Name: Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Keşfedin, lab-on-a-chip platformunda kemik hücreleri yetiştirme protokollerini kullanarak mekanik yüklemeye yanıt olarak kemik oluşumu ve rezorpsiyonunu nasıl nicelendirebilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Grant Nos( CBET 1060990 ve EBMS 1700299) kapsamında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından Hibe No (2018250692) kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yazarların görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.

1. Talaş maskesi hazırlama
NOT: Adım 1.1 - 1.3 yalnızca fiş maskesinin ilk alınmasından sonra bir kez yapılması gerekir. Maskenin kullanım sırasında eğilmemesini sağlarlar. Mikroakışkan maskelerin tasarımı daha önce11,14olarak tanımlanmıştır. Maskeler şirket içinde tasarlanmış ve yüksek çözünürlüklü stereolitografi kullanılarak ticari olarak üretilmiştir (Şekil 1A).
<ol><li>Bu yüzeyi yapıştırıcıdan korumak için maskenin üst yüzeyini plastik kaplama ile kapatın. Talaş maskesini sprey yapıştırıcı kullanarak eşit büyüklükte akrilik bir levhaya sabitleyin. Yapıştırıcının tamamen iyileşebilmesi için parçaları bir gecede birbirine kenetle. Yapıştırıcı kuruduktan sonra maskenin üstündeki plastik kaplamayı çıkarın.</li>
	<li>Akrilik sayfanın alt kısmını çift taraflı bant kullanarak 3B baskılı seviyelendirme kutusuna(Ek Şekil 1, Ek Dosyalar 1-4)takın. Sıkı bir bağ sağlamak için sıkıca basın.</li>
	<li>Su geçirmez bir sızdırmazlık ile tesviye kutusunun çıkarılabilir duvarına yakın herhangi bir küçük açıklıkları kapatın. 24 saat boyunca dolgu maddesi tedavi edin.</li>
	<li>Maskenin yüzeyini %70 etanol (EtOH) ile temizleyin. Fırına istenilen talaş maskesi ile tesviye kutusunu yerleştirin. Maskenin üst kısmı düz olduğundan emin olmak için dijital protractor kullanın. Gerekirse tesviye vidalarını ayarlayın.</li>
</ol>2. PDMS imalatı
NOT: Fonksiyonel aktivite (oluşum ve rezorpsiyon) talaşları için sığ-kuyu (1 mm) talaş tasarımı, mekanik yükleme çalışmaları için ise derin kuyu (10 mm) talaş tasarımı kullanılmıştır. Derin kuyunun alt kısmı ayrı bir ince PDMS membranı takılarak oluşur (Şekil 1B).
<ol><li>Kapak katmanı (Katman 1)<ol>
<li>63 g PDMS prepolimerve 6,3 g kür leme maddesini (10:1 oranı) plastik bir kapta birleştirin. 30 dakika boyunca bir vakum desiccator bir tek kullanımlık hücre spatula ve degas ile iyice karıştırın.</li>
		<li>Yavaş yavaş hazırlanan tesviye kutusuna karışımı dökün. PDMS 30 dk oturup sonra 45 °C'de 18 saat pişirin.</li>
		<li>Konik bir laboratuvar spatulası ile PDMS'nin kenarlarını gevşetin ve polimer levhayı tesviye kutusundan çıkarın.</li>
		<li>Neşter ve 3D baskılı şablon kullanarak tek tek kapakları (70 mm x 34 mm) boyuta kesin.</li>
		<li>Biyopsi zımba (1 mm çapında) ile her kapak tan giriş delikleri.</li>
		<li>Yüzey ambalaj bandı ile kapakları temizleyin. NOT: Kapaklar hemen kullanılıyorsa, her biri ambalaj bandına sınır ve oda sınırında (RT) saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peki ve mikrokanal tabakası (Katman 2)<ol>
<li>PDMS prepolimer ve kür ajanını (10:1 oranı) plastik bir kapta birleştirin. Sığ-iyi tasarım prepolimer 43 g ve kür ajan 4.3 g gerektirir ve derin iyi tasarım prepolimer 227 g ve kür ajan 22.7 g gerektirir. 30 dakika boyunca polimer ve degas şiddetle karıştırın. NOT: Bu maske boyutu 152.4 mm x 152.4 mm'dir.</li>
		<li>Karışımı yavaş yavaş uygun önceden tesviye edilmiş maskenin üzerine dökün. PDMS 30 dk oturup sonra 45 °C'de 18 saat pişirin.</li>
		<li>Konik bir laboratuvar spatulası ile PDMS'nin kenarlarını gevşetin ve polimeri maskeden dikkatlice soyun. Tek tek yongaları kesmek için neşter ve 3B baskılı şablon kullanın. NOT: Yükleme çalışmaları için talaş boyutlarının (70 x 34 mm) hassas olması ve kuyunun çipin merkezinde bulunması önemlidir.</li>
		<li>Yüzey, PDMS'yi ambalaj bandı ile temizleyin. NOT: Talaşlar hemen kullanılıyorsa, her yongayı ambalaj bandına sınırve RT' de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İnce PDMS membran (Katman 3) NOT: Bu katman sadece derin kuyu tasarımı için kullanılır.<ol>
<li>Plastik bir bardağa 12,7 g PDMS prepolimer ve 1,3 g kür leme maddesi (10:1 oranı) ekleyin. Mix şiddetle ve degas için 30 dk.</li>
		<li>Yavaş yavaş hazırlanan tesviye kutusuna polimer dökün ve iyice mümkün olduğunca çok PDMS kaldırmak için plastik bardak kazıyın.</li>
		<li>PDMS'yi tüm yüzeye yaymak için hücre spatulasını kullanın. NOT: Polimer el ile yayılmazise, yüzey gerilimi polimerin tek tip bir levha oluşturmasını önlemek için yeterli olacaktır.</li>
		<li>PDMS 30 dk oturup sonra 45 °C'de 18 saat pişirin.</li>
		<li>KOnik bir spatula ile PDMS'nin kenarlarını gevşetin ve PDMS sayfasını tesviye kutusundan dikkatlice çıkarın. Katman 2'nin boyutlarıyla eşleşen tek tek membranları kesin.</li>
		<li>Zarın ortasındaki zar kalınlığını kaliperler kullanarak ölçün. İstenilen kalınlıkta (0,5 mm ± 0,1 mm) olmayan membranları atın.</li>
		<li>Ambalaj bandı ile membranları dikkatlice temizleyin ve bir parça parafin filminin üzerine yerleştirin. NOT: Membranlar hemen kullanılıyorsa, membranın üssünü ambalaj bandı ile kaplayın ve RT' de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fonksiyonel faaliyet alt tabakaları
NOT: Polistiren diskler ve kemik gofretleri osteoblast ve osteoklast kültürleri için kullanılacak kuyuların altına sırasıyla eklenmelidir.
<ol><li>Polistiren diskler (Şekil 1C)<ol>
<li>Bir doku kültürü polistiren coverslip tedavi arka tarafında maskeleme bandı yerleştirin. Bir keskinleştirilmiş mantar-borer (5,4 mm çapında) kullanarak kapaktan dairesel diskler kesin. Diskleri %70 EtOH'a batırın ve bir gece bırakın.</li>
		<li>Diskin üst yüzeyini %70 EtOH'a batırılmış pamuk uçlu bir aplikatörle hafifçe fırçalayın. Diskin dış kenarının iyice temizlenmiş olduğundan emin olun.</li>
		<li>İki çift forceps kullanarak diski tutun ve maskeleme bandı desteğini çıkarın. Diski aşağı doğru yerleştirin ve arka tarafı pamuk uçlu aplikatörle temizleyin.</li>
		<li>Pamuk uçlu aplikatörün tahta ucunu, gazdan arındırılmış PDMS karışımına batırın ve polimerin küçük bir kısmını istenilen kuyunun dibine yerleştirin. NOT: Kalan özlü PDMS -20 °C'de saklanabilir.</li>
		<li>Polistiren diski, işlenmiş tarafı yukarı, kuyuya yerleştirin ve pamuklu bir bezle diske hafifçe bastırın. Diskin tedavi edilen tarafıyla hiçbir uyarılmamış PDMS'nin temas halinde olmadığından emin olun. NOT: PDMS diskin işlenmiş yüzeyiyle temas ederse, diski kuyudan çıkarın ve yeni bir diskle 3.1.4 ve 3.1.5 adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>Talaş 30 dk düz bir yüzeye oturun ve sonra 65 °C'de 4 saat pişirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kemik gofretleri<ol>
<li>100 mm'lik bir kabın altına kemik gofret (6 mm çapında, 0,4 mm kalınlığında) yerleştirmek için forceps kullanın. Forceps ile sabit gofret tutun ve nazikçe bir neşter ile gofret arkasına bir 'X' gravür. NOT: Görüntüleme işlemi sırasında ,'X' gofretin arka sını ve hücrelerin tohumlandığı yüzeyi ayırt etmek için kullanılır.</li>
		<li>İstenilen kuyunun dibine az miktarda iyimeli PDMS eklemek için pamuk uçlu aplikatörün tahta ucunu kullanın. Kemik gofret yerleştirin, yan aşağı işaretlenmiş, kuyuya ve aşağı gofret basın için bir pamuk uçlu aplikatör kullanın.</li>
		<li>Talaş 30 dk düz bir yüzeye oturun ve sonra 65 °C'de 4 saat pişirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Talaş montajı ve sterilizasyonu
<ol><li>Orta radyo frekansı (RF) güç ayarı (yaklaşık 10,2 W'a eşdeğer) kullanarak 30 s'lik bir plazma temizleyicisi ile katman 1 ve katman 2 yüzeylerini etkinleştirin.</li>
	<li>Katman 1'deki erişim deliklerini katman 2'deki mikro kanallarla hizalayın ve iki katmanı sıkıca birbirine bastırın.</li>
	<li>Derin kuyu tasarımı için, katman 2 ve katman 3 ile adım 4.1'i tekrarlayın. Plazma tedavisi sırasında, katman 3'ün parafin filmini düz bir yüzeye takmak için çift taraflı bant kullanın.</li>
	<li>PDMS membranından fazla malzeme kesmek için bir neşter kullanın. Parafin filminin sayfasını fişin altından dikkatlice soyun.</li>
	<li>PDMS katmanları arasındaki bağı artırmak için çipi 65 °C'de 10 dk pişirin.</li>
	<li>Kapaktaki erişim deliklerine açılı dağıtım ipuçları (18 Gauge, 0,5 in, 90°) yerleştirin. İki parça epoksi ile kapağın dağıtım ipuçlarını sabitlayın. Her dağıtım ucu etrafında epoksi uygulamak için bir mikropipet ucu kullanın.</li>
	<li>Epoksi tamamen iyileştikten sonra, yüzey çipi %70 EtOH ile temizleyin ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Biyogüvenlik kabini içinde sonraki tüm adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Steril silikon boru (1/32'' ID, ~10 cm uzunluğunda) ile dağıtım uçlarına 5 mL şırınga bağlayın ve tüm çipi en az 30 s için %70 EtOH ile doldurun. Sığ-iyi tasarım için, 4 mL /h akış hızına ayarlanmış bir şırınga pompası ile tüm sıvıları uygulayın. Derin kuyu tasarımı için, şırıngayı yavaşça elle dağıtarak tüm sıvıları uygulayın.</li>
	<li>EtOH'u çipten çıkarın ve çipi uv ışığıyla bir gecede sterilize edin.</li>
	<li>Talaşı 3 kez dH2O ile yıkayın.2</li>
</ol>5. Mekanik yükleme cihazı montajı
NOT: 3D baskılı mekanik yükleme cihazının(Şekil 2A-C)tasarım ve üretim süreçleri daha önce tanımlanmış ve yazdırılan bileşenlere ait tüm tasarım dosyaları daha önce13olarak sağlanmıştır.
<ol><li>Yükleme cihazının tüm bileşenlerini 121 °C'de 30 dk otoklavlayın. NOT: Yazdırılan bileşenlerin bükülmesini önlemek için, her parçayı ayrı ayrı folyoya sarın ve otoklavlama işlemi sırasında sert düz bir yüzeye yerleştirin. Metal donanım birlikte sarılmış olabilir. Biyogüvenlik kabini içinde sonraki tüm adımları tamamlayın.</li>
	<li>Plakanın şaftına bir sıkıştırma yayı yerleştirin ve plakayı tabanın altındaki merkezi deliğe yerleştirin(Şekil 2D).</li>
	<li>Dört kendinden dokunan vida kullanarak kadran bloğunu tabanın altına takın.</li>
	<li>Merkezi vidanın etrafına ikinci bir sıkıştırma yay yerleştirin. Vidayı kadranaltındaki altıgen şekilli deliğe yerleştirin ve tertibatı kadran bloğunun ortasındaki dişli deliğe vidalayın.</li>
	<li>Üssün dibine dört erkek-kadın soğukluğu vidalayın.</li>
	<li>Plakanın üst kısmı tabanın üst kısmı altına girene kadar kadranı saat yönünün tersine çevirerek cihazdaki bolluğu kaldırın. Daha sonra plakanın üst kısmı tabanın üst kısmıyla aynı seviyeye gelene kadar kadranı saat yönünde yavaşça çevirin.</li>
</ol>6. Deney
NOT: Fonksiyonel etkinlik deneyleri için protokoller daha önce11,12sağlanmıştır.
<ol><li>Yükleme çalışmaları (Şekil 3)<ol>
<li>4.9. adımdan sonra, derin kuyu çipinden dH2O'yu çıkarmak için 5 mL'lik bir şırınga kullanın. 0.15 mg/mL tip I kollajen (CTI) ile kuyunun dibini 0,02 M asetik asitle 1 saat kaplayın.</li>
		<li>Talaşı Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu tuzu ile kalsiyum ve magnezyum (DPBS++) ile üç kez durulayın.</li>
		<li>% 5 buzağı serumu, %5 fetal sığır serumu ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenen minimum esansiyel alfa ortamda (MEMα) 2 x 104 hücre/mL yoğunlukta MLO-Y4 osteositleri ile talaş tutucuya ve tohumuna yerleştirin.</li>
		<li>Boruları dağıtım uçlarından çıkarın ve talaşlı derin bir kültür çanağı (150 mm x 25 mm) içine yerleştirin. 37 °C'de ve %5 CO2'de 72 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Dağıtım ipuçlarına steril borular takın ve harcanan kültür ortamını çipten çıkarmak için 5 mL'lik bir şırınga kullanın. Yavaş yavaş çip doldurmak için taze kültür ortamı dağıtmak.</li>
		<li>Talaş tutucuyu yükleme cihazı tabanının üstüne dikdörtgen insetiçine yerleştirin. Tüpü yükleme cihazının kapağında bulunan yuvalardan besleyin ve kapağı dört tava kafası vidası ve hex somunları ile tabanına sabitleyin. NOT: Kapağın düz kalmasını sağlamak için, kalan iki vidayı emniyete almadan önce birbirinden çapraz olarak bulunan iki vidayı emniyete alın.</li>
		<li>İstenilen plaka deplasmanına ulaşılıncaya kadar kadranı saat yönünde çevirerek hücrelere yük uygulayın. NOT: Cihaz, kadranın bir dönüşü 1 mm plakalı bir deplasmana eşit olacak şekilde tasarlanmıştır. PDMS membranının üst kısmında oluşturulan gerilme alanı daha önce sonlu elemanlar analizi (FEA)13kullanılarak plaka deplasmanının bir fonksiyonu olarak modellenmiştir.</li>
		<li>Yükleme cihazını boş bir P1000 mikropipet ucu kutusuna yerleştirin. 15 dakika boyunca uygulanan yük ile hücreleri kuluçkaya yatırın. NOT: Burada kullanılan yükleme süresi bir örnek olarak hizmet vermektedir. Alternatif yükleme süreleri kullanılabilir.</li>
		<li>Kuluçkadan sonra, plaka orijinal başlangıç konumuna dönene kadar kadranı saat yönünün tersine çevirerek yükü hücrelerden çıkarın. Kapağı cihazdan çıkarın ve talaş tutucuyu derin kültür plakasına yerleştirin. 90 dk sonrası yük kurtarma süresi için hücreleri kuluçkaya yatırın. NOT: Yine, burada kullanılan kurtarma süresi bir örnek olarak hizmet vermektedir. Alternatif kurtarma süreleri kullanılabilir. Uzun süreli çalışmalar için, her 72 saat hücreleri besleme.</li>
		<li>Koşullu ortamı çipten çıkarmak için 5 mL'lik bir şırınga kullanın. NOT: Bu ortam -80 °C'de kaydedilebilir ve saklanabilir.</li>
		<li>Çipi talaş tutucudan çıkarın ve PDMS kapağı ile kuyu tabakası arasındaki bağı kırmak için konik bir spatula kullanın. NOT: Hücresel tahliller artık bir hücre kültür plakası için belirlenen herhangi bir protokole göre yapılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+Osteocytes%2C+and+Mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction.</a> Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li>
<li>Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+platform+for+investigating+osteocyte-osteoclast+signalling+during+fluid+shear+stress+mechanostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation.</a> Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).</li>
<li>Kou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multishear+microfluidic+device+for+quantitative+analysis+of+calcium+dynamics+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).</li>
<li>Ma, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chip-based+co-culture+of+fibroblast-like+synoviocytes+with+osteoblasts+and+osteoclasts+to+test+bone+erosion+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation.</a> Royal Society Open Science. 5 (9), 180528(2018).</li>
<li>Jang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+osteoblast-based+3D+continuous-perfusion+microfluidic+system+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PLOS ONE. 9 (2), e89966(2014).</li>
<li>Hwang, P. W., Horton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+osteogenic+performance+of+MC3T3-E1+subclones+impacts+their+utility+as+models+of+osteoblast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8299(2019).</li>
<li>Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+lifetime+lead+exposure+impedes+osteoclast+activity+and+produces+an+increase+in+bone+mass+in+adolescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice.</a> Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).</li>
<li>Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+growth+factor+control+of+bone+formation+through+osteoprogenitor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation.</a> Bone. 34 (3), 402-411 (2004).</li>
<li>George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-chip+platforms+for+quantification+of+multicellular+interactions+in+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling.</a> Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).</li>
<li>Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+considerations+for+optimizing+bone+cell+culture+and+remodeling+in+a+lab-on-a-chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform.</a> Biotechniques. , In review (2019).</li>
<li>Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+loading+device+for+inducing+cellular+mechanotransduction+via+matrix+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation.</a> Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).</li>
<li>George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanically+loaded+osteocytes+and+inflammation+on+bone+remodeling+in+a+bisphosphonate-induced+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment.</a> Bone. 127, 460-473 (2019).</li>
<li>George, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quantifying+the+roles+of+stimulated+osteocytes+and+inflammation+in+bone+remodeling+Doctor+of+Philosophy%22">Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy</a>. , University of Akron. (2019).</li>
<li>York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+osteocytic+microdamage+and+viability+quantification+using+a+microloading+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Engineering+%26+Physics%22%5BJournal%5D)">In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform.</a> Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).</li>
<li>Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+plasma+treatment+of+polymer+surface+for+irreversible+sealing+of+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices.</a> Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).</li>
<li>Millare, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+the+quality+of+adhesion+between+poly%28dimethylsiloxane%29+and+glass+surfaces+on+the+conditions+of+treatment+with+oxygen+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma.</a> Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+compatibility+of+poly%28dimethylsiloxane%29-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices.</a> Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li>
<li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncured+PDMS+inhibits+myosin+in+vitro+motility+in+a+microfluidic+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell.</a> Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).</li>
<li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li>
<li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li>
<li>Van Scoy, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+automata+model+of+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mathematical+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A cellular automata model of bone formation.</a> Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).</li>
<li>Truesdell, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+remodeling+platforms%3A+Understanding+the+need+for+multicellular+lab-on-a-chip+systems+and+predictive+agent-based+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mathematical+Biosciences+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models.</a> Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makalede, osteositler, osteoklastlar ve osteoblastlar için bir kemik remodeling LOC platformu imal için temelleri açıklanmaktadır. Çip içindeki kuyunun derinliğini ve boyutunu değiştirerek, osteositlerin mekanik yük ile uyarLanması ve kemik remodelinginin fonksiyonel sonuçlarının ölçülmesi için birden fazla konfigürasyon geliştirilmiştir(Şekil 1B).
Talaş montajı sırasında plazma oksidasyon protokolünün optimize edilmesi sızıntı endişelerini ort...

Kemik üç ana hücre tipleri arasında karmaşık koordinasyon gerektiren son derece dinamik bir dokudur: osteositler, osteoblastlar, ve osteoklastlar. Bu hücreler arasındaki çok hücreli etkileşimler felç ve uzun süreli hareketsizlik sırasında meydana gelen kemik kaybından ve büyüme ve egzersize yanıt olarak oluşan kemik oluşumundan sorumludur. Osteositler, en bol kemik hücre tipi, kemiğe uygulanan mekanik uyaranlara karşı son derece duyarlıdır. Mekanik stimülasyon osteosit metabolik aktivitesini değiştirir ve anahtar sinyal molekülleri bir artışa yol açar1,2. Bu süreç sayesinde, mekanotransdüksiyon olarak bilinen, osteositler doğrudan osteoblastlar (kemik oluşturan hücreler) ve osteoklastlar (kemik rezorbülasyon hücreleri) faaliyetlerini koordine edebilirsiniz. Kemik homeostazBakımı kemik oluşumu ve kemik rezorpsiyon oranları arasında sıkı bir düzenleme gerektirir; ancak, bu süreçte ki aksaklıklar osteoporoz veya osteopetrozis gibi hastalık durumlarına neden olabilir.
Bu üç hücre tipi arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı, mikroakışkan ve laboratuvar-on-a-chip (LOC) teknolojilerini kullanarak araştırmaya iyi katkıda bulunur. Bu amaçla, laboratuvarımız son zamanlarda kemik rezorpsiyon ve oluşumu (fonksiyonel sonuçlar) kemik remodeling sürecinde analiz etmek için bir LOC platformu kavramı kanıtı kurmuştur. Platform hücresel etkileşimlerin, değiştirilmiş yükleme ortamlarının ve araştırma ilaç taraması nın incelenmesi nde kullanılabilir. Son yıllarda, çeşitli mikroakışkan cihazlar kemik remodeling düzenleyen moleküler sinyal yollarını araştırmak için geliştirilmiştir; ancak, bu sistemlerin çoğu fonksiyonel aktivite3,4,,5,,6,7göstergesidir dolaylı belirteçleri ile remodeling ölçmek . Sistemimizin bir avantajı, fonksiyonel sonuçların doğrudan ölçülmesi için kullanılabilmesidir. Kemik remodeling uzun vadeli bir süreçtir. Bu nedenle, kemik rezorpsiyonu ve oluşumunun doğrudan nicelleştirilmesi, en az birkaç hafta8ile 8 ,9,,10,11arasında tutulabilen bir kültür sistemi gerektirir. Böylece LOC platformünü geliştirirken, oluşum ve rezorpsiyon için gerekli uzun vadeli kültür protokolleri oluşturduk ve sistem içinde yedi haftaya kadar hücreleri koruduk11. Ayrıca, her iki hücre tipi için uygun culturing yüzeyleri platforma dahil ettik; osteoklastlar doğrudan kemik üzerine, ve plastik yapışık olduğu bilinen osteoblastlar polistiren diskler üzerinde kültürlendi. Ayrıca, remodeling analizi11,,12için sterilite, uzun vadeli sitotoksisite ve talaş demontaj ile ilgili konuları ele aldı.
LOC platformu da matris deformasyon yoluyla osteosit mechanotransdüksiyon indüklemek için kullanılabilir. 3D baskılı mekanik yükleme cihazı LOC ile eşleştirmek ve hücreleri13germek için düzlem dışında statik bir dağıtım uygulamak için geliştirilmiştir. Bu mekanik yükü karşılamak için LOC içindeki kuyunun derinliği artırıldı. Bu küçük ölçekli, basit mekanik yükleme cihazı kolayca sınırlı mühendislik deneyimi ile laboratuvarlar tarafından üretilebilir, ve biz daha önce 3D baskılı bileşenlerin çizimleri paylaştık13. Mevcut çalışmada, LOC'un başarılı kullanımı için gerekli olan bazı yeni teknikleri gösteriyoruz. Bu tekniklerin açıklanmasının görsel bir formattan yararlandığına inanıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Akrilik levha</td><td>Optix</td> <td>-</td> <td>3.175 mm kalınlık</td></tr><tr><td>Açılı dağıtım uçları</td><td>Jensen Global</td><td>JG18-0.5X-90</td><td>Kullanmadan önce plastik konektörü çıkarın</td></tr><tr><td>Biyopsi yumruğu</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP-10</td><td>1 mm çap</td></tr><tr><td>Kemik gofretleri</td><td>Boneslices.com</td><td>0,4 mm kalınlığında</td><td>Sığır kortikal kemik</td></tr><tr><td>Sığır buzağı serumu</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td>SH30072</tr><tr><td>Kaliperler</td><td>Global Endüstriyel</td><td>T9F534164</td><td></td></tr><tr><td>Hücreli spatula</td><td>TPP</td><td>99010</td><td></td></tr><tr><td>Çip maskesi</td><td>ProtoLabs</td><td>Özel tasarım</td><td>Baskı malzemesi: Accura SL 5530</td></tr><tr><td>Mantar delici</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-865-10B</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk uçlu aplikatör</td><td>Püriten</td><td>806-WCL</td><td></td></tr><tr><td>Kültür çanak (100 mm)</td><td>Corning</td><td>430591</td><td>Steril, Doku kültürü işlem görmemiş</td></tr><tr><td>Kültür kabı (150 mm)</td><td>Corning</td><td>430597</td><td>Steril, Doku dışı kültür işlem görmüş</td></tr><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>3M Company</td><td>Scotch 237</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Hyclone</td><td>SH30910</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Tesviye kutusu</td><td>Ismarlama</td> <td>-</td> <td>3D baskılı</td></tr><tr><td>Maskeleme bandı</td><td>3M Company</td><td>Scoth 2600</td><td></td></tr><tr><td>MC3T3-E1 preosteoblastlar</td><td>ATCC</td><td>CRL-2593</td><td>Alt klon 4</td></tr><tr><td>Mekanik yükleme cihazı</td><td>Ismarlama</td> <td>-</td> <td>3D baskılı</td></tr><tr><td>Minimum esansiyel alfa ortamı</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>MLO-Y4 osteositler</td> <td>--</td><td>--</td><td>Dr. Lynda Bonewald'dan Hediye</td></tr><tr><td>Ambalaj bandı</td><td>Ördek Markası</td> <td>-</td> <td>Standart ambalaj bandı</td></tr><tr><td>Parafin filmi</td><td>Bemis Parafilm</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>p4333</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Genişletilmiş plazma temizleyici</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan kiti</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren lameller</td><td>Nunc Thermanox</td><td>174942</td><td>Steril, doku kültürü ile tedavi edilmiş</td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Quincy Lab</td><td>12-180</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 preosteoklastlar</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>BD Medical</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Silikon boru</td><td>Saint-Gobain Tygon</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32" (0,79 mm), OD: 3/32" (2,38 mm)</td></tr><tr><td>SolidWorks yazılımı</td><td>Dassault Syst&egrave; MES</td> <td>-</td> <td>3D baskılı modeller oluşturmak ve FEA Sprey</td></tr><tr><td>yapıştırıcı</td> gerçekleştirmek için kullanılır <td>Loctite</td><td>2323879</td><td>Çok Amaçlı Yapıştırıcı</td></tr><tr><td>Şırınga (5 ml)</td> <td>BD Medical</td><td>309646</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-2213</td><td>Pompa 11 Pico Plus</td></tr><tr><td>Konik laboratuvar spatulası</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>İki parçalı expoxy</td><td>Loctite</td><td>1395391</td><td>5 dakika hızlı ayar</td></tr><tr><td>Tip I kollajen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Sıçan kuyruğu kollajen</td></tr><tr><td>Vakumlu kurutucu</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td><td></td></tr><tr><td>Su geçirmez mastik</td><td>Gorilla</td><td>8090001</td><td>%100 silikon mastik</td></tr></tbody></table>

osteosit mekanotransdüksiyonu uyaran ve kemik remodeling fonksiyonel sonuçları analiz için bir lab-on-a-chip platformu

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Kemik remodeling iskelet büyüme ve onarım yanı sıra mekanik ortamda değişikliklere adapte için gerekli olan sıkı düzenlenmiş bir süreçtir. Bu süreçte, mekanosensit osteositler katabolik osteoklastlar ve anabolik osteoblastlar arasındaki karşıt tepkileri düzenler. Bu süreci düzenleyen son derece karmaşık sinyal yollarını daha iyi anlamak için, laboratuvarımız küçük ölçekli bir sistem içinde kemik remodeling fonksiyonel sonuçları (oluşumu ve rezorpsiyon) analiz etmek için temel bir laboratuvar-on-a-chip (LOC) platformu geliştirdi. Kemik remodeling hafta lar ay sırasına göre meydana gelen uzun bir süreç olduğundan, sistem içinde uzun vadeli hücre culturing protokolleri geliştirdi. Osteoblastlar ve osteoklastlar LOC içinde fonksiyonel aktivite substratları üzerinde yetiştirilen ve yedi haftakadar muhafaza edildi. Daha sonra, talaşkemik oluşumu ve rezorpsiyon kantitatifikasyon uyracak şekilde söküldü. Ayrıca, loc platformu ile eşleşen ve hücresel matris deforme ederek osteosit mekanotransdüksiyon ikna etmek için kullanılabilir bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı tasarladık. Loc platformu içinde osteositler, osteoblastlar ve osteoklastlar için hücre kültür protokollerini optimize ettik ve sterilite ve sitotoksisite ile ilgili endişeleri ele aldık. Burada, LOC'un üretilmesi ve sterilizasyonu, fonksiyonel yüzeylerde hücrelerin tohumlanması, mekanik yükün indüklenmesi ve uç nokta sonuçlarını ölçmek için LOC'un sökülmesi için protokoller sunuyoruz. Bu tekniklerin kemik remodeling için gerçek bir organ-on-a-chip geliştirmek için zemin yatıyordu inanıyoruz.

Sığ-iyi yapılandırma osteoblastlar ve osteoklastların fonksiyonel aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Osteoblastlar yoluyla kemik oluşumu ve osteoklastlar yoluyla rezorpsiyon birkaç hafta ay sırasına göre kültür asyon süreleri gerektirir. MC3T3-E1 ön osteoblastlarından kemik oluşumu alizarin kırmızısı ve von Kossa lekeleri kullanılarak ölçüldü11,15. 49. günde alizarin kırmızısı ile boyanmış ortalama yüzey alanı .7 ± %2....

Burada, bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kemik remodeling analiz için protokoller sıyoruz. Bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı hücresel matris deforme ederek osteosit mekanostransdüksiyon neden platform ile eşleştirilmiş olabilir. Platform aynı zamanda osteoklastlar ve osteoblastlar (rezorpsiyon / oluşumu) kemik remodeling fonksiyonel sonuçları ölçmek için kullanılabilir.

Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Burada, kemik hücrelerinin uyarlanabilir bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kültüre için protokoller sıyoruz. Bu teknikler, mekanik kaynaklı kemik remodeling düzenleyen mekanizmaları anlayışımızı daha da anlamak için kullanılabilir. Sistemimiz, kemik hücrelerinin uzun süreli birliş yapmasına olanak sağlar, bu da değiştirilmiş mekanik yükleme ortamlarına yanıt olarak kemik oluşumunun ve rezorpsiyonunun doğrudan ölçülmesini sağlar.Bu temel tekniklerin kullanımı osteoporoz, kırık iyileşmesi ve periprotez osteoliz gibi kemikle ilgili bir dizi soruna kadar uzanan keşiflere yol açabilir. Kuyu ve mikrokanal tabakası oluşturmak için, PDMS prepolimer ve kür ajan 10 plastik bir fincan bir oranda birleştirmek ve şiddetle karıştırın, sonra 30 dakika boyunca polimer degas. Yavaş yavaş uygun önceden tesviye maske üzerine karışımı dökün.30 dakika oturup 45 derecede 18 saat pişirin. Konik bir laboratuvar spatulası ile PDMS'nin kenarlarını gevşetin ve maskeden dikkatlice soyun, sonra neşter ve 3D baskılı şablonla tek tek talaşları kesip ambalaj bandıyla temizleyin. PDMS membran tabakasını yapmak için, PDMS'yi karıştırma, dökme ve pişirme için önceki adımları tekrarlayın.PDMS sayfasını tesviye kutusundan çıkarın ve kuyu ve mikrokanal tabakasının boyutlarıyla eşleşen tek tek membranları kesin. Merkezdeki membran kalınlığını ölçmek ve istenilen kalınlığın dışında kalan membranları atmak için kaliperler kullanın, ardından membranları ambalaj bandı yla dikkatlice temizleyin ve bir parça parafin filminin üzerine yerleştirin. PDMS kapak katmanı yapmak için, PDMS karıştırma, dökme ve pişirme için önceki adımları tekrarlayın.Tek tek kapakları boyuta kestikten sonra, pdms üzerinden erişim deliklerini bir milimetrelik biyopsi zımbasıyla delin ve ardından ambalaj bandı ile yüzeyden temizleyin. Orta radyo frekansı güç ayarında bir plazma temizleyicisi ile birinci ve ikinci katmanların yüzeylerini etkinleştirin, ardından birinci katmandaki erişim deliklerini ikinci katmandaki mikrokanallarla hizalayın ve iki katmanı sıkıca birbirine bastırın. Derin kuyu tasarımı için, plazma tedavisi sırasında üçüncü tabakanın parafin filmini düz bir yüzeye takmak için çift taraflı bant kullanarak iki ve üç katmanla bu işlemi tekrarlayın.PDMS membranından fazla malzemeyi kırpın ve çipin altından parafin film tabakasını dikkatlice soyun. PDMS katmanları arasındaki bağ gücünü artırmak için çipi 65 derecede 10 dakika pişirin, ardından kapaktaki erişim deliklerine açı dağıtma ipuçları yerleştirin ve her ucun etrafına epoksi uygulamak için bir mikropipet ucu kullanarak iki parçalı epoksi ile sabitleyin. Epoksi tamamen iyileştikten sonra, yüzey% 70 etanol ile çip temiz ve bir biyogüvenlik kabine aktarın.Steril silikon boru ile dağıtım uçlarına beş mililitrelik şırınga bağlayın ve en az 30 saniye boyunca tüm çipi %70 etanolle doldurun. Etanol'ü çipten çıkarın ve bir gecede UV ışığıyla sterilize edin. Ertesi gün, talaşı üç kez distile suyla yıkayın, suyla doldurun ve boruyu dağıtım uçlarından çıkarın.Çipi en az 48 saat 37 derecede kuluçkaya yatırın. Plakanın şaftına bir sıkıştırma yay yerleştirin ve tabanın altındaki merkezi deliğe yerleştirin, ardından kadran bloğunu dört kendinden dokunan vidayla tabanın dibine takın. Merkezi vidanın etrafına ikinci bir sıkıştırma yay yerleştirin.Vidayı kadranaltındaki altıgen şekilli deliğe yerleştirin ve tertibatı kadran bloğunun ortasındaki dişli deliğe vidalayın. Üssün dibine dört erkek-kadın soğukluğu vidalayın. Plakanın üst kısmı tabanın üst kısmı altına gelene kadar kadranı saat yönünün tersine çevirerek cihazdaki bolluğu çıkarın ve plakanın üst kısmı tabanın üstüyle aynı seviyeye gelene kadar çevirmeyi saat yönünde yavaşça çevirin.Bir saat boyunca asetik asit tip I kollajen 200 mikrolitre ile derin kuyu çip ve kat kuyunun alt su kaldırmak için beş mililitreşli şırınga kullanın. DPBS kullanarak talaşı üç kez kalsiyum ve magnezyumla durulayın ve talaş tutucuya yerleştirin. Buzağı serumu, FBS ve penisilin/streptomisin ile takviye edilmiş MEM alfa ortamda MLO-Y4 osteositli çipi tohumla.Boruları dağıtım uçlarından çıkarın, çipi derin bir kültür yemeğine yerleştirin ve hücreleri 37 santigrat derecede ve yüzde 5 karbondioksitle 72 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, dağıtım ipuçlarına steril borular takın ve harcanan kültür ortamını çipten çıkarmak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın, ardından çipi yavaşça taze ortamla doldurun. Talaş tutucuyu yükleme cihazı tabanının üstüne dikdörtgen insetiçine yerleştirin, tüpü kapakta bulunan yuvalardan besleyin ve kapağı tabanına sabitleyin.İstenilen plaka deplasmanına ulaşılıncaya kadar kadranı saat yönünde çevirerek hücrelere yük uygulayın, ardından yükleme cihazını boş bir P1000 mikropipet ucu kutusuna yerleştirin ve hücreleri 15 dakika boyunca yükletin. Kuluçkadan sonra, kadranı saat yönünün tersine orijinal başlangıç konumuna çevirerek hücrelerden yükü çıkarın, ardından kapağı cihazdan çıkarın, talaş tutucuyu derin kuyukültür plakasına yerleştirin ve hücreleri 90 dakikalık bir yük sonrası kurtarma süresi için kuluçkaya yatırın. Koşullu ortayı çipten çıkarmak ve çip tutucudan çıkarmak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın, ardından PDMS kapağı ile kuyu tabakası arasındaki bağı kırmak için konik bir spatula kullanın.Hücreler analiz edilmeye hazır. Sığ-iyi yapılandırma osteoblastlar ve osteoklastların fonksiyonel aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Preosteoblastlardan kemik oluşumu alizarin kırmızısı ve von Kossa lekeleri kullanılarak ölçüldü.Osteoklastlardan kemik rezorpsiyonu toluidin maviboyama ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak rezorpsiyon çukurlarının varlığını doğrulamak için ölçüldü. Derin-iyi yonga yapılandırması düzlem distansiyon bir statik yoluyla hücreleri germe tarafından osteosit mechanotransdüksiyon indüklemek için kullanılmıştır. Cips tohumu osteosit görüntüleri distile su ile çipin 48 saatlik kuluçka tipik morfolojihücre canlılığını korumak için kritik olduğunu göstermektedir.Yükleme nöbetleri sırasında, osteositler PDMS membranında indüklenen bir gerinim gradyanına maruz kaldılar. Bir ile iki milimetre arasındaki değerler için ortalama eşdeğer gerinim ile plaka yer değiştirmesi arasındaki ilişki belirlendi ve indüklenen suşun temsili bir ısı haritası oluşturuldu. Yüklemenin ardından laktat dehidrogenaz boyama, ek V ve ölü hücre analizi ile hücre canlılığı analiz edildi.Gerilmiş osteositlerin laktat dehidrogenaz lekesi kuyunun dış kenarına yakın daha açık bir lekelenme gösterdi, bu da yüksek gerinim değerlerinin bulunduğu yere karşılık geliyor. Platformumuz çok yönlülük yüksek derecede sağlar ve yük kaynaklı mekanotransdüksiyon, inflamasyon ve ilaç etkileri gibi kemik remodeling düzenleyen çeşitli faktörlerin araştırmak için kullanılabilir. Burada sunulan teknikler büyük ölçüde kemik sağlığını düzenleyen çok hücreli incelikleri anlayışımızı artırabilir bir çip üzerinde gerçek bir kemik organı geliştirmek için bir temel sağlar.

a-lab-on-chip-platform-for-stimulating-osteocyte-mechanotransduction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokolde, teknolojinin dayandığı dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat, ve nasıl bu temel teknoloji, yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü, hem de iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yapmak için değiştirilebilir göstermektedir paradigmalar.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Öncü hücrelerin osteoklastlara farklılaşması sitokinler ve büyüme faktörleri tarafından düzenlenir. Burada, osteoklastların in vivo olarak farklılaşması için yeni bir gen transfer tekniği ve sitokinlerin osteoklastogenez üzerindeki etkilerini incelemek için bir yöntem olarak öncü hücrelerin in vitro osteoklastlara farklılaşması için hücre kültürü protokolleri açıklanmaktadır.

Bir Roman In vivo Gen Transferi Tekniği ve In vitro Hücre Tabanlı Tahliller

Biz hücre ölümü yaralanma/olduğu gibi fare eklemlerin eklem yüzeyinde kayma ölçüde kontrollü mekanik yükler veya etkileri uygulamadan sonra değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, osteoartrit, genetik faktörler ve/veya farklı yükleme rejimleri içinde situ kondrosit güvenlik açığı nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir.

Gerçek zamanlı görselleştirme ve analiz nedeniyle tam olarak olduğu gibi fare kıkırdak Explants mekanik yükleme kondrosit yaralanma

Bu makalede, kondrosit sıkıştırma için pnömatik olarak mikroakışkan bir cihaz imal etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı yöntemler sağlanmıştır.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

İnsan diz eklemindeki kıkırdak, kemik, yağ yastığı ve sinovyumu özetlemek için kullanılan insan mezenkimal kök hücrelerinden dört tip doku üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu dört doku özelleştirilmiş bir biyoreaktöre entegre edilir ve mikroakışkanlar yoluyla bağlanır, böylece çip üzerinde bir diz eklemi oluşturur.

Eklem hastalıklarını modellemek ve ilaçları test etmek için çip üzerinde diz eklemi oluşturulması

Bu makale, fare üçüncü metatarsalının doku düzeyinde mekanik yüklenmesine yanıt olarak gömülü osteositlerin mekanik olarak indüklenen kalsiyum sinyalini in vivo gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için intravital bir görüntüleme yaklaşımının gerçekleştirilmesini açıklamaktadır.

Fare Osteositlerinde Yüke Bağlı Kalsiyum Sinyal Dinamiklerini İncelemek için Floresan İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Burada, insan kemik iliğinin in vivo yapısının karmaşıklığını yansıtan, çok çeşitli normal ve patolojik olayları ince bir şekilde incelemek için uygun bir model sağlayan, uygulaması kolay, standartlaştırılmış, mikrofizyolojik bir sistemi tanımlıyoruz.

Fizyolojik veya Tümöral Bağlamlarda Yerleşik Hücreler Arasındaki Dinamiği ve Etkileşimleri Araştırmak için Bir İnsan Kemik İliği 3D Modeli

Önerilen protokol, multimodal analizler kullanarak kemik rejenerasyonu bağlamında kemik oluşumunu değerlendirmek için küresel bir yaklaşım gerektirmektedir. Yeni kemik oluşumu hakkında kalitatif ve kantitatif bilgi sağlamayı, temel ve klinik öncesi araştırmaların titizliğini ve geçerliliğini artırmayı amaçlar.

Ex Vivo Modelde Doku Mineralizasyonunun Kapsamlı Karakterizasyonu

Kemik yenilenmesini çeşitli hiyerarşik seviyelerde değerlendirmek için bir protokol öneriyoruz. Bu çok modlu yaklaşım, farklı uzunluk ölçeklerinde yapısal analizlere olanak tanır ve örnek hazırlığındaki zorlukları etkili bir şekilde ele alır. Ayrıca, biyomalzemelerin kemik yenilenmesini teşvik etmedeki etkinliğini değerlendirmek için güvenilir bir iş akışı sağlar.

Kemik Yenilenmesi ve İskelet Performansını Değerlendirmek İçin Multimodal Yaklaşım

Bu protokol, metakrilatlenmiş jelatin (GelMA) hidrojellerine gömülü insan osteositleri kullanılarak 3D kemik yapılarının üretilmesini ve decellularize ekstrasellüler matriks ile desteklenmesini açıklar. Yöntem düşük maliyetli, ölçeklenebilir ve temel laboratuvar ekipmanlarıyla uyumludur; bu da kas-iskelet hastalıkları süreçlerini incelemek için translasyonel bir platform sağlar.

Kas-iskelet hastalıklarının modellenmesi için insan osteositleri ve hücresizleştirilmiş ekstrasellüler matriks kullanan 3D kemik kültürü platformu

Keşfedin, lab-on-a-chip platformunda kemik hücreleri yetiştirme protokollerini kullanarak mekanik yüklemeye yanıt olarak kemik oluşumu ve rezorpsiyonunu nasıl nicelendirebilirsiniz.

Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu

Daha fazla video keşfet