Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

Bu bireysel insan ses modeli nanomalzemeler ve bilgi ilaçları da dahil olmak üzere maddelerin akut bağışıklık yanıtı tahmin etmek için güçlü bir araç olarak ilgili bağışıklık hücreleri kullanır. Bu tıbbi bu özel reaksiyonları değerlendirmek için insan epitel hücreleri ve insan birincil bağışıklık hücreleri birleştirir. Taze ve dondurulmuş monositlerin kullanımı deney planı için esneklik sağlar.

Çok sayıda çalışma, bu modelin bir davranış duygusu ve bağışıklık duygusu arasındaki yıldızlararası iletişim içine bir fikir sağlayabilir göstermiştir. Bu gösteri, modeli hücre kültüründe kişisel bir özellik, denemeleri çoğaltmak için görsel talimatlar çivileme için tüm önemli ayrıntıları içerir. Mesane protokolünde birkaç adım karmaşık ve özel kullanım gerektirir.

Bu nedenle kolayca takip edilebilen tüm gerekli ayrıntılarla gösterilirler. Insan Buffy kat periferik kan monositizolasyon için, 250 mililitre konik tüpler arasında eşit hasat Buffy ceket çanta içeriğini bölünmüş. Dikkatle PBS ile her tüp 250 mililitre toplam hacmi getirmek ve üç nazik inversions ile tüpler karıştırın.

Sonra dört yeni 50 mililitre tüpler arasında eşit Buffy kat PBS çözüm bölünmüş, sonra CD 14 pozitif manyetik boncuklar 10 mikrolitre tüp yedinci toplam hücreleri ekleyin ve pipetleme tarafından iyice karıştırın. Doldurduktan sonra pipeti pipetten ayırın ve pipetin üst açıklığı hemen bir başparmakla takılır ve dolu pipeti bir tüpün altına yerleştirin ve yoğunluk gradyan ortamının boru nun altından yavaşça akmasını sağlamak için pipet infilakını çekin, tabuketin içinde bir mililitre yoğunluk gradyan ortamı kalana kadar. Yoğunluk gradyan orta aynı şekilde her tüp eklendiğinde yoğunluk gradyan santrifüj ile hücreleri ayırmak ve plazma ve yoğunluk gradyan orta katmanları arasında beyaz 2-3 milimetre kalınlığında periferik kan mononükleer hücre tabakası toplamak için serolojik bir pipet kullanın.

Katmanı bağlamanın en iyi yolu önce plazmayı çıkarmak ve sonra da hücreleri toplamak için mantıksal pipetlerimizi bastırmaktır. Periferik kan mononükleer hücrelerini iki tüpten her bir tüpten yeni bir 50 mililitrelik tüpe çekin ve hücreleri yıkama başına toplam 50 mililitre taze PBS hacmiyle iki kez yıkayın. Sonra supernatant atın ve taze PBS beş mililitre her pipet resuspend ve sayma için tek bir tüp içine hücre süspansiyonları havuz.

Sayma sonra, hücreleri tekrar santrifüj ve yedinci hücrelere katılmak başına manyetik ayırma tampon 80 mililitre pelette resuspend. Sonra cd 14 pozitif manyetik boncuk başına 10 mikrolitre ekleyin tüp için yedinci toplam hücreleri katılmak ve pipetleme tarafından iyice karıştırın. Dört santigrat derecede 15 dakikalık bir kuluçkadan sonra üç mililitre manyetik ayırma tamponuyla manyetik bir kolon durulayın ve hücreleri kolona ekleyin.

Sütunu yıkama başına üç mililitrelik tampon hacmiyle üç kez yıkayın ve kolonu bir mililitre taze manyetik ayırma tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Sonra tüp içine CD 14 pozitif hücreleri floş için dalgıç ve tampon beş mililitre kullanın. Manyetik boncuk izole CD 14 pozitif hücrelerin farklılaşması nı neden musunuz.

İlk olarak, bir kez hücre kültürü ortamda mililitre konsantrasyonu başına altı hücre katılmak hücreleri bir kez resuspend. Veya MDDC farklılaşma, ve tüp granula site makrofaj koloni uyarıcı faktör başına 10 nanogram ekleyin ve altı iyi hücre kültür plaka her kuyuya hücrelerin üç mililitre eklemek, ya da MDM farklılaşma hücreleri ve plaka hücreleri için makrofaj koloni uyarıcı faktör mililitre başına 10 nanogram ekleyin ve sadece gösterildiği gibi hücreleri plaka. Bir insan alveolar epitel hücre dokusu üçlü hücre li-kültür modeli kurmak için, ilk transfer 1.5 pre-sıcak hücre kültürü orta 12 kuyu plaka Wells uygun sayıda ve her kuyu içine bir hücre kültürü eklemek yerleştirin.

Sonraki her kesici uç apikal tarafına mililitre başına beşinci hücrelere beş kat 10 yoğunlukta epitel hücre süspansiyon 500 mikrolitre ekleyin ve hücre kültürü kuluçka dört günlük kuluçka için plaka kapağı. Veya MDDC tohumlama, MDDC farklılaşması için kullanılan altı kuyu plakasının Wells'inden süpernatant'ın yerini alır, bir mililitre taze sıcak hücre kültürü ortamı ile ve her kuyudaki yapışma hücrelerini ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanır. Her kuyuyu üç kez supernate ile ve her kuyuda yıkayın ve tüm hücre çözümlerini tek bir santrifüj tüpünde birleştirin.

Santrifüj ve steril cımbız ile hasat MDDC steril petri çanak baş aşağı 12 kuyu plakaları ekler yerleştirmek için. Kesici uç basal tarafında herhangi bir epitel hücreleri kazıyın ve taze hücre kültürü orta MdDCs resuspend mililitre başına bu hücrelerin 4.2 kat 10 konsantrasyon yapmak. Daha sonra her kesici uç üzerine 150 mikrolitre hücre ekleyin, böylece sınamanın tüm bazal yüzeyi kabarcıklar olmadan sıvı ile eşit olarak kaplanır.

MDDM'ler için gösterildiği gibi farklılaştırılmış MDDM'ler hasat edildikten sonra MDDM tohumlama için, hücreleri taze hücre kültürü orta konsantrasyonunun mililitrebaşına dört hücreye 2,5 kat 10'a seyreltin ve her epitel hücresinin duvarına 500 mikrolitre hücre ekleyin ve hücre kültürü eklemeyi içeren MDDC'nin duvarına ekleyin, sonra kapağı tabağa yerleştirin ve plakayı 24 saat boyunca bir hücre kültürüne yerleştirin. Ertesi gün her hücre kültürü eklemek ve Wells hem apikal ve bazal alanlardan supernatant aspire. Sonra Wells ekler kaldırmak ve her kuyuya hücre kültürü orta taze prewarm 600 mikrolitre eklemek için cımbız sterilize.

Altı günlük farklılaşmadan sonra, MDM'ler şekil olarak yuvarlak görünürken, MDDC'ler daha uzun bir şekil ve gözlemlenebilir çıkıntılara sahip hücrelerden oluşan kümeler oluşturur. Membran uçlarında üç günlük büyümeden sonra epitel hücreleri yoğun bir laktat dehidrogenaz salınımında belirgin bir artış oluşturur Bazal kompartmanın hücre kültür ortamında membran rüptürü için pozitif bir kontrole maruz kalındığında, modelin sitotoksik bir maddeye duyarlılığını kanıtlamaktadır. TNF alfa veya LPS ile apikal stimülasyon ile ölçülen laktat dehidrogenaz salınımında artış yoktur.

Il6 ve IL8 salınımında istatistiksel olarak anlamlı artışlar hem LPS hem de TNF alfa tedavi örneklerinde tedavi edilmeyen hücreleri kontrol etmeye göre gözlenmiştir. LpS ve TNF alfa maruzko-kültürde çözülmüş hücreleri kullananlara göre taze periferik kan monositlerinden MDDM ve MdD'ler kullanılarak ko-kültür modelleri arasında hücre morfolojisinde fark gözlenmemiş, bozulmuş epitel tabakası gözlenmiştir. Hava yolu veya bronşiyolar hücreler gibi insan hücrelerinin diğer türleri kullanmak mümkündür, diğer uç noktaları da analiz edilebilir.

Esas olarak araştırmacılar kurmak için benzer ama farklı hücre tipleri ile bu teknik esinlenilmiştir.