Synchrotron Micro-CT için Yüksek Verimli Kortikal Kemik Örneği Alımı ve Analizi için Kesitleme, Coring ve Görüntü İşleme Kılavuzu

Sinkrotron mikrobilgisayarlı tomografi için kemik örneği alımı ile ilgili mevcut veriler seyrek kalmaktadır. Kapsamlı eğitimimiz, basit, minimum düzeyde yıkıcı ve uygun maliyetli bir metodoloji sağlar. Tutarlı boyutlara ve silindirik bir şekle sahip kemik örneklerinin tedarik edilmesi, elde edilen veri setlerinin en yüksek kalitede olmasını ve sonuçların uygulanabilir olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir.

Bu el yazmasında açıklanan teknikler, kayaların, fosillerin veya herhangi bir sert malzemenin karotunu almak için geçerlidir. Bunları, Dünya'nın kabuğunun ve üst mantosunun reolojisini keşfetmek için yüksek basınçlı deneyler için eşit büyüklükte kaya çekirdekleri ve tek kristaller toplamak için kullandık. Acemi karotlar, kemik örneğinin konik şekiller oluşturduğunu bulabilirler.

Bu, kemik tozunun matkap ucundan akması için yeterli ve yeterli zaman tanıyarak ve karot alma hızını yavaşlatarak ele alınabilir. Sinkrotron mikro bilgisayarlı tomografi için kemik örneği alımını gösteren ve mantıksal analiz olan talimat metinleri ve videoları eksiktir. Adım adım kemik hazırlama eğitimimiz bu boşluğu doldurmaya yardımcı olur.

140 santigrat dereceye kadar sıcak plakalara 75 x 25 milimetrelik bir cam mikroskop lamı yerleştirin ve slaydın ortasına bol miktarda termal epoksi reçine eritin. Kemik bloğunun alt yönünü, kemiğin uzunluğu slayda dik olacak şekilde mikroskop lamı üzerindeki termal epoksi reçineye bastırın. Kemiğin alt tarafını kaplamak ve güvenli bir yapışma sağlamak için numuneyi ileri geri kaydırın.

Termal epoksinin gözeneklere ve çatlaklara girmesine izin vermek için monte edilen numuneyi yaklaşık beş dakika sıcak plaka üzerinde dinlendirin ve slayt üzerindeki epoksinin kabarcık içermediğinden emin olun. Kabarcıklar varsa, bunları çıkarmak için numuneyi ileri geri kaydırın. Monte edilmiş numunenin bulunduğu sürgüyü sıcak plakadan çıkarmak için künt forseps kullanın ve oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika soğumaya bırakın, ardından aynanın sürgünü yeterince kavradığından emin olmak için sürgünün kenarındaki epoksiyi bir tıraş bıçağıyla çıkarın.

Yapıştırılmış numune ile sürgüyü bir cam kayar aynaya takın ve aynayı yavaş hızlı bir kesit testeresinin döner koluna monte edin, böylece kemiğin bir kesiti uzunluğuna dik olarak kesilebilecek şekilde konumlandırın. Bıçağın numuneye temas ettiğinden ve onu geçtiğinden emin olmak için döner kolu ayarlayın. Kolun ağırlığına karşı koymak için kesme kolunun uzak tarafına ağırlık ekleyin ve sıvı kabına damıtılmış su ve kesme sıvısı ekleyin.

Elmas gofret bıçağını sıkıca sabitleyin ve sıvı seviyesinin bıçağın kesme kısmını suya batırdığından emin olun. Hızı 200 RPM'ye ayarlayın ve numuneyi yavaşça bıçağın üzerine indirin. Testere bölümlere ayırmaya başladığında, bıçağın ve aynanın sallanmadığından veya zıplamadığından emin olun.

Eğer öyleyse, testereyi hemen durdurun ve bıçak veya ayna kolu tertibatını sıkın. Mandren agresif bir şekilde yukarı ve aşağı hareket ediyorsa, daha fazla karşı ağırlık ekleyin. İlk kalın bölüm, her ek kesime paralel olarak iyi tanımlanmış bir yüzey sağlayacak bir atık kesimidir.

İlk atık kesiminden sonra, döner kolu kaldırın ve konumlandırma kadranını kullanarak aynayı bıçağa doğru beş milimetre hareket ettirin. Kesitleme tamamlandıktan sonra, termal epoksiyi eritmek için monte edilmiş numuneyle birlikte cam sürgüyü sıcak bir plaka üzerine yerleştirin. Daha önce açıklanan termal epoksi yapıştırma tekniğini kullanarak sığ bir alüminyum kalayın dibine beş milimetrelik kemik bölümleri monte edin.

Tenekeyi değirmen matkabının XY makine tablasına yerleştirin ve sabitleme kelepçelerini elle sıkın. İki milimetre iç çaplı içi boş şaft kuyumcuları elmas uçlu karot matkap ucunu değirmen matkap mandrenine yerleştirin ve tenekeden karot almayı önlemek için derinlik sınırlayıcıyı ayarlayın. Kemik numunesinin merkezi ön yönünü, periost ve ostium veya yüksek derecede trabekülarize alanlarla yakın temastan kaçınarak matkap ucunun altına hizalayın.

Numuneyi tamamen kaplamak için tenekeyi damıtılmış suyla doldurun, bu da ısı birikmesini, numunenin yanmasını ve karot alma sırasında matkap ucunun hasar görmesini önler. Uygun güvenlik önlemleri alınmazsa değirmen matkap presi tehlikeli olabilir. Operatörler koruyucu gözlük taktıklarından, bol giysilerin sabitlendiğinden ve uzun saçların mile takılmaması için geri çekildiğinden emin olmalıdır.

Çekirdek ucu ile kemik arasındaki ilk birkaç temas durumunda, kemiğin üst yüzeyine bir halka takmak için hafif bir baskı uygulayın. Bu, karot alma işleminin başlangıcında matkap ucunun sapmasını önler ve ucun doğru şekilde yerleştirilmesini sağlar. Karot alma sırasında, ucun ucunu su yüzeyinin altında tutarken matkap ucunu numunenin içine ve dışına kaldırın.

Sıkışan kemik tozunu temizlemek ve pisliklerin matkap ucunu tıkamadığından emin olmak için bunu birkaç saniyede bir yapın. Karot alma işlemi tamamlandıktan sonra, ortaya çıkan kemik çekirdeği içi boş gövdeli matkap ucuna sıkışabilir. Çekirdeği uçtan çıkarmak için bir çift ince uçlu forseps veya küçük bir Alyan anahtarı kullanın.

Özlü numuneyi, görüntülemeye kadar serin ve kuru bir yerde etiketli bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın. Açıklanan çekirdek örnekleme yönteminin oldukça etkili ve verimli olduğu kanıtlanmıştır. Karotlu bir numunenin görüntü işleme iş akışını ve bir döner alet kullanılarak elde edilen bir numunenin görüntü işleme iş akışını karşılaştıran temsili rakamlar burada gösterilmektedir.

Ortak döner alet kullanılarak kesilen numune, özlü numuneye kıyasla artan sayıda kanal ve lakuna ve azalmış ortalama kanal çapı, kanal hacmi ve kortikal gözeneklilik sergiledi. Bu tablo, her numune için gözeneklilik verilerini gösterir. Karot protokolü, senkrotron mikrobilgisayarlı tomografi taramalarında gözlenen artefaktları azaltsa da, doğrusal kemik bloğu deneylerinden elde edilen düşük kaliteli artefakt yüklü rakamlar çok yönlü bir sorunu temsil etmektedir.

Daha sonraki görüntü işleme, tekniğin kortikal kemik mikro mimarisinin görselleştirilmesini iyileştirme potansiyelini doğruladı. Örneğin, mineralizasyon farklılıkları, osteonal sınırların daha iyi tanımlanması ve vasküler kanallar içindeki yumuşak dokuların tutarlı bir şekilde görselleştirilmesi gözlenmiştir. Yavaş ilerlemek, tutarlı boyutta silindirik numuneler elde etmenin anahtarıdır.

Çok hızlı gitmek, numunelerin silindirik yerine koni şeklinde olmasına neden olabilir. Karot almak için kalın kesitler temin edilirken, Brightfield veya konfokal mikroskopi için daha kalın kesitler toplanabilir. Bu, kanal ağının görselleştirilmesine izin verir.