esastır.Hedef taklit moleküllerinin patates bitkilerine kararlı bir şekilde sokulmasına yönelik transgenik yaklaşımlar, hedeflenen mikroRNA'ların susturma durumunun yavru nesillerde korunması gerektiğinde önerilir.

potato-virus-x-based-microrna-silencing-vbms-in-potato

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Knock-down gen ekspresyonu için bir virüs kaynaklı gen susturulması (VIGS) yöntemi...

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Sistein artıkları tiyol grubunun çözücü yönelik analiz etmek için bir...

Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi<em&gt; Mısır rayado fino virüsü</emÜretilen&gt; Virüs gibi parçacıklar<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLP&#39;ler için Peptidlerin&gt; Bitkiler ve Çapraz bağlama

Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki genlerin geçici ektopik ekspresyonu için rutin fonksiyonel tahlillerdir. Bu yöntemler, efektoromik stratejilerde (hızlı direnç ve avirulence gen keşfi) etkili tahlillerdir ve moleküler bitki patolojisinde modern araştırmalar için çok önemlidir. Tesislerde sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılarlar.

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

Virüsün neden olduğu gen susturma, bitkilerin konakçı olmayan direncinde yer alan genleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Konakçı olmayan patojenlere duyarlı gen susturuculu bitkilerin tanımlanmasında GFPuv eksprese eden bakteriyel patojenlerin kullanımını gösteriyoruz. Bu yaklaşım kolay, hızlıdır ve büyük ölçekli taramayı kolaylaştırır ve diğer çeşitli bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için benzer bir protokol uygulanabilir.

Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim

Burada, spesifik mikroRNA'lara tamamlayıcı dizileri viral genoma dahil ederek picornavirüs tropizmini düzenlemek için bir yöntem açıklıyoruz.  Bu protokol, yaşam döngülerinin uzunluğuna ve doğasına bağlı olarak yapılan değişikliklerle tüm farklı virüs sınıflarına uyarlanabilir.

Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik

Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Burada, bitki patojenlerinde RNA susturucularını hızlı bir şekilde taramak için yaygın olarak kullanılabilecek değiştirilmiş bir tarama yöntemi salıyoruz.

Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması

Bu yöntem, toplam RNA ekstresinden miRNA'ları tespit etmek için kuzey hibridizasyon tekniğinin kullanımını göstermektedir.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

Tilki kuyruğu mozaik virüsünün ve şeker kamışı mozaik virüslerinin mısır fidelerine aşılanması için Agrobacterium bazlı enjeksiyon (agroinjection) protokolü sunulmaktadır. Bu şekilde aşılama viral enfeksiyona, belirteç genlerinin virüs kaynaklı gen susturmalarına ve GFP'nin viral aşırı ekspresyonuna yol açar.

Rekombinant Foxtail Mozaik Virüs ve Şeker Kamışı Mozaik Virüs Bulaşıcı Klonlar ile Enjeksiyon ile Mısır Fidelerinin Doğrudan Agroinokokülasyonu

Burada, hücre ölümü indüksiyonunu takiben aşılanmış yaprakları sürekli görüntüleyerek programlanmış hücre ölümü başlatma oranını incelemek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Mikroskop Kullanarak Hücre Ölümü Başlangıcının İncelenmesi

Öğrenin, patates virüsü X bazlı mikroRNA susturma yöntemiyle Solanum tuberosum'da endojen mikroRNA'ların hızlı fonksiyonel karakterizasyonunu. Bu sistem, stabil dönüşüm gerektirmeden etkili analiz sağlar.

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Daha fazla video keşfet