Name: In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Keşfedin, mikroakışkan sistemler kullanarak tam kan ve endotelyal hücre etkileşimlerini gerçek zamanlı inceleyin. Bu yöntem, trombojenite ve antikoagülan tedavilerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plazma Proteinleri Bölümü, Sanquin Araştırma ve Landsteiner Laboratuvarı, Amsterdam UMC, Akademik Tıp Merkezi, Amsterdam, Hollanda'dan Jan Voorberg'e bu el yazmasına yaptığı katkılardan dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma Hollanda KardiyoVasküler İttifakı (DCVA) [2012-08, 2014-11] tarafından Phaedra ve Reconnect konsorsiyumuna verilen desteğin yanı sıra Phaedra IMPACT konsorsiyumuna verilen Impulse hibe 2018 tarafından da desteklenmiştir. Bu hibeler arasında Hollanda Kalp Vakfı, Hollanda Üniversite Tıp Merkezleri Federasyonu, Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Örgütü ve Hollanda Kraliyet Bilimler Akademisi tarafından toplu finansman bulunmaktadır. Ayrıca, bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi tarafından Advanced Grant 'VESCEL' programı kapsamında finanse edilmiştir (Hibe numarası: 669768). XDM, Hollanda'nın Amsterdam'daki VU Üniversitesi Tıp Merkezi'nde KardiyoVasküler Araştırma Enstitüsü'nün (ICaR-VU) araştırma bursu ile finanse edilmektedir.

<ol><li>Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+control+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cardiovascular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell control of thrombosis.</a> BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130(2015).</li>
<li>Pearson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+function+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell function and thrombosis.</a> Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).</li>
<li>Bochenek, M. L., Schafer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Endothelial+Cells+in+Acute+and+Chronic+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hamostaseologie%22%5BJournal%5D)">Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis.</a> Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).</li>
<li>Swieringa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Control+of+Fibrin+Distribution+and+Microelasticity+in+Thrombus+Formation+Under+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).</li>
<li>Macfarlane, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Enzyme+Cascade+in+the+Blood+Clotting+Mechanism%2C+and+Its+Function+as+a+Biochemical+Amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier.</a> Nature. 202, 498-499 (1964).</li>
<li>Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fundamentals+in+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">New fundamentals in hemostasis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).</li>
<li>Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+platelets%2C+the+coagulation+and+fibrinolytic+systems+to+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing.</a> Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).</li>
<li>Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+cellular+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis.</a> Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).</li>
<li>Karino, T., Motomiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+through+a+venous+valve+and+its+implication+for+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation.</a> Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).</li>
<li>ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis%3A+a+major+contributor+to+global+disease+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Thrombosis: a major contributor to global disease burden.</a> Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).</li>
<li>Witkin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+pulmonary+embolism%3A+the+role+of+the+pulmonary+embolism+response+team%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team.</a> Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915(2019).</li>
<li>Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+biomarkers+in+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480(2019).</li>
<li>Giri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interventional+Therapies+for+Acute+Pulmonary+Embolism%3A+Current+Status+and+Principles+for+the+Development+of+Novel+Evidence%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).</li>
<li>Sharma, S., Lang, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+pathophysiology+of+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).</li>
<li>Eisenberg, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinopeptide+A+levels+indicative+of+pulmonary+vascular+thrombosis+in+patients+with+primary+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension.</a> Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).</li>
<li>Bochenek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+thrombosis+to+fibrosis+in+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).</li>
<li>Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+microfluidics+to+assess+the+platelet-based+control+of+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation.</a> Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).</li>
<li>Barendrecht, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+Imaging+of+Platelet+Degranulation+and+Secretion+Under+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55658(2017).</li>
<li>Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+Flow-based+Assays+to+Investigate+Leukocyte+Recruitment+on+Cultured+Vascular+Cells+and+Adherent+Platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57009(2018).</li>
<li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e55917(2017).</li>
<li>Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stasis+Promotes+Erythrocyte+Adhesion+to+von+Willebrand+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429(2012).</li>
<li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brothers+and+sisters%3A+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).</li>
<li>Szulcek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Microvascular+Shear+Adaptation+in+Pulmonary+Arterial+Hypertension.+Role+of+Platelet+Endothelial+Cell+Adhesion+Molecule-1+Cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).</li>
<li>Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+high+shear+rate+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Role of high shear rate in thrombosis.</a> Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+whole+blood+thrombosis+in+a+microfluidic+device+lined+by+fixed+human+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium.</a> Biomedical Microdevices. 18 (4), 73(2016).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+prolonged+increase+in+endothelial+permeability+induced+by+histamine+and+thrombin%3A+role+of+protein+kinases%2C+calcium%2C+and+RhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA.</a> Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).</li>
<li>Smits, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Outgrowth+and+Proliferation+of+Endothelial+Colony+Forming+Cells+are+Related+to+Markers+of+Disease+Severity+in+Patients+with+Pulmonary+Arterial+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763(2018).</li>
<li>Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+serial+hemodilution+with+hydroxyethyl+starch%2C+albumin%2C+and+0.9%25+saline+on+whole+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation.</a> Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Lung+Alveolus-on-a-chip+Model+of+Intravascular+Thrombosis+for+Assessment+of+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li>
<li>Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+peptides+enhance+single+cell+adhesion+and+viability+on+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir-ACS%22%5BJournal%5D)">Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays.</a> Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).</li>
<li>Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+size-dependent+cell+adhesion+on+nanostructured+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces.</a> Journal of Nanobiotechnology. 12, 54(2014).</li>
<li>McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weibel-Palade+bodies+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Weibel-Palade bodies at a glance.</a> Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).</li>
<li>Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mast+Cell%2C+Contact%2C+and+Coagulation+System+Connection+in+Anaphylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 846(2017).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li>
<li>Huveneers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+associates+with+endothelial+VE-cadherin+junctions+to+control+force-dependent+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling.</a> Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).</li>
<li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation%2C+barrier+function%2C+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).</li>
<li>Yamasaki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+arterial+stiffness+and+platelet+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Association between arterial stiffness and platelet activation.</a> Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).</li>
<li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).</li>
<li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3958(2012).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Pıhtılaşma endotel ve kan bileşenleri arasındaki karmaşık ve zamansal kontrollü etkileşimin bir sonucudur. Bu in vitro tsay gerçek zamanlı olarak endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerini araştırmak için bir yöntem sunar. Birincil insan endotel hücrelerinin çeşitli kullanılabilir, bir organ ve hastaya özgü bir şekilde situ tromboz kolaylaştırıcı. Bu çalışmada, sağlıklı donörlerden izole edilen PAEC'lerin trombojenik özelliklerini cteph hastalarına karşı karşılaştıran bu protokolün kullanımını gösterdik. Canlı trombüs oluşumu histamin aktive endotel üzerinde sağlıklı deneklerin tam kan perfüzyonu ile incelenmiştir, bir DOAC etkisi antitrombotik ajan olarak test edildi.
Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, ticari olarak kullanılabilen mikrokanalların kullanımının yanı sıra, özel yapım mikroakışkan kanalların piyasaya sürülmesi, vasküler geometri değişikliklerinin trombüs oluşumu üzerindeki etkisinin araştırılmasına olanak sağlamaktadır. Örneğin, bir dal noktasında akış azalır veya darlık kesme stresinde artışa ve daha fazla trombosit aktivasyonuna neden olur36. Ancak, bu özel yapılmış mikroakışkan kanalların önemli bir sınırlama adım 2.3.2 açıklandığı gibi EC'lerin istikrarlı bir monolayer oluşturmak için yüksek hücre numaraları gereksinimidir. Hasta kaynaklı hücreler az olduğunda bu sınırlayıcı bir faktör sunabilir. Ticari olarak kullanılabilen mikroslaytların güçlü yanları, yüzey alanlarının hücre kültürü için modifiye edilmiş olması ve büyüme alanlarının daha büyük olması ve böylece EC'lerin bir eşzamanlı ve kararlı monolayer oluşturmasına olanak sağlamasıdır. Öte yandan, daha büyük bir yüzey alanı daha büyük bir lümen neden olacaktır. Denklem 1'egöre, bu özel yapılmış mikroakışkanlar gibi benzer akış hızlarına ulaşmak için daha yüksek kan hacimleri gerektirir.
Bu protokolde yapılacak bir iyileştirme, canlı AT kaybını veya bariyer bütünlüğündeki değişiklikleri araştırmak olabilir. Bu protokoldeki EC hasarı sadece deneyin sonunda ölçülür. Canlı izleme için, ECs mCherry VE-cadherin ile etiketlenebilir, örneğin37. Ancak, bu verimli virüs transfeksiyonu ile son derece optimize edilmiş bir protokol gerekir gibi, Elektrik Hücre-substrat Empedans Algılama (ECIS) endotel bütünlüğü ve bariyer fonksiyonu çalışma alternatif olarak kullanılabilir38. Özel ECIS akış kanalları üzerinde perfüzyon akış altında endotel bariyer bütünlüğünün uzunlamasına izlenmesine olanak sağlar. Bu spesifik ECIS özellikleri endotel bariyer özelliklerinin paralel ölçümlerine ve trombüs oluşumuna olanak sağlar. Paralel EC bariyer ölçümleri için alternatif yollar, özellikle özel yapım dizilerde, AK bariyer özelliklerine bağlı olarak lümenden dışarı yayılan perfusatta floresan dekstrans kullanımı yer alır.
Açıklanan protokolün bir sınırlama, EC'ler insan vücudundan kaldırılır ve doku kültürü plastik kültürlü, sert, yapay substrat olmasıdır. Hücreler biyofiziksel ortamlarına uyum sağlarlar. Trombosit aktivasyonu ile duvar sertliği arasında bir ilişki olduğu için bu muhtemelen trombosit aktivasyonuna endotel yanıtını etkileyebilir39. Kültür plastiklerine yapılan bu adaptasyonlara rağmen hücreler, 5 dk kan perfüzyonundan sonra trombosit yapışması ve fibrin birikiminin farklı desenlerini uygulayan kontrol, CTEPH-PAEC ve HUVEC ile sağlıklı donörlerden elde edilen EC'lerle doğrudan karşılaştırıldığında tespit edilebilen hastalığa özgü özellikleri saklarlar.
Diğer protokollerin aksine, diğerleri trombosit ler ve lökositler19,,20,,21gibi tek bir kan bileşeni ile EC etkileşimi çalışma ise bu sistem tam kan kullanır. Yuvarlak damar geometrisi ve yumuşak hücre dışı matriks ile vasküler bir modelde endotel fonksiyonunun incelenmesine olanak sağlayan daha gelişmiş mikroakışkan modeller geliştirilmiştir. Ancak, bu HUVECs40,41,42ile optimize edilebiyir. Açıklanan protokolün yeniliği, in vivo durumlara bir adım daha yakın in situ tromboz modelleme getiren tam kan ile birlikte birincil ECs kullanımıdır. Hasta kaynaklı EC'lerin ve hasta kaynaklı kanın kullanımına yönelik protokolü optimize etmiş olması, kişiselleştirilmiş trombüs oluşumu ve ilaç tedavisinin değerlendirilmesini sağlayarak, hastalık modellemesini dahada optimize eder.
Açıklanan protokol, antikoagülasyon tedavilerinin hasta kaynaklı hücreler üzerindeki etkisini incelemek için uygulanabilir. Trombüs oluşumunu inhibe etmek için dabigatran kullanılırken, pıhtılaşma kaskadlarında faktör Xa'yı doğrudan inhibe eden rivaroxaban gibi diğer antikoagülanları kullanmak mümkündür. Klopidogrel veya aspirin gibi doğrudan trombosit inhibitörleri de incelenebilir, trombositlerin EC'lere bağlandığı hemostazın birincil fazında bu hareket ler gibi. Sonuç olarak, hastanın kendi kanı ile etkileşim de hastaya özgü EC'lerin trombojenik kapasiteleri bireysel hasta üzerinde antikoagülasyon tedavisinin kişisel etkisini tahmin etmek için kullanılabilir. Ayrıca, belirli proteinlerin bir nakavt ek fonksiyonel bilgi sağlayabilir.
Açıklanan protokolde başarılı bir perfüzyon denemesi için kritik olan bazı adımlar vardır. İlk olarak, birincil hücrelerin izolasyonu sırasında, son derece saf bir EC kültürü elde etmek gereklidir. İkinci olarak, EC'lerin kararlı bir eşzamanlı monolayer oluşturması önemlidir. Bu durumda, kesme stresinde hafif bir değişiklik endotel hasarına ve pıhtılaşma kaskad aktivasyonuna neden olabilir, ya da trombositler yanlış pozitif sonuçlar sağlayacak bodrum membran, bağlama başlayabilirsiniz. Üçüncü olarak, bu endotel zarar verebilir ve bu nedenle sonuçları etkileyebilir gibi, hava kabarcıkları önlemek için esastır.
Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile sitrated kan rekalsifikasyon sonra, hemen perfüzyon deneyi başlamak önemlidir. Rekalsifikasyon trombosit aktivasyonu ve trombüs oluşumunda hızlı bir tepkiye neden olur ve numunede hızlı pıhtılaşmaya neden olur.
Sonuç olarak, tromboz sırasında tam kan endotel hücre etkileşimlerini incelemek için çok yönlü bir protokol açıklıyoruz.

Endotel kan damarlarının iç hücresel tabakasını oluşturur ve kanı çevreleyen dokudan ayırır. Mikro ortamı aktif olarak düzenleyen ve dış uyaranlara yanıt veren dinamik bir organ olarak tanımlanmıştır1. Akan kan ile doğrudan temas nedeniyle, endotel hemostaz ve tromboz kontrolünde önemli ve trombosit agregasyonu kontrol büyük düzenleyici moleküllerin birçok birincil kaynağıdır, pıhtılaşma, ve fibrinolyz2. Sağlıklı, aktive olmayan endotel hücreleri (EC) trombosit aktivasyonuna karşı ve prostasiklin, trombomodülin veya doku faktörü yolu inhibitörü (TFPI)2,3gibi kan akışını korumak için pıhtılaşma ve trombüs oluşumunu önlemek çeşitli moleküller üretmek . Bu trombosit yapışmasını önler, trombosit agregasyonu, ve trombüs oluşumu. Yaralanma veya damar duvarının aktivasyonu lokalize trombosit adezyon ve pıhtı oluşumu nu başlatan prokoagülan endotelfenot ile sonuçlanır2,4. Endotel aktivasyon trombositleri, EC'lerden salınan çok meric protein von Willebrand Factor 'e (VWF) veya altta yatan subendothelial matrisin maruz kalan bağlanma bölgelerine bağlıdır. Daha sonra, trombositmoleküler değişiklikler ve doku faktörüne maruz kalma (TF) fibrin polimerizasyon5,6ile trombüs oluşumunu neden pıhtılaşma sisteminin aktivasyonunu başlatır. Birlikte, ortaya çıkan pıhtı yeniden endotelizasyon7ile yara kapanması için temel sağlar. Pıhtılaşma sisteminin pertürbasyonları, von Willebrand hastalığı, hemofili veya tromboz gibi genellikle endotel hemostatik yolun disregulated pro- ve antitrombotik dengesi nden kaynaklanan kanama bozukluklarına neden olabilir2,3.
Hemostaz süreci hem arteriyel hem de venöz dolaşımda görülür. Ancak arteriyel ve venöz trombozun altında yatan mekanizmalar temelde farklıdır. Arteriyel tromboz, iskemik kalp hastalığında görüldüğü gibi, çoğunlukla yüksek kesme streskoşulları altında bir aterosklerotik plak rüptürü tarafından tahrik edilirken, venöz tromboz çoğunlukla staz bir durumda endotel yaralanması yokluğunda gelişir8,9,10. Derin bir ven trombüsembolize ve pulmoner arterler doğru seyahat, bir pulmoner emboli neden olduğu. Bu kronik tromboembolik pulmoner hipertansiyon gelişimi de dahil olmak üzere kornik akciğer hastalıklarının gelişimini teşvik edebilir önemli bozulmuş fonksiyonel kapasitelere yol açan kronik vasküler obstrüksiyonlar neden olabilir (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH, en az üç ay süren antikoagülasyon tedavisinin ardından tromboembolik materyal ile pulmoner arterlerin tıkanması nedeniyle pulmoner basıncın yükselmesi ile karakterizedir15. Akciğer emboline ek olarak, pulmoner endotel cteph bir protrombotik ortam sağlar ve bu situ tromboz ve pulmoner arterlerin kronik tıkanıklıkları kolaylaştırır, sonuçta kalp yetmezliğine neden olabilir kan basıncında artışa neden olduğu ileri sürülmektedir, eğer tedavi edilmezse16,17.
Geçtiğimiz yıllarda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşma18ölçerek trombüs oluşumunu incelemek için çeşitli çalışmalar tahlillerin geliştirilmesine yol açmıştır. Ancak, çoğu ya kollajenler veya fibrinler gibi tek hücre dışı matriks bileşenleri ile tam kan etkileşimi çalışma, ya da endotel trombosit veya endotel-lökosit etkileşimi 19 gibi tek kan bileşenleri ile etkileşim endotel fonksiyonu19,20,21,22. Bu tahliller en sık insan göbek ven endotel hücreleri ile yapılır (HUVEC), Bu hücreler kolayca elde edilir gibi. Ancak, hemostatik genler farklı vasküler ağaç, damar tipleri arasında ifade edilir, ve organ sistemleri23,24, hangi arteriyel tromboz veya pulmoner emboli sorunlu dahil endotel hücrelerini temsil etmek için HUVECs kullanımını yapar23.
EC plastisiteye ek olarak, hastalığa özgü hemodinamik değişiklikler ve vasküler morfolojideki değişiklikler normal endotel25'tetrombüs oluşumunu teşvik edebilir. Daha yüksek kesme hızları, lokal vazokonstriksiyon veya damar geometrisindeki değişiklikler nedeniyle, örneğin, akut trombüs oluşumuna neden olabilir, kan akışının kesilmesini hızlandıran bir darlık neden26. Özel yapım mikromühendislik akış kanallarının kullanımı, özellikle (pato) biyolojiyi temsil eden vasküler geometrilerin tasarlanmasına olanak sağlar. Bu şekilde yerel biyomekanik kuvvetlerin sağlıklı veya hastalıklı EC27üzerindeki etkisini incelemek mümkündür.
Pıhtılaşma basamaklarında farklı evreleri ve molekülleri hedeflemek için antikoagülasyon tedavileri mevcuttur ve bunların hepsi belirli bozukluklara özgü olabilecek belirli riskler ve faydalar oluşturmaktadır. Bu yazıda açıklanan hastalık modelleme yaklaşımı özellikle trombüs dinamiği üzerinde çeşitli antikoagülasyon ve antiplatelet tedavilerin etkilerini test etmek için uygundur.
Amaç, kullanılan primer EC'lerin türüne bağlı olarak çeşitli tromboz formlarının analizine uygun çok yönlü bir model içeren bir tromboz modeli sunmaktır. Örnek olarak, Trombüs oluşumunda rol oynayan tüm bileşenleri (trombositler, lökositler, eritrositler, pıhtılaşma proteinleri ve kofaktörler) içeren tüm insan kanı ile etkileşimde CTEPH hastalarından pulmoner arter endotel hücreleri kullandık. Bu yaklaşım ticari paralel akış kanallarında veya özel vasküler tasarıma sahip özel yapım mikroakışkan akış kanallarında uygulanabilir. Bu nedenle, model sonunda trombüs oluşumu ve çözümü çalışmalarında kullanılabilir, hastalık modelleme inflamatuar yanıtların değerlendirilmesi için, antiplatelet veya antikoagülasyon tedavisi için, ve sonuçta kişiselleştirilmiş tıp için.
Bu çalışmada primer insan pulmoner arter endotel hücrelerinin izolasyonu açıklanmaktadır. Diğer birincil insan endotel hücre tiplerinin izolasyonu için, daha önce yayınlanmış yöntemlere atıfta bulunmak, pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri de dahil olmak üzere25, insan göbek ven endotel hücreleri28, ve kan dolaşan endotel kolonisi oluşturan hücreler Şekil 1A29.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>20 mL şırınga</td><td>BD</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>20X objektif</td><td>Olympus</td><td>N1492900 LUCPLFLN20XPH</td><td>/0.45</td></tr><tr><td>2-Propanol (IPA)</td> <td>Bom</td><td>760514555000</td><td></td></tr><tr><td>Aladdin Şırınga Pompası</td><td>Word Hassas Aletler</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Fibrinojen</td><td>İnvitrojen</td><td>F13191</td><td>15 ug / mL</td></tr><tr><td>Alexa647-Keçi anti Tavşan</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Biyopsi zımbası 1 mm çap</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-Kırmızı</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CD42b-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-208</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Sitrik Asit</td><td>Merck</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen Tip I, sıçan kuyruğu</td><td>Corning</td><td>354249</td><td>0.1 mg / mL</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Yüzey 60 mm Kültür Kabı</td><td>Corning</td><td>3295</td><td></td></tr><tr><td>Çapraz akışlı başlık</td><td>Basan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td>Duran</td><td>2478269</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Merck</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Ortamı (ECM)</td> <td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin İnsan</td><td>Plazması Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Akış borusu</td><td>ibidi</td><td>10831, 10841</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Merck</td><td>104070</td><td>0.1</td></tr>%<tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>mikron-Slayt VI 0.4 akış odaları</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.49</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar fırını</td><td>Quincy</td><td>10GC</td><td></td></tr><tr><td>LS720 Floresan mikroskop</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>Luer konektörü</td><td>ibidi</td><td>10802, 10825</td><td>Erkek dirsek konektörleri, Dişi boru konektörleri</td></tr><tr><td>MACS manyetik boncuklar (anti-CD144)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-857</td><td>1:5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopi slaytları, 76 x 26 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAAA000001##12E</td><td></td></tr><tr><td>Negatif fotorezist, SU-8</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>PBS'de %4 PFA</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin (P / S)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>%1</td></tr> <tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>kalsiyum veya magnezyum</td></tr><tr><td>içermez Plazma oda, CUTE</td><td>Femto Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS), Sylgard 184</td><td>Dow</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>sodyum sitrat kan alma tüpleri</td><td>BD</td><td>363048</td> trisodyum sitrat Merck 106448 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25300-045</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin (D87F2)-XP</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2500</td><td>1:300</td></tr></tbody></table>

in vitro mikroakışkan hastalık modeli gerçek zamanlı olarak tam kan-endotel etkileşimleri ve kan pıhtısı dinamikleri Çalışma

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Kan pıhtılarının oluşumu endotel hücreleri, altta yatan matris, çeşitli kan hücreleri ve proteinler arasında karmaşık etkileşimleri içerir. Endotel trombosit agregasyon, pıhtılaşma ve fibrinolyz kontrol büyük hemostatik moleküllerin çoğu birincil kaynağıdır. Tromboz mekanizması yıllardır araştırılmış olmasına rağmen, in vitro çalışmalar ağırlıklı olarak subendothelial matris maruz alır vasküler hasar durumları üzerinde odaklanmak, ya da tek kan bileşenleri ile hücreler arasındaki etkileşimler. Yöntemimiz tam kan ve sağlam, confluent vasküler hücre ağı arasındaki etkileşimleri incelenmesine olanak sağlar.
Birincil insan endotel hücrelerini kullanarak, bu protokol trombüs dinamikleri üzerinde endotel hücrelerinin etkisini incelemek için eşsiz bir fırsat sağlar ve trombotik hastalığın patofizyolojisi içine değerli bilgiler verir. Özel yapım mikroakışkan akış kanallarının kullanımı, hastalığa özgü vasküler geometrilerin uygulanmasına ve modele özgü morfolojik vasküler değişikliklerin uygulanmasına olanak sağlar. Trombüs gelişimi gerçek zamanlı olarak kaydedilir ve trombosit yapışması ve fibrin birikimi ile kantitatif olarak karakterize edilir. Değişmiş trombüs dinamiğinde endotel fonksiyonunun etkisi, spesifik moleküllerin immünfloresans boyaması yoluyla postanalysis ile belirlenir.
Temsilsonuçları deneysel kurulum, veri toplama ve veri analizi açıklar. Araştırma sorusuna bağlı olarak, her bölüm için parametreler hücre tipi, kesme oranları, kanal geometrisi, ilaç tedavisi ve postanalysis prosedürleri de dahil olmak üzere ayarlanabilir. Protokol, kronik tromboembolik hastalığı olan hastaların pulmoner arter endotellerinde trombüs oluşumunun ölçülmesi ile doğrulanır.

Temsili sonuçlar, her biri deneysel kurulum, veri toplama ve veri analizinin ilgili adımlarını temsil eden üç bölüme ayrılabilir. Araştırma sorusuna bağlı olarak, her adım için parametreler değiştirilebilir. Sunulan veriler endotel'in trombüs oluşumu üzerindeki etkisini incelemek için uygulanır.
Deneysel Kurulum Bu endotel hücrelerinin yapısı ve işlevi son derece heterojen olduğu tespit edilmiştir, yere ve zamana bağlı olarak, sağlık ve hastalık sırasında23. Endotel hücrelerinin çeşitli kaynakları endotel-kan etkileşimini incelemek için kullanılabilir, bu durumda ticari olarak mevcut HUVECs ve PAECs(Şekil 1A). HUVECs en sık laboratuvar modellerinde kullanılan olmuştur, PAECs pulmoner arterlerden hasta kaynaklı izole hücreler iken. Ayrıca, mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek için iyi kurulmuş protokoller vardır (MVEC) pulmoner dolaşım veya kan dolaşan endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFC)25,28,29.
İzolasyondan sonra endotel hücreleri ENDotelfenotini doğrulamak için VE-kadherin, CD31 ve TIE2 boyama ile karakterize edildi. αSMA ve sitokatin varlığı için karakterizasyon fibroblast veya epitel benzeri fenotip inancını göstermiştir (Şekil 1B). ECs son derece saf bir popülasyon elde ettikten sonra, geçiş 3-5 hücreleri ya ticari bir mikroslayt veya özel yapılmış mikroakışkan akış kanalları tohum için kullanılmıştır(Şekil 1C). Ticari olarak mevcut mikroslaytlar öncelikle paralel akış odaları veya yükseklik veya çatallanma açısı nda özel olarak tanımlanmış parametrelere sahip Y şeklindekanallar olmakla birlikte, mikroakışkan slaytların kullanımı deneysel parametrelerin in vivo damar geometrisi ve kan akışı dinamiği31'euyarlanmasını mümkün kılar. Ancak, özel yapılmış mikroakışkan boyutları daha küçük ve hücre yayılmasını sınırlamak ve daha fazla hücre ölümü neden eğilimindedir32,33. Hücrelerin fazlalığı kullanarak hücrelerin sadece küçük bir yüzdesi yapışacak gerçeği telafi eder. Bu durum, endotel hücrelerinin paralel mikroakışkan kanala göre daha uzun bir fenotip gösterdiği bir darlık ortaya çıktığında gözlenmiştir(Şekil 1D). Ticari akış odaları hücrelerin bağlanabileceği daha büyük bir yüzey alanına sahiptir. Bu tohumlama için daha az hücre numaraları gerektirir.
Endotel hücre-kan etkileşimini incelemek için, tam kan bir endotel monokat üzerinde perfüzyon oldu. Sitrated kan deney günü toplandı ve perfüzyon hemen önce rekalcified. Hücreler perfüzyon dan önce VWF salınımı ve trombosit yapışma30 dk indüklemek için histamin ile uyarılmış (Şekil 1E)34,35. Küçük boyutlar nedeniyle, özel yapım mikroakışkan kanallar daha küçük kan hacimlerinin kullanımına izin verdi.
Veri toplama PAECs trombüs oluşumunu araştırmak için, Calcein AM-Kırmızı floresan etiketli kan hücreleri ve Alexa488-konjuge fibrin 5 dakika için 2.5 dyne / cm2 (Şekil 2A–C) perfüzyon edildi. Yapışık kan hücreleri ve biriken fibrin sayısallaştırılmıştır. Görüntüler her 30'da bir elde edildi ve ImageJ ile ölçüldü. Yapışmaz trombositlerin otofloresansını ortadan kaldırmak için arka planı çıkarmak önemliydi. Eşik için üçgen algoritması en az arka planı tanımlamak için kullanılmıştır. Küçük trombosit agregalarının ölçümü için izin verilir (Şekil 2D).
Beklenen, uyarılmayan koşullar altında, endotel trombosit ve fibrin hiçbir bağlama yoktu. VWF salınımı ve trombosit bağlanmasını teşvik etmek için, PAEC'ler histamin ile uyarıldı, bu da trombosit yapışmasının 2,5 dk sonra bir platoya ulaşmasında ani bir artışa yol açtı. Bu dönemde trombositler trombosit agregasyonu ve fibrinojen dekoltesini fibrin içine soğutan otokrin faktörleri salgılamaya başlamıştır. Fibrin 3 dk sonra yatırıldı ve 4 dk sonra trombositlerle istikrarlı bir agrega oluşturdu (Şekil 2E).
Bu etkinin doğrudan oral antikoagülan (DOAC) tarafından inhibe edilip edilmeyeceğini araştırmak için kan 10 nM dabigatran ile tedavi edildi. Dabigatran pıhtılaşma yolunda Faktör IIa inhibe kan seyreltme eklendi, ve fibrinojen bölünmesi engelledi fibrin lifleri oluşturmak için. Dabigatran'da tedavi edilen kan uyarılmış PAEC'ler üzerinden perfüzyon yapıldığında, pıhtı oluşumu esas olarak fibrin birikimini geciktirerek doğrudan inhibe edilebilir(Şekil 2F).
Veri analizi Çeşitli endotel kaynaklarının trombüs oluşumu üzerindeki etkisini incelemek için 5 dk kan perfüzyonu üzerindeki hücresel değişiklikler analiz edildi. Endotel sabitlendi ve konfokal mikroskop altında görüntülemeden önce yapışık trombositler CD42b ile etiketlendi. Bu, trombosit ve fibrinin kandaki işlevsiz pıhtılaşma faktörlerini gösterebilecek kolokalizasyonu için ayrıntılı bir analiz sağlamıştır. Pıhtı oluşumunda AT'nin etkisi standart immünofloresan boyama ile belirlendi. Endotel hücre hücresi kontakları, VE-kadherin boyama ile doğrulanarak, endotelsel boşluklar arasındaki altta yatan matris yerine endotel monotabakasının üstünde oluşan kan pıhtılarının olduğunu gösteren korunmuştur (Şekil 3). Ayrıca, farklı hücre kaynaklarının kullanımı endotel üzerinde oluşan trombosit farklı desenleri sonuçlandı. HUVECs venöz endotel hücreleri ve sınırlı trombosit adezyon ve fibrin birikimi gösterdi, CTEPH hastalarından hastalıklı primer PAEC sağlıklı PAEC göre histamin stimülasyonu üzerine bol trombosit adezyonu ve daha fibrin birikimi gösterdi. Bu, CTEPH hastalarının endotellerinin vazoaktivasyona daha yüksek yanıt verdiğini ve trombüs oluşumunun arttığını göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig1.jpg"> Şekil 1: Protokolün şematik genel bakışı. (A) Çeşitli kaynaklar ve endotel hücrelerinin farklı türleri izole edildi ve perfüzyon deneyleri için mikroakışkan akış kanalında kullanılmak üzere kültürlendi. Endotel hücrelerinin farklı türde temsili brightfield görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) İzole hücreler endotelfenotini doğrulamak için immünoresan boyama ile karakterize edildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Hücreler ticari akış slaytlarında veya özel olarak üretilen mikroakışkan kanalda tohumlanabilir. (D) Farklı kanal geometrilerinde yetiştirilen HUVEC'in temsili brightfield görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. (E) Kan perfüzyon deneylerinin deneysel kurulumu. Sitrated kan toplandı, tuzlu tampon ile seyreltilmiş, ve bir şırınga pompası ile endotel hücreleri üzerinde perfüzyon. Bu rakamdaki akciğer ve göbek damarı Servier Medical Art'tan değiştirilmiştir, Creative Common Attribution 3.0 Generic License lisansı altında lisanslandı. http://smart.servier.com/ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig2.jpg"> Şekil 2: Trombüs oluşumunun görüntü edinimi ve niceliği. (A) Bağlı Calcein AM-Red etiketli trombositlerin temsili zaman atlamalı görüntülemeve 1, 3, ve 5 dk uyarılmamış PAECs üzerinde tam kan perfüzyonu sonra Alexa488-konjuge fibrin yatırılır (B) ve histamin uyarılmış PAECs üzerinde. (C) Trombosit adezyonu ve fibrin birikiminin 1, 3 ve 5 dk'da histamin uyarılmış PAEC'ler üzerinde dabigatran ile inkübe edilmiş tam kan la perfüzyonun zaman atlamalı görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. (D) ImageJ'de görüntü nicelemi şematik genel bakışı. (E) Trombosit adezyonu ve fibrin birikiminin her 30 s'lik bir uyarılmamış ve histamin uyarılmış endotel üzerinde ölçülmesi. (F) Trombosit adezyonu ve fibrin birikimi ile ölçülen trombüs oluşumu üzerine dabigatran etkisinin ölçülmesi. Veriler ortalama ± SD, n = 3 olarak temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig3.jpg"> Şekil 3: Trombosit adezyonunda trombüs oluşumunu ve endotel hücrelerinde fibrin birikimini karakterize eden akış deneylerinin temsili konfokal görüntüleri. Endotel hücre-hücre kontakları VE-kadherin ile karakterize edildi ve kontrol PAECs ölçüldü, hasta kaynaklı CTEPH PAECs, ve HUVEC. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Bu In Vitro Hastalık Modeli, trombojenite ve antikoagülan ajanların etkinliğini değerlendirmek için, özellikle endotel, tam kan ve hasta türetilmiş hücrelerin etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Bu endotel hücreleri çeşitli durumlarda kullanılabilir ve özel yapılmış mikroakışkanlar tanıtarak veya kan akımı parametreleri ayarlayarak değiştirilebilir. Buna ek olarak, bu model inflamatuar koşullarda trombüs dinamikleri çalışma için kullanılabilir, ya da antikoagülan ve antiplatelet tedavisinin etkilerini değerlendirmek için.Sonuçta, bu yaklaşımlar kişiselleştirilmiş tıp yöntemi kullanılabilir. Cerrahi bir insan pulmoner arter doku örneği aldıktan sonra, kat yüksek afinite hücre bağlama 60 mililitre hücre kültür çanak mililitre fiboronektin başına beş mikrogram iki mililitre ve en az 15 dakika boyunca 37 derece santigrat de çanak kuluçka. Kuluçka sonunda, steril koşullar altında bir laminar akış kabininde steril çalgılar kullanın, PBS bir Petri kabına doku aktarmak için.Doku hala bir halka ise, makas ile açık arter kesmek, damarın en iç tabakası dokunmamaya dikkat, endotel kolayca zarar görmüş ve kaldırılır gibi. Fibronektin çıkardıktan sonra, çanak tam endotel hücreli orta dört mililitre ekleyin ve ortama doku örneği aktarmak için forseps kullanın, dikkatle orta içine geminin iç tabakası kazımak için bir neşter kullanın, damar duvarında gözlenen herhangi bir lipid birikimini önlemek için özen. Hücreler hasat edildikten sonra, hücre kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin.Fibroblastlar kültürü kirletecekse, üreticinin talimatlarına göre hücreleri arındırmak için bir CD144 için manyetik afinite hücre ayrımı kullanın. Genellikle, kültür saf olarak tanımlanır, akış sitometri sitometri% 10 veya daha az kirletici hücreleri algılar. Deneysel kullanım için yeterli sayıda endotel hücresi elde edildiğinde, primer endotel hücreleri endotel hücresispesifik belirteçlerinin varlığı ve düz kas ve epitel hücre belirteçlerinin yokluğu için karakterize edilebilir.Akış odası hazırlama için, %0,1 jelatin 30 mikrolitre ile altı kuyu akış slayt kod bir kanal ve 37 santigrat derece en az 15 dakika bu slayt kuluçka. Ticari akış odalarına ek olarak, vasküler geometrinin pıhtı dinamiği üzerindeki etkisini incelemek için özel boyutlara sahip özel akış odaları da kullanılabilir. Slayt kuluçka iken, EDTA ve tripsin ve santrifüj ile hücreleri sediment ile bir konfluent pulmoner arter endotel hücre kültüründen hücreleri toplamak, tam endotel hücre orta ve kuvvetle ama yavaşça 600 mikrolitre pelet askıya, her kanala hücre 100 mikrolitre ekleyin, tam bir 50 mikrolitre ek bir ek ekleyebilirsiniz tam endotel hücre liyal hücre kanalına tam bir 50 mikrolitre ekleyin , 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit gece kuluçka için yeterli orta sağlamak için, bağlı olmayan hücreleri yıkamak için ertesi gün orta değiştirin.Kültürde altı gün sonra, hücreler istikrarlı bir konfluent monolayer oluşmuş olmalıdır. Pulmoner arter endotel hücre kültürünün yedinci gününde, 109 monosodyum sitrat antikoagülan tüpler içine antikoagülasyon tedavisi almayan deneklerden venöz kan örnekleri almak ve 50 mililitrelik tüp içine kan transferi. Kan virüsler ve diğer enfeksiyöz ajanlar içerebilir.Bu nedenle her zaman eldiven giymek ve insan materyali ile çalışmak için güvenlik rehberliğitakip etmek önemlidir. Floresan 1 ila 10, Calcein Kırmızı ve mililitre başına 50 mikrogram konsantrasyonu ile kan hücreleri etiketli ve Alexa 488 fibrinojen eklemek, sonra tam emilimi sağlamak için 15 dakika boyunca 37 derece santigrat kan kuluçka. Perfüzyondan 30 dakika önce pulmoner arter endotel hücrelerini endotel hücreli ortamda bir mikromolar histaminin 100 mikrolitresi ve %1'i fetal sığır serumu ile tedavi edin.Ve akış sistemi tüplerini durulamak için yıkama tamponuyla dolu 20 mililitrelik bir şırınga kullanın, iki mililitre yıkama tamponuyla üçüncü bir ila 20 mililitrelik şırınga yükleyin ve şırıngayı bir şırınga pompasına yükleyin. İkinci bir 20 mililitreşlik şırınga hippiler artı tampon% 1 sığır serum albumin içeren ve dikkatle mikro slayt tüpleri bağlamak için bir dirsek şekli Laura konektörü kullanmak için ikinci bir 20 mililitreşşöf kullanın, şırınga için slayt çıkış bağlamak, sahneye slayt içeren hücre yerleştirerek mikroskopi onarım ve deney için kurulum montaj , mikroskobu ayarlayın ve görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Ampirik kanın yeniden kalsifikasyonu.Ve bu pıhtılaşma mutlu bir co-sponsoru, ayrıca bu endotel hücre tabakası zarar ve sonuçları etkilemek çünkü hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için deneyin. Perfüzyonhemen önce, rekalsifikasyon tampon ile iki kez kan seyreltmek ve kan tüpü içine mikro slayt giriş tüpü yerleştirin, şırınga pompası basın başlatın. Kan endotel üzerinden akmaya başlar başlamaz, önceden seçilmiş aktif kanalları ve ilgi alanları nın konumlarını kullanarak görüntüleri elde etmek için mikroskoba beş dakika boyunca her 15 saniyede bir başlayın.Analizin sonunda, kaydı ve şırınga pompasını durdurun ve düzgün bir şekilde temizleyin. Calcein Red ile trombosit etiketleme ve Alexa 488 konjuge fibrinojen eklenmesi, trombosit yapışma ve lif ve birikimi ile trombüs oluşumunun araştırılmasına olanak sağlar. Uyarılmayan koşullarda trombosit veya fibrin endotel için herhangi bir bağlama yoktur.Histamin ile stimülasyon, trombosit adezyonunda ani bir artışa neden olur, bu noktada 2,5 dakika sonra bir platoya ulaşır, trombositler fibrin trombosit agregasyonu ve fibrinojen bölünmesine neden olan otokrin faktörleri salgılamaya başlar, üç dakikada lif ve birikme ile sonuçlanır ve dört dakika sonra trombositlerle stabil bir agrega oluşumu na neden olur. Doğrudan antikoagülan ile tedavi, tedavi edilmeyen kana göre hem pıhtı oluşumunu hem de trombosit yapışmasını inhibe eder. Pulmoner arter endotel hücre trombosit etkileşimlerinin beş dakikalık perfüzyondan sonra immünfloresan analizi, endotel hücresinin bakımını ortaya çıkarır, hücre kontakları, vasküler endotel kadherin boyama ile doğrulanırsa, endotelsel model tabakalarında kan pıhtılaşmasının endotel seliyal boşluklar arasındaki alt matris yerine oluştuğunu gösterir.insan umbilikal ven endotel hücreleri pulmoner arter endotel ile karşılaştırıldığında daha az trombosit adezyonu ve fibrin birikimi göstermektedir. Özellikle kronik tromboembolik pulmoner hipertansiyon hastalarından hastalıklı primer pulmoner arter endotel hücreleri, sağlıklı hücrelere göre artmış trombosit adezyonu ve daha fazla fibrin birikimi sergilemektedir. Endotel trombojenitesi vasküler yatağın kökeni veya biyolojik arka plan parçaları gibi birden fazla faktöre bağlıdır.Bu protokol kullanılarak, vasküler ve kan bileşenlerinde içsel disfonksiyonlar, yanı sıra anti koagüle tedavinin etkinliği tromboz hemostazFarklı aşamalarında test edilebilir. Bu protokol, antikoagülasyon tedavisine hastaya özgü tepkileri tahmin etme potansiyeline sahip çeşitli tromboembolik hastalıklarda kan ve Teo etkileşimlerini anlamak için kullanılabilir.

in-vitro-microfluidic-disease-model-to-study-whole-blood-endothelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mikrovasküler ölçekli kanallar (&lt;30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Bir mikro-on-a-chip platformu fotolitografik reflowable ışığa tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan kombinasyonu tarafından geliştirilmiştir. Endothelialized mikro platformu, in vivo mikrodamar içinde üç boyutlu (3D) geometrisi ile taklit eden sürekli perfüzyon kontrollü akış altında çalışan, yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntü sağlar ve mikrovasküler araştırma için uygulanabilir.

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

İnsanlarda vasküler kan etkileşimlerini araştırmak için güvenilir modellerin erişilebilirliği eksiktir. Hem kandaki (ELISA) hem de vasküler kompartmandaki (mikroskopi) hücresel etkileşimleri araştırmak için insan tam kanı ile birleştirilmiş kültürlenmiş primer insan endotel hücrelerinin in vitro bir modelini sunuyoruz.

A Novel In vitro İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

Bu protokol, hastalık patolojilerinde hücre yanıtını belirlenmesinde yardımcı olmak için, in vitro olarak fizyolojik veya patolojik kan akışını çoğaltır. Kan pompası alt bölmeyi sönümleme bir basınç katılmasıyla, damar boyunca kan akımı değinmeyecek edilebilir ve vasküler endotelyum, ya da taklit eden ko-kültür, bir tek tabaka üzerine koydu.

Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Trombosit transfüzyonu ve hemostazı, kan bankacılığı trombositlerinin işlevini araştırmak için kan sulandırma ve mikroakışkan akış odaları kullanılarak modellendi. Veriler, trombosit depolama lezyonunun in vitro olarak hemostaz üzerindeki sonuçlarını göstermektedir.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Biz bütün, anticoagulated kan çalışma ve koagülasyon analizini sağlayan bir vitro modeli mevcut. Anticoagulation sistemi sağlıklı endotel hücreleri doğal anticoagulation etkisi bağlıdır ve endotel hücre aktivasyonu pıhtılaşma içinde sonuçlanır.

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

Burada sunulan bir standart in vitro hemodinamik döngü modeli için bir protokoldür. Bu model perfüzyon tüpleri veya vasküler stentlerin hemouyumluluğunun ISO (International Organization for Standardization) standardı 10993-4'e uygun olarak test edilmesine olanak sağlar.

Vasküler Tıbbi Cihazların Hemositokomisyonla uyumluluğunu ve Konak Hücre Aktivasyonunu Araştırmak için Bir In Vitro Hemodinamik Döngü Modeli

İn vitro tromboliz deneyleri, ister model trombüsün sindirildiği ortamda ister trombolizin meydana geldiği ortamda olsun, in vivo koşulları tekrarlamak için sıklıkla mücadele etmiştir. Burada, Chandler döngüsü ve Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testinin (RT-FluFF) birleştirilmesinin yüksek kaliteli, ex-vivo, pıhtı lizisi izleme için nasıl kullanıldığını keşfediyoruz.

Bir İn Vitro Tromboliz Modelinde Kesme Akışı Altında Chandler Döngü Şeklinde Tam Kan Pıhtılarının Fibrinolizinin İzlenmesi

Burada, endotel hücrelerini senkronize salınımlı hiperglisemi ve pulsatil kayma stresine maruz bırakan mikrofluidik bir sistem üretip çalıştırmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, diyabetik endotel disfonksiyonunu incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model sunar. Bu protokol, oksidatif stres ve endotel hücre yanıtlarının nicel ölçümünü sağlar.

Kombine Fizyolojik Pulsatil Kayma Stresi ve Salınım Hiperglisemi Altında Endotel Disfonksiyonunu Modellemek İçin Mikrofluidik Bir Sistem

Keşfedin, mikroakışkan sistemler kullanarak tam kan ve endotelyal hücre etkileşimlerini gerçek zamanlı inceleyin. Bu yöntem, trombojenite ve antikoagülan tedavilerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Daha fazla video keşfet